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Fonction et caractérisation de poly(T) et (AT)

Fonction et caractérisation de poly(T) et (AT)


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Je suis tombé sur trois termes; "poly(T)45", "poly(A)45" et "(AT)15". Quelqu'un peut-il expliquer ce qu'ils sont? Je sais que le nombre fait référence à la longueur du brin, peut-être que poly-T est un brin de monomères de thymine et que ss(AT)15 fait référence à une base de 30 (dAdT). Je suppose que cela fait référence à un single qui ressemble à ceci; dAdT-dAdT-dAdT… répété 15 fois. Dans ce cas, quel est le d ?


Poly(T) est un oligonucléotide avec seulement des résidus thymine répétitifs. Ceux-ci sont généralement utilisés comme amorces dans la PCR par transcription inverse, car les ARNm eucaryotes matures ont une queue Poly (A) [adénosine] ajoutée en tant que modification post-transcriptionnelle afin de protéger contre la dégradation de l'ARNm. Vous verriez aussi parfois cela appelé un oligo dT. Il pourrait également être l'amorce de certains adaptateurs d'extrémité appairés utilisés dans le séquençage de nouvelle génération (NGS)

Le 45 indiquerait généralement le nombre de résidus dans l'oligonucléotide.

Poly (A) pourrait être une amorce pour un adaptateur d'extrémité apparié pour NGS, mais j'aurais besoin de voir le contexte d'où vous avez vu les termes pour être sûr.

d = Désoxyribonucléotide, c'est-à-dire que vous avez affaire à un oligonucléotide d'ADN (bien que la thymine soit aussi une indication). Techniquement, le d fait référence au carbone 2' sur le ribose ayant un hydrogène au lieu d'un hydroxyle qui lui est attaché, ce qui en fait un désoxyribose.

Sans le d, il s'agit d'un ribonucléotide, indiquant que vous regardez une molécule d'ARN et que le carbone 2' sur le ribose a un groupe hydroxyle.

Vous verrez parfois aussi ddN (N pour n'importe quelle base). Cela indique un didésoxynucléotide de terminaison de chaîne qui a un hydrogène sur les deux carbones 2' et 3' au lieu de groupes hydroxyle. La raison pour laquelle cette molécule se termine par une chaîne est parce que vous avez besoin de l'hydroxyle 3' pour se lier à un groupe phosphate 5' pour former une liaison phosphodiester, ce qui est nécessaire pour poursuivre l'allongement de la molécule d'acide nucléique.

Quant au ss(AT)15, je pense que vous avez raison de dire qu'il s'agit d'une répétition de 15 paires d'AT donc un oligonucléotide de 30 nucléotides. Bien qu'il ne soit pas dit dAdT, vous avez probablement raison de dire qu'il s'agit de désoxyribonucléotides car ils utilisent la thymine au lieu de l'uracile comme base.

Juste au cas où, le ss signifie simple brin, ce qui est souvent le cas pour les amorces oligonucléotidiques pour les réactions PCR.


Analyse du transcriptome RNA-seq unicellulaire d'ARN linéaires et circulaires dans des embryons préimplantatoires de souris

Les ARN circulaires (circRNAs) sont une nouvelle classe d'ARN non-codants non polyadénylés qui peuvent jouer un rôle important dans de nombreux processus biologiques. Ici, nous développons une méthode de séquençage d'ARN indépendant poly(A) unicellulaire (SUPeR-seq) pour séquencer les ARN polyadénylés et non polyadénylés de cellules individuelles. Cette méthode présente une sensibilité, une précision et une exactitude robustes. Nous découvrons 2891 circARN et 913 nouveaux transcrits linéaires dans des embryons préimplantatoires de souris et analysons plus en détail l'abondance des circARN tout au long du développement, la fonction des gènes enrichis et les caractéristiques de séquence des circARN. Notre travail est essentiel pour déchiffrer les mécanismes de régulation des circARN au cours du développement embryonnaire précoce des mammifères.


