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Conférence 15 : Le cytosquelette et les protéines motrices - Biologie

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Conférence 15 : Le cytosquelette et les protéines motrices

Protéines motrices du cytosquelette eucaryote

La motilité est une caractéristique de la vie. Même les cellules incapables de se déplacer activement dans leur environnement exécutent des processus essentiels de motilité intracellulaire. Un certain nombre de mécanismes ont évolué pour générer les forces mécaniques nécessaires à la motilité biologique. Un mécanisme particulièrement efficace et omniprésent de production de force biologique utilise des enzymes mécanochimiques, ou «protéines motrices». Ces enzymes convertissent l'énergie chimique, généralement sous la forme d'adénosine triphosphate (ATP), en force mécanique.

De nombreux mouvements, à la fois cellulaires et subcellulaires, des cellules eucaryotes sont générés par les activités de protéines motrices qui agissent sur les fibres cytosquelettiques rigides. Trois superfamilles de protéines motrices du cytosquelette ont été reconnues. Les moteurs de la superfamille de la myosine agissent sur les filaments d'actine pour générer des contractions de la surface cellulaire et d'autres changements morphologiques, la motilité des vésicules, le flux cytoplasmique et la contraction des cellules musculaires. Les membres des superfamilles motrices à base de microtubules de dynéine et de kinésine déplacent les vésicules et les organites à l'intérieur des cellules, provoquent le battement des flagelles et des cils et agissent dans les fuseaux mitotiques et méiotiques pour séparer les chromosomes répliqués en cellules descendantes. Les membres de chaque superfamille motrice peuvent être reconnus par la présence d'une séquence d'acides aminés unique et conservée qui forme le domaine de liaison à l'ATP et de production de force de la molécule. Ces « domaines moteurs » conservés sont liés à un ensemble diversifié de séquences polypeptidiques qui confèrent vraisemblablement une spécificité fonctionnelle aux divers moteurs. Chacune de ces superfamilles est peuplée de nombreux membres distincts qui remplissent des rôles cellulaires différents. Ces dernières années, les techniques de génétique moléculaire ont révélé de nouvelles protéines motrices plus rapidement que notre capacité à déterminer leurs fonctions. Les exposés de cette session de la réunion German-American Frontiers of Science ont porté sur les rôles cellulaires de certaines de ces protéines motrices.


Protéines motrices

La gamme de produits Cytoskeleton Motor Werks™ (CMW) est exclusivement fabriquée et vendue par Cytoskeleton. Ces produits facilitent les progrès de la recherche et de la découverte de médicaments dans le domaine des protéines motrices (Funk et al. 2005). Nous nous concentrons sur la production de protéines de la famille des kinésines et myosines hautement pures et biologiquement actives d'origine eucaryote et fongique. Ces réactifs sont destinés à la découverte de médicaments antimitotiques et aux études mécanistiques de l'activité motrice. La gamme Cytoskeleton Motor Werks™ contient également plusieurs Biochem Kits™, des anticorps et d'autres réactifs liés au moteur (par exemple, un agent stabilisant des microtubules taxol, Cat. # TXD01) et des protéines (par exemple, des microtubules préformés, Cat. # MT002).

Pour plus d'informations sur les protéines motrices, veuillez cliquer sur le bouton Sur onglet ci-dessus.

Les protéines motrices de la kinésine eucaryote utilisent l'énergie de l'hydrolyse de l'ATP pour déplacer des cargaisons, telles que des chromosomes et des vésicules, le long des réseaux de microtubules cytosquelettiques [1]. Ils jouent un rôle majeur dans presque tous les aspects du transport intracellulaire et sont impliqués dans un large éventail de processus physiologiques, y compris le développement embryonnaire [2], le transport axonal [3] et la division cellulaire [4]. Le rôle essentiel de nombreuses kinésines dans la division cellulaire, et le fait que la surexpression des kinésines ait été liée à des cancers tels que les rétinoblastomes [5], en font des cibles très attractives pour le développement d'antimitotiques. L'observation que de nombreuses kinésines sont exprimées exclusivement au cours de la division cellulaire suggère également qu'elles pourraient être supérieures aux cibles médicamenteuses antimitotiques actuelles telles que les tubulines exprimées de manière ubiquitaire [6,7].