Journal international des macromolécules biologiques

Journal international des macromolécules biologiques est une revue internationale reconnue de recherche sur chimique et biologique aspects de tous macromolécules naturelles.Il présente les derniers résultats d'études sur la structure moléculaire et les propriétés des protéines, des glucides macromoléculaires, des glycoprotéines.

Journal international des macromolécules biologiques est une revue internationale reconnue de recherche sur chimique et biologique aspects de tous macromolécules naturelles.Il présente les derniers résultats d'études sur la structure moléculaire et les propriétés des protéines, des glucides macromoléculaires, des glycoprotéines, des protéoglycanes, des lignines, des poly-acides biologiques et des acides nucléiques. Ces découvertes doivent être nouvelles et inédites plutôt qu'une répétition de travaux publiés antérieurs ou analogues. Le champ d'application comprend les activités et interactions biologiques, les associations moléculaires, les modifications chimiques et biologiques et les propriétés fonctionnelles. Les articles sur les systèmes modèles connexes, les études de conformation structurelle, les développements théoriques et les nouvelles techniques analytiques sont également les bienvenus. Tous les articles doivent se concentrer principalement sur au moins un macromolécule biologique. Cette dénomination doit apparaître dans le titre, le résumé et le texte de l'article.


Résultats

MKRN1 interagit avec PABPC1 et d'autres RBP

Afin d'en savoir plus sur les fonctions potentielles, nous avons caractérisé le profil d'interaction protéique de MKRN1 dans les cellules HEK293T. À cette fin, nous avons utilisé une purification par affinité (AP) couplée à un marquage isotopique stable avec des acides aminés en culture cellulaire (SILAC) basée sur la spectrométrie de masse quantitative (MS) en utilisant GFP-MKRN1 wt ou GFP comme appât. Nous avons identifié 53 protéines significativement enrichies en poids de GFP-MKRN1 par rapport aux AP témoins (taux de fausse découverte [FDR] < 5%, ratios combinés de trois expériences indépendantes). Presque tous les interacteurs identifiés ont été précédemment trouvés en association avec des transcrits polyadénylés (Gene Ontology [GO] terme « poly(A) RNA binding », fichier supplémentaire 1 : Figure S2A).

Conformément aux rapports précédents [18, 19, 21], nous avons constaté que MKRN1 interagit fortement avec les protéines cytoplasmiques poly(A)-binding PABPC1 et PABPC4 (Fig. 1a, fichier supplémentaire 1 : figure S2B, fichier supplémentaire 2 : tableau S1 ). De plus, nous avons détecté 14 protéines ribosomiques ainsi que quatre protéines qui se sont précédemment révélées co-purifier avec les ribosomes [20], dont IGF2BP1, LARP1, UPF1 et ELAVL1 (Fig. 1a). Nous avons confirmé les résultats de MS dans des expériences AP réciproques avec PABPC1, ELAVL1 et IGF2BP1 marqués GFP comme appâts suivis d'un Western blot pour MKRN1 endogène (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2C et Fichier supplémentaire 3 : Figure S10). Toutes les interactions détectées ont persisté en présence de RNases (RNase A et T1), démontrant que MKRN1 interagit avec ces protéines de manière indépendante de l'ARN (Fichier supplémentaire 1 : Figure S2C). L'association est en outre soutenue par une étude sur l'orthologue Mkrn1 en Drosophila melanogaster, qui a identifié pAbp, Larp, Upf1 et Imp (IGF2BP chez les mammifères) comme partenaires d'interaction (Dold et al., bioRxiv, https://doi.org/10.1101/501643).

MKRN1 interagit avec PABPC1 et d'autres régulateurs de la traduction et de la stabilité de l'ARN. une Interactome protéique de GFP-MKRN1 wt dans des cellules HEK293T analysées par protéomique quantitative basée sur la MS. Rapports SILAC combinés (m = 3 répétitions) après z-la normalisation des scores est tracée par rapport au journal10-intensités transformées. 1100 groupes de protéines ont été quantifiés dans au moins deux des trois expériences répétées. MKRN1 et les interacteurs significatifs sont mis en évidence (FDR < 5%). b MKRN1 et PABPC1 s'associent aux polysomes. Un gradient de 10 à 50 % de saccharose d'extraits cellulaires HEK293T traités au cycloheximide. Les analyses par transfert Western de fractions de gradient individuelles avec des anticorps contre MKRN1 et PABPC1/3 sont montrées (m = 3 répétitions, plus une répétition technique). L'absorbance UV a été mesurée à ?? = 254 nm. Les répliques et les images de gel non recadrées sont présentées dans le fichier supplémentaire 3 : Figure S10A-C. c Un motif PAM2 similaire au consensus précédemment rapporté (montré en haut Fichier supplémentaire 1 : Figure S1B) [22] est présent dans MKRN1 (premier acide aminé position indiquée sur la gauche). Les mutations introduites dans MKRN1 PAM2mut sont indiquées en essence ci-dessous. Les positions pertinentes sont mises en évidence (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1B). PABPC1 endogène interagit fortement avec MKRN1 wt et MKRN1 RINGmut , mais seulement dans une moindre mesure avec MKRN1 PAM2mut . Western blots pour PABPC1 et GFP endogènes après AP de GFP-MKRN1 (poids et mutants). Les rapports du signal PABPC1 (normalisé à l'entrée) dans les points d'accès GFP-MKRN1 par rapport au contrôle (vecteur vide GFP, EV) sont indiqués ci-dessous. Les répliques 2, 3 et les images de gel non recadrées sont présentées dans le fichier supplémentaire 3 : Figure S10D-F. e La comparaison quantitative des interactomes de GFP-MKRN1 wt et GFP-MKRN1 PAM2mut montre que PABPC1 et plusieurs autres interacteurs sont perdus lors de la mutation PAM2. Les rapports combinés de trois répétitions sont indiqués dans un nuage de points. Seules les protéines détectées dans au moins deux répétitions sur trois sont présentées. MKRN1 avec des interacteurs significatifs (de une) sont mis en évidence comme dans une (FDR < 5% en poids MKRN1). F MKRN1 WT et MKRN1 PAM2mut , mais pas MKRN1 RINGmut , s'auto-ubiquitaire efficacement. Essais d'ubiquitylation in vitro avec des protéines MKRN1 wt et mutantes recombinantes marquées par His qui ont été incubées avec ou sans l'enzyme E2 UBC5a, l'enzyme E1 UBA1 et l'ubiquitine. Une réaction avec UBC5a n'a servi que de contrôle. L'autoubiquitylation a été analysée par Western blot. Les répliques 2, 3 et les images de gel non recadrées sont présentées dans le fichier supplémentaire 3 : Figure S10G, H