Structure générale des kinésines

La marque de fabrique de toutes les kinésines est la présence d'un

Domaine moteur de 340 acides aminés [8]. Ce domaine est divisé en deux grandes parties. La première partie est une région centrale catalytique composée d'un site de liaison à l'ATP, qui catalyse l'hydrolyse de l'ATP [9] et d'un site de liaison aux microtubules (MT), qui attache le moteur à sa piste MT [10]. La deuxième partie est un

Région du cou de 10 à 40 acides aminés qui contribuerait au mouvement moteur unidirectionnel [11]. Au-delà du domaine moteur globulaire, il existe une région en spirale -hélicoïdale, impliquée dans l'homo- et l'hétéro-oligomérisation des protéines, qui existent le plus souvent sous forme d'homodimères. Cette région est appelée la tige [8]. La tige sépare souvent le domaine moteur d'un second domaine globulaire appelé la queue. On pense que le domaine de queue est impliqué dans la liaison de la cargaison.

Classification Kinesin et diversité structurelle

Environ 150 kinésines ont été identifiées à ce jour dans des organismes allant des levures (S. cerevisiae contient six kinésines) et des champignons pour l'homme (actuellement 13 kinésines [12]). La classification est basée sur les homologies du domaine moteur, en particulier dans le cou et les régions adjacentes spécifiques à la classe [12]. Il est actuellement admis qu'il existe au moins neuf classes de kinésines [12,13,14]. Ceux-ci sont présentés dans le tableau 1. La nomenclature (indiquée en gras dans le tableau 1) est basée sur la position du domaine moteur dans la protéine kinésine, par conséquent les protéines N contiennent un domaine moteur à l'extrémité amino de la protéine tandis que C- et les moteurs M sont positionnés respectivement à l'extrémité carboxy-terminale et au milieu de la protéine [12].

Les kinésines recombinantes proposées par Cytoskeleton ont été conçues pour incorporer le domaine moteur, y compris la région du cou, ainsi que la majeure partie du domaine de la tige, ces constructions sont conçues pour créer une structure dimère normale bien que cela n'ait pas été testé par des tests de sédimentation. L'homologie du

La région motrice de 340 acides aminés au sein d'une classe donnée de kinésine peut varier entre 74 à 81 % d'identité dans la classe N-1 (les moteurs de transport de vésicules les plus conservés) à 46 à 50 % d'identité dans la classe C (la plus divergente) [13]. Le pourcentage d'identité entre les classes tombe à environ 35-40% [13]. Les comparaisons structurelles des données motrices disponibles ont révélé qu'il existe une variabilité conformationnelle significative entre les moteurs de différentes classes de kinésine et que les différences structurelles sont concentrées dans six domaines, dont la plupart sont fonctionnellement importants dans la liaison des microtubules ou dans la liaison du moteur central à la région de la tige. 9,11]. Compte tenu du pourcentage de variation relativement élevé entre les moteurs des différentes classes de kinésines, il est probable qu'il soit possible d'identifier des médicaments à base de kinésine spécifiques à une classe. Cette preuve structurelle est étayée par des données biochimiques qui ont démontré que différentes classes de kinésines de drosophile présentent une utilisation différentielle d'une variété d'analogues de l'ATP [15]. Ceci est assez impressionnant étant donné que la poche de liaison à l'ATP est l'une des régions les plus conservées du domaine moteur [9]. Ces expériences montrent que même au sein d'une espèce donnée, il existe des différences structurelles claires entre les classes de kinésines qui peuvent être exploitées à des fins de développement sélectif de médicaments. À cet égard, il est encourageant que nous ayons pu détecter une spécificité analogique entre les kinésines dans notre test HTS (voir le rapport de phase I). Nous sommes donc convaincus que nous serons en mesure de détecter des composés spécifiques à une classe qui seront potentiellement utiles comme médicaments anticancéreux.

Classe Kinésine*

Fonction cellulaire

Cible HTS représentative**

Données d'inhibition mitotique fonctionnelle

Les mutants BimC dans Aspergillus ont inhibé la séparation du corps polaire du fuseau et ont provoqué un phénotype mortel.

In vivo l'inhibition d'anticorps de HsEg5 par microinjection dans des cellules HeLa a provoqué l'arrêt de plus de 80 % des cellules en mitose. Ces résultats ont été confirmés en utilisant des mutants moteurs HsEg5 surexprimés.

Impliqué dans la division cellulaire probablement en se liant aux chromosomes et en les aidant à s'aligner sur la plaque métaphasique. (7 membres, 3 phylums)

In vivo antisens et in vitro des expériences d'inhibition d'anticorps et d'immunodéplétion ont démontré le rôle essentiel des chromokinésines dans l'organisation du fuseau et le positionnement des chromosomes. L'inhibition motrice a conduit au blocage mitotique et à la mort cellulaire dans les cellules de Xenopus. La dérégulation de la chromokinésine humaine a été liée au rétinoblastome

Impliqué dans la congression des chromosomes sur la plaque métaphasique et peut-être dans le mouvement des chromosomes à l'anaphase A

In vivo la surexpression d'une protéine CENP-E sans moteur dans une lignée cellulaire humaine a conduit à l'échec des chromosomes à s'aligner sur la plaque de métaphase et a entraîné un blocage mitotique. En outre, la microinjection d'anticorps CENP-E dans les cellules HeLa a également entraîné un blocage mitotique qui a duré entre 4 et 17 heures et a entraîné l'entrée de toutes les cellules en apoptose.

Impliqué dans l'anaphase B de la mitose et peut-être dans la cytokinèse.

Un mutant drosophile de la famille N-VI a démontré que ce moteur est essentiel à la cytokinèse.

Impliqué dans la formation du fuseau mitotique et méiotique, probablement en modulant la dynamique des microtubules. Certains membres peuvent être exclusivement des transporteurs de vésicules.

L'analyse mutationnelle chez les eucaryotes inférieurs (levure) a démontré que des mutants nuls dans cette classe de protéines conduisent à un blocage mitotique létal à G2/M.

Nécessaire à l'apparition du mouvement chromosomique de l'anaphase et de la dynamique des microtubules. Certains membres sont exclusivement des kinésines vésiculaires. (10 membres, 4 phyla)

L'inhibition d'une protéine M de mammifère par antisens a entraîné une perturbation de la ségrégation des chromosomes pendant l'anaphase. La surexpression d'une construction mutante sans moteur a également entraîné une perturbation de l'anaphase.

Transport organelle / vésicule

Transport des organelles/vésicules, en particulier les vésicules synaptiques et les mitochondries

Transport organelle/vésicule spécifiquement transport vésiculaire antérograde.

* Le système de classification en gras est tiré de Hirokawa [12]. Le système de classification entre parenthèses est souvent utilisé dans la littérature et est tiré de Moore et Endow [14].

** Un, Aspergillus nidulans: Hs, Homo sapiens: Dm, Drosophila melanogaster.

L'ombrage jaune/vert indique les classes de kinésines qui fonctionnent exclusivement dans la division cellulaire, l'ombrage jaune clair indique les classes contenant des kinésines qui fonctionnent dans la division cellulaire ou la mitose, la zone non ombrée indique les kinésines qui sont impliquées uniquement dans le transport des vésicules.