Nos résultats suggèrent que MKRN1 fait partie d'une plus grande particule de ribonucléoprotéine d'ARNm (mRNP) avec PABPC1 et d'autres RBP impliqués dans la régulation traductionnelle. La « désintégration induite par le non-sens » et la « traduction » étaient les termes GO les plus significativement enrichis pour les partenaires d'interaction MKRN1 (processus biologique, fichier supplémentaire 1 : figure S2A). En outre, MKRN1 était clairement présent dans les fractions polysomales, comme déterminé dans les expériences de centrifugation en gradient de saccharose. Ici, il s'est co-sédimenté avec PABPC1 (Fig. 1b), indiquant qu'avec PABPC1, MKRN1 est associé à la traduction des ribosomes. Plusieurs protéines interagissent avec PABPC1 via un motif PABP-interacting motif 2 (PAM2), qui se lie spécifiquement au domaine MLLE présent presque exclusivement dans les protéines PABP [23, 24]. En conséquence, une étude précédente a démontré que MKRN1 s'associe à PABP via un motif PAM2 aux positions d'acides aminés 161-193 [19]. À l'appui d'une pertinence fonctionnelle putative, une analyse phylogénétique a illustré que la présence et le positionnement du motif PAM2 sont préservés dans les orthologues MKRN1 à travers les métazoaires (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1A, B). Des mutations ponctuelles dans le motif PAM2 de MKRN1 (GFP-MKRN1 PAM2mut ) [25] ont fortement compromis son interaction avec PABPC1 et PABPC4 dans des expériences AP suivies de MS ou Western blot (Fig. 1c–e et fichier supplémentaire 2 : Tableau S1). Étonnamment, MKRN1 PAM2mut a perdu l'interaction non seulement avec PABPC1 et PABPC4, mais aussi avec plusieurs autres protéines identifiées (Fig. 1e), suggérant que le mutant ne résidait plus dans les mRNP. À titre de comparaison, nous avons également testé une mutation ponctuelle précédemment décrite dans le domaine RING qui abolit la fonction E3 ubiquitine ligase (ligase-dead, GFP-MKRN1 RINGmut) [14]. Ce mutant présentait des interactions stables avec PABPC1 et d'autres interacteurs dans les données AP-MS. Dans les expériences de transfert de Western, nous avons noté une interaction réduite de MKRN1 RINGmut avec PABPC1. Une explication possible pourrait être les niveaux considérablement accrus de MKRN1 RINGmut dans les cellules qui peuvent fausser la normalisation dans les expériences de Western blot (Fig. 1d, fichier supplémentaire 1 : figure S3 et fichier supplémentaire 2 : tableau S1).

Afin d'exclure qu'une perte générale de l'intégrité de la protéine de MKRN1 PAM2mut, par exemple, en raison d'un mauvais repliement, soit responsable de la perte observée de l'interaction PABPC1, nous avons testé l'activité des variantes de la protéine MKRN1 recombinante dans des tests d'ubiquitylation in vitro. Comme prévu, le MKRN1 RINGmut recombinant était enzymatiquement inactif, comme en témoigne l'absence totale d'autoubiquitylation (Fig. 1f, fichier supplémentaire 1 : Figure S1E). En revanche, MKRN1 wt et MKRN1 PAM2mut pourraient s'autoubiquity avec la même efficacité, démontrant que le domaine E3 ubiquitine ligase de MKRN1 PAM2mut est toujours fonctionnel. De plus, la microscopie confocale de GFP-MKRN1 wt et GFP-MKRN1 PAM2mut a confirmé que la mutation PAM2 n'a pas conduit à l'agrégation ni à la localisation des protéines (Fichier supplémentaire 1 : Figure S1D). Ensemble, cela fournit des preuves solides que MKRN1 PAM2mut n'est généralement pas corrompu.

Dans l'ensemble, nos résultats confirment que MKRN1 interagit avec PABPC1 et suggèrent que les deux protéines s'associent à la traduction des ribosomes. La perte de l'interaction MKRN1-PABPC1 altère la formation de mRNP, indiquant que PABPC1 peut être impliqué dans le recrutement de MKRN1 dans les mRNP.

MKRN1 se lie aux queues poly(A) et aux tronçons riches en A dans les UTR 3'

Afin de caractériser le comportement de liaison à l'ARN du MKRN1 humain in vivo, nous avons effectué une réticulation UV et une immunoprécipitation avec résolution de nucléotides individuels (iCLIP) [26] en combinaison avec un marquage à la 4-thiouridine (4SU) pour améliorer la réticulation UV [27]. Dans trois expériences répétées avec MKRN1 marqué par GFP (GFP-MKRN1 wt) exprimé dans les cellules HEK293T, nous avons identifié plus de 4,6 millions d'événements de réticulation uniques, cumulés en 7331 sites de liaison MKRN1 (voir la section « Matériaux et méthodes » Fichier supplémentaire 1 : Figure S4A et tableau S2). Ceux-ci ont en outre été classés en fonction de la force de la liaison MKRN1, qui a été estimée à partir de l'enrichissement des événements de réticulation au sein d'un site de liaison par rapport à son environnement local en tant qu'indicateur de l'abondance de la transcription (« signal sur fond », SOB voir le « Matériaux et méthodes ») [28]. Les valeurs SOB étaient hautement reproductibles entre les répétitions (coefficients de corrélation de Pearson r > 0,72, Fichier supplémentaire 1 : Figure S4B-G).