La recherche d'antifongiques potentiels nécessite que nous identifiions des variations structurelles au sein d'une classe de kinésines, comme indiqué ci-dessus, la région motrice est moins variable au sein d'une classe donnée de kinésines qu'entre les classes. À cet égard, il y a d'abord deux points à noter, notre principale cible fongique est la protéine BimC qui appartient à la classe la plus diversifiée de kinésines qui présentent environ 47% d'identité dans la région motrice (tout ce qui est inférieur à 60% d'identité est considéré comme acceptable pour la cible différentielle spécificité), deuxièmement, nous avons inclus la région de tige très variable dans nos cibles protéiques recombinantes (voir Méthodes expérimentales) qui offre une cible relativement spécifique à la protéine (<20 % d'identité) [13]. Fait important, il a été démontré que l'inhibition par les anticorps de la région de la tige inhibe in vivo fonction motrice [16].

Sélection de cibles de kinésine pour un test HTS

La fonction cellulaire des kinésines peut être divisée en deux grandes catégories : le transport et le positionnement des vésicules membraneuses et des organites, et la morphogenèse du fuseau mitotique et le mouvement des chromosomes [12]. Il n'est pas surprenant qu'une classe donnée de kinésines partage de nombreuses similitudes fonctionnelles. On peut voir dans le tableau 1 que quatre des neuf classes de moteurs de la kinésine sont exclusivement impliquées dans la division cellulaire (zone ombrée jaune/vert du tableau 1), deux classes (C- et M-) contiennent à la fois des transporteurs de vésicules et des moteurs mitotiques ( zone ombrée en jaune clair du tableau 1), et trois classes (NI, NIII et N-IV) fonctionnent exclusivement dans le transport des vésicules (zone non ombrée du tableau 1).

Nous avons sélectionné un homologue humain de chaque classe de kinésines [6,17,21,22,26,28,29,30,39] et deux kinésines fongiques de Aspergillus, un agent pathogène humain [34], comme base pour le test HTS (ceux-ci sont présentés dans le tableau 1). En criblant chaque protéine avec une bibliothèque de composés, il est possible de générer une base de données primaire qui permettra l'identification de composés qui ciblent sélectivement la classe de kinésine humaine spécifique à la division cellulaire (zone sombre du tableau 1) tout en n'ayant aucun effet sur les kinésines de transport des vésicules. De tels composés sont les plus susceptibles d'être des antimitotiques efficaces dans le traitement de maladies humaines telles que le cancer. De même, les composés réagissant spécifiquement avec le Aspergillus les kinésines peuvent être recherchées comme antifongiques potentiels.

Kinésines en tant que cibles antimitotiques valides

Avant de commencer un programme coûteux de découverte de médicaments, il faut évaluer de manière critique l'adéquation de la ou des protéines proposées pour répondre aux critères d'une cible médicamenteuse valide. La preuve que les kinésines constitueront d'excellentes cibles pour le développement de médicaments antimitotiques provient d'une gamme d'approches expérimentales, notamment l'analyse mutationnelle [40], les expériences d'inhibition d'anticorps [7,32] et l'inhibition antisens de l'activité de la kinésine [19]. Cet ensemble de preuves est résumé dans le tableau 1 où l'on peut voir que l'inhibition fonctionnelle d'une kinésine spécifique de la mitose donnée entraîne une inhibition de la division cellulaire. Par exemple, in vivo l'inhibition de HsEg5 par microinjection d'anticorps anti-Eg5 dans des cellules HeLa a provoqué l'arrêt de plus de 80 % des cellules en mitose. Ces résultats ont été confirmés en utilisant des mutants du domaine moteur HsEg5 surexprimés [7]. Dans une autre série d'expériences, in vivo la surexpression d'une protéine CENP-E sans moteur dans une lignée cellulaire humaine a conduit à l'échec des chromosomes à s'aligner sur la plaque métaphasique et a entraîné un bloc mitotique [22]. De plus, la microinjection d'anticorps CENP-E dans les cellules HeLa a également entraîné un blocage mitotique qui a duré entre 4 et 17 heures et a entraîné l'entrée de toutes les cellules en apoptose [22]. Comme ces deux protéines sont incluses dans notre test HTS, nous avons bon espoir que les composés dirigés contre ces moteurs seront thérapeutiquement pertinents. Fait intéressant, la kinésine de classe N-V (tableau 1) contient la protéine chromokinésine humaine qui a été liée au rétinoblastome [5]. Le fait que l'inhibition de l'antisens et des anticorps de la Xénope L'homologue de ce moteur conduit à un blocage mitotique et à la mort cellulaire [19] est une indication encourageante que des médicaments ciblés sur la chromokinésine humaine peuvent être thérapeutiquement utiles dans le traitement/prévention du rétinoblastome.

Chez les eucaryotes inférieurs, l'analyse mutationnelle a permis d'élucider le rôle des kinésines mitotiques. Souvent, des mutations dans une seule kinésine conduiront à un blocage mitotique et à un phénotype mortel. C'est le cas de la protéine AnBimC que nous avons sélectionnée comme cible antifongique [34]. Cependant, dans certains cas, une redondance fonctionnelle a été démontrée sous la forme de deux gènes hautement homologues remplissant la même fonction [41]. Dans ces cas, les deux gènes doivent être désactivés afin de produire le phénotype mitotique. Parmi les protéines spécifiques à la mitose que nous avons sélectionnées pour notre panel représentatif de kinésines, celles qui ont été inhibées in vivo (trois sur cinq, voir tableau 1) présentent un phénotype défini indiquant qu'ils ne présentent pas de redondance fonctionnelle, ou que leur homologue apparenté est également inhibé. Les deux autres, HsChromokinesin et HsMKLP1 peuvent présenter une redondance fonctionnelle in vivo et cette possibilité doit être prise en compte si les tests secondaires basés sur les cellules ne conduisent pas à un phénotype d'arrêt mitotique.

Il est important de noter que toutes les données disponibles suggèrent que les anticorps dirigés contre les kinésines mitotiques affectent spécifiquement le processus mitotique mais n'ont aucun effet sur les fonctions de transport des vésicules de kinésine [42]. En effet, l'inhibition d'une kinésine spécifique induit souvent un phénotype très spécifique du cycle cellulaire. Par exemple, l'inhibition de la région motrice dans la kinésine de classe M MCAK n'a eu aucun effet sur l'assemblage du fuseau mais a inhibé le mouvement des chromosomes [32]. Ces données suggèrent que des inhibiteurs spécifiques des moteurs de la kinésine inhiberont très spécifiquement le processus mitotique sans affecter d'autres fonctions cellulaires critiques.

Avantages possibles des cibles de kinésine par rapport aux cibles antimitotiques actuelles

La tubuline, protéine du fuseau des microtubules, est la cible principale des antimitotiques actuels tels que le taxol et la vinblastine [43,44]. Il est généralement admis que ces médicaments agissent en supprimant directement la dynamique des microtubules pendant la mitose [45,46]. La spécificité envers les cellules en division est favorisée en raison du fait que la dynamique des microtubules est beaucoup plus grande dans les cellules mitotiques que dans les cellules quiescentes. Le traitement médicamenteux entraîne un blocage mitotique pendant lequel les cellules entrent dans la voie apoptotique et meurent [47]. En raison de la nature de leur mécanisme d'action, tous les antimitotiques, y compris le taxol et la vinblastine, affecteront, dans une certaine mesure, les cellules mitotiques normales telles que celles présentes dans le thymus, les testicules, l'intestin grêle, le côlon et le placenta [48] . Cependant, les antitubulines souffrent également d'effets secondaires de neurotoxicité limitant la dose du fait que la tubuline est présente en grande quantité dans le tissu neuronal [49, 50].