À travers le transcriptome, MKRN1 s'est presque exclusivement lié aux ARNm codant pour les protéines avec une forte tendance à se localiser dans les 3'UTR (Fig. 2a, b). Les sites de liaison abritaient généralement des tétramères riches en uridine (Fichier supplémentaire 1 : Figure S5A), reflétant probablement la réticulation UV à base de 4SU [27]. Étonnamment, les 20% des sites de liaison MKRN1 supérieurs étaient massivement enrichis en tétramères AAAA (A, adénosine) dans les 5 à 50 nucléotides (nt) en aval des sites de liaison (Fig. 2c et fichier supplémentaire 1 : Figure S5A). L'enrichissement en AAAA reflétait la présence de tronçons riches en A, qui variaient de 8 à 30 nt de longueur (Fichier supplémentaire 1 : Figure S5B voir la section « Matériaux et méthodes »). Dans les 3'UTR, 30% (1848 sur 6165) des sites de liaison MKRN1 résidaient immédiatement en amont d'un tronçon riche en A (Fig. 2a, d) et des tronçons riches en A plus longs associés à une liaison MKRN1 plus forte (Fichier supplémentaire 1 : figure S5C,D). Curieusement, nous avons détecté la nécessité d'une série d'au moins 8 A continus pour conférer une forte liaison MKRN1 (Fig. 2e), qui correspondait précisément à l'empreinte ARN d'un domaine de motif de reconnaissance d'ARN (RRM) de PABP [29]. Étant donné que PABPC1 a été précédemment rapporté comme se liant non seulement aux queues poly(A) mais également dans les 3'UTR [30,31,32], ces observations suggèrent que MKRN1 se lie avec PABPC1 aux ARNm.

MKRN1 se lie en amont des tronçons riches en A dans les UTR 3'. une MKRN1 se lie en amont des tronçons riches en A dans l'UTR 3' du GN1 gène. Vue du navigateur du génome des données iCLIP GFP-MKRN1 montrant les événements de réticulation par nt (réplicats fusionnés) ainsi que les sites de liaison (lilas) et les tronçons riches en A associés (vert foncé). b MKRN1 se lie principalement dans l'UTR 3' des gènes codant pour les protéines. Graphiques circulaires résumant la distribution des sites de liaison MKRN1 à différents biotypes d'ARN (7331 sites de liaison, en haut) et différentes régions au sein des transcrits codant pour les protéines (6913 sites de liaison, en bas). c Les sites de liaison MKRN1 affichent un enrichissement en aval des homopolymères AAAA. Fréquence par nucléotide (nt) pour quatre 4-mères homopolymères dans une fenêtre de 101 nt autour des points médians des 20 % supérieurs des sites de liaison MKRN1 (selon le signal sur fond, voir la section « Matériaux et méthodes »). Les événements de réticulation MKRN1 s'accumulent en amont des tronçons riches en A. Le métaprofil (en haut) montre les événements de réticulation moyens par nt dans une fenêtre de 201 nt autour de la position de départ de 1412 tronçons riches en A associés à MKRN1 dans des UTR 3'. La visualisation de la carte thermique (en bas) affiche les événements de réticulation par nt (voir l'échelle de couleurs) dans une fenêtre de 101 nt autour des tronçons riches en A associés à MKRN1. e La force du site de liaison MKRN1 (signal sur fond, SOB) augmente avec le nombre de A continus dans le tronçon riche en A. Moyenne et écart type des forces du site de liaison MKRN1 associées aux tronçons riches