Un avantage majeur des kinésines mitotiques en tant que cibles potentielles de médicaments antimitotiques est le fait que leur expression est souvent étroitement régulée pour coïncider avec l'événement mitotique. Par exemple, HsMCAK est exprimé uniquement dans les cellules en prolifération où l'expression s'est avérée étroitement régulée au niveau transcriptionnel [6] HsEg5 ne s'associe qu'aux microtubules pendant la mitose, il n'est pas associé in vivo avec les MT pendant l'interphase [7] les chromokinésines sont exprimées exclusivement dans les cellules en prolifération où ce sont des protéines à courte durée de vie, probablement régulées par un mécanisme de dégradation semblable à la cycline [51] Il a été démontré que CENP-E se lie aux kinétochores immédiatement après la décomposition nucléaire et reste entièrement lié jusqu'à l'anaphase B, où elle se relocalise sur le fuseau de l'anaphase B et est ensuite dégradée via une voie de type cycline [52]. La régulation stricte de l'expression de la kinésine mitotique prédit qu'il s'agira de cibles antimitotiques hautement spécifiques avec des effets secondaires minimaux limitant la dose.

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Les produits de protéines motrices du cytosquelette ont été cités des centaines de fois au cours des deux dernières décennies. Quelques-uns sélectionnés sont décrits ici, pour plus de citations sur des produits individuels, veuillez utiliser le Citations onglet sur chaque page de produit.

Kit Kinesin ELIPA Biochem (Cat. # BK060) - Test d'ATPase activé par les microtubules.

Borysov et al., 2011. Alzheimer A-beta perturbe le fuseau mitotique et inhibe directement les moteurs des microtubules mitotiques. Cycle cellulaire. 10, 1-14.

Domaine de la protéine motrice Eg5 (Cat. # EG01)

Borysov et al., 2011. Alzheimer A-beta perturbe le fuseau mitotique et inhibe directement les moteurs des microtubules mitotiques. Cycle cellulaire. 10, 1-14.

Phalloïdines fluorescentes Acti-stain, par ex. Phalloïdine (rhodamine, Cat. # PHDR1)

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Paclitaxel : 2 mM (Cat. # TXD01)

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Question 1 : Comment puis-je configurer un test de dépistage de drogue avec ma protéine kinésine ?

Réponse 1: Les protéines motrices de la kinésine utilisent des microtubules (MT) comme substrat pour orchestrer un large éventail d'événements cinétiques au sein d'une cellule. Il a été démontré qu'ils déplacent des cargaisons telles que des chromosomes et des vésicules le long des pistes MT. Les kinésines fonctionnent en utilisant l'énergie de l'ATP par hydrolyse, une activité qui est grandement améliorée en présence de MT. Pour cribler des médicaments qui modulent les interactions entre les protéines motrices et les MT, un test de kinésine ATPase activée par MT peut être utilisé comme test pour l'activité ATPase activée par MT des kinésines. Cytoskeleton a développé deux de ces tests, un point final et un cinétique, qui sont utiles pour la découverte et l'optimisation des modulateurs de la kinésine. Les deux tests mesurent les niveaux de phosphate inorganique (P i ) générés par l'activité de la kinésine adénosine triphosphatase (ATPase) activée par les microtubules. Ces deux kits de dosage biochimique de la kinésine ATPase (Cat. # BK053 et BK060) fournissent des protéines MT et de la chaîne lourde de la kinésine (KHC) ainsi que les tampons et réactifs nécessaires pour mesurer la production de Pi comme moyen de criblage de médicaments qui modulent la kinésine et/ou la fonction MT interactions. Ces kits sont utiles pour découvrir les inhibiteurs et activateurs de la kinésine (Cat. # BK053 et BK060) ainsi que pour déterminer Vmax et Kchat valeurs pour une protéine motrice kinésine (Cat. # BK060).

Question 2 : Quels kits sont disponibles pour caractériser une protéine motrice putative ?


Richard J. McKenney, Ph.D.

J'ai un intérêt de recherche de longue date pour le cytosquelette, et en particulier les protéines motrices qui utilisent le cytosquelette comme pistes pour le transport intracellulaire. J'ai eu la chance d'avoir une opportunité en recherche fondamentale au début de ma carrière de premier cycle, où j'ai travaillé sur les voies de signalisation liées au cancer. Ce travail m'a offert une première expérience précieuse en laboratoire et m'a confirmé que je voulais poursuivre une carrière dans la recherche. J'ai poursuivi des recherches supérieures axées sur la régulation mécanochimique de la dynéine cytoplasmique motrice des microtubules. À l'Université de Columbia, j'ai rejoint le laboratoire du Dr Richard Vallée, qui a découvert la protéine motrice cytoplasmique dynéine. Mon travail a été le premier à décrire comment deux protéines régulatrices, LIS1 et NudE, sont capables de moduler la sortie motrice de la dynéine, la transformant d'un moteur faible en un moteur persistant. Ce travail a combiné des approches biochimiques et biophysiques pour fournir des informations sur des questions de longue date dans les domaines de la dynéine et du développement cérébral, car LIS1 est le gène responsable de la lissencéphalie, une maladie neurodéveloppementale. J'ai ensuite déménagé au laboratoire du Dr Ron Vale à l'UCSF pour poursuivre mes études sur la dynéine en utilisant la microscopie avancée à molécule unique. Dans le laboratoire de Ron, j'ai apporté plusieurs contributions au domaine de la dynéine, notamment comment la dynéine organise les réseaux de microtubules, comment elle est activée et liée à la cargaison via le complexe de dynactine et les protéines adaptatrices, et comment son activité motrice est directement influencée par la modification post-traductionnelle de la piste des microtubules elle-même.

Recherche d'intérêts

Protéines motrices et cytosquelette

My lab is interested in the fascinating world of molecular movement. We study how cells internally organize using molecular motor proteins. In particular, we focus on the microtubule cytoskeleton and the motor proteins that use this filament system for transport (kinesins and dyneins). We are interested in allosteric regulation of motor protein movement, how motor activity is balanced and coordinated, and how dysfunction in motor activity leads to human diseases such as cancer and neurodegeneration. The lab combines advanced molecular biology, biochemistry and single-molecule TIRF microscopy to address these problems.

Grad Group Affiliations

Specialties / Focus

  • Biochimie
  • Biologie cellulaire
  • Cell Division and the Cytoskeleton
  • Neurobiologie

Honors and Awards

  • NIH Pathway to Independence Award (K99/R00 - NINDS)
  • NIGMS Maximizing Investigators' Research Award (MIRA) (R35)
  • March of Dimes Basil O'Connor Starter Scholar Award

Degrés

  • 2010 Ph.D. Pathology and Cell Biology Columbia University
  • 2002 B.S. Biology Xavier University

Publications:

Lam AJ, Rao L, Anazawa Y, Okada K, Chiba K, Dacy M, Niwa S, Gennerich A, Nowakowski DW, McKenney RJ. A highly conserved 310 helix within the kinesin motor domain is critical for kinesin function and human health. Avancées scientifiques. 2021 Apr 307(18):eabf1002. doi: 10.1126/sciadv.abf1002. PMID: 33931448.

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Wormser O, Levy Y, Bakhrat A, Bonaccorsi S, Graziadio L, Gatti M, AbuMadighem A, McKenney RJ, Okada K, El Riati S, Har-Vardi I, Huleihel M, Levitas E, Birk OS, Abdu U. Absence of SCAPER causes male infertility in humans and Drosophile by modulating microtubule dynamics during meiosis. J Med Genet. 2021 Apr58(4):254-263. doi: 10.1136/jmedgenet-2020-106946. Epub 2020 Jun 11. PMID: 32527956.

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Bodrug T, Wilson-Kubalek EM, Nithianantham S, Thompson AF, Alfieri A, Gaska I, Major J, Debs G, Inagaki S, Gutierrez P, Gheber L, McKenney RJ, Sindelar CV, Milligan R, Stumpff J, Rosenfeld SS, Forth ST, Al-Bassam J. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. Évie. 2020 Jan 209:e51131. doi: 10.7554/eLife.51131. PMID: 31958056 PMCID: PMC7015671.

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Week 11 - The Cytoskeleton

The cytoskeleton is a network of protein filaments. There are three types of filament – intermediate, microtubules, actin.

Microtubules are hollow tubes of protein, approximately 25nm in diameter. - They are dynamic structures, constantly growing and shrinking. - They are built from molecules of tubulin o Either alpha or beta tubulin - Dimers stack together to form protofilament, each microtubule has 13 protofilaments. - Microtubules have a structural polarity o Alpha subunits – minus end o Beta subunits – plus end - Microtubules will grow at the plus end.

Microtubules that are stained (negative staining) and viewed under a transmission electron microscope reveal the difference between assembling and disassembling of the microtubule. - Microtubules can rapidly assemble and disassemble this is demonstrated using inhibitors such as Colchicine. It binds to the free dimers to prevent assembly whereas Taxol will bind to prevent disassembly. - Both inhibitors are anti-cancer drugs which work by inhibiting cell division.

Assembly and disassembly are controlled by GTP hydrolysis: - Free tubulin dimers have tightly bound molecules of GTP. - After binding, GTP is hydrolysed to GDP. - GTP-dimers bind tighter than GDP-dimers. - Rapid addition of GTP-dimers produces a GTP-cap which stabilises the microtubule. Slow addition of GTP-dimers results in GDP-dimers are the growing tip. - The growing tip becomes unstable and disassembles.

If microtubules become capped, polarity is induced. This could result in preferential deposition of vesicles or membranes in this region, thereby bringing about asymmetric growth.

The role of a microtubule is: - Cell polarity - Cell division - Transport of materials - Cell movement

The centrosome is a primary microtubule organising centre (MTOC) found in animal cells. It is located near the nucleus during interphase.

It consists of two centrioles each is a short cylinder composed of 9 triplets of microtubules. - The centrioles are orientated at right angles to each other. - Surrounding the centrioles is a pericentriolar matrix which contains γ-tubulin. This has a lattice protein, pericentrin (a microtubule associated protein). - γ-tubulin acts as a nucleation centre for microtubule growth. The minus end attaches to γ-tubulin. - The microtubules grow from the centrosome to the periphery of the cell. An encounter with capping proteins stabilises microtubules. o An example of this is in a nerve axon, the minus end in a cell body and the plus end is in an axon terminal. This allows directional transport along microtubules.

Microtubules are used to accurately direct transport within a cell.

Motor proteins carry a range of cargoes along the microtubule – each motor protein travels in a single direction, powered by ATP hydrolysis.

There are two types of motor proteins: - Kinesins – move toward the plus end. - Dynenins – move toward the minus end.

  • The rate of polymerisation is controlled by the supply of monomers. o Actin binding proteins prevent monomers from binding until required.

Microvilli are projections on outer surfaces of cells e.g. intestinal epithelium. They help to increase the absorptive area.

Internal parallel array of actin filaments is held together by actin-bundling proteins.

They provide support in the cell cortex – a network of actin filaments underneath the plasma membrane produces a 3D network in the cytoplasm.

Cell movement is brought about by actin filaments e.g. Amibe.

There are 3 stages of cell movement: - Extension – a protrusion from the leading edge of the cell. - Adherence – the protrusion adheres to the surface using integrin protein. - Advance – tension in the cell cortex drags the cell forward.

Filopodia are 0.1 micrometres wide and 5-10 micrometres long, the plus end points towards the plasma membrane.

They act as protein nucleation sites for actin polymerisation on the membrane.

Lamellipodia – a sheet containing a dense meshwork of actin filaments with plus ends close to the plasma membrane.

Myosin is a motor protein which moves along actin filaments from the minus to plus end.

It is ATP powered the globular head has ATPase activity. Movement results from binding, detachment and re-binding sequences.


Voir la vidéo: MOOC côté cours: Le cytosquelette et les filaments intermédiaires (Janvier 2023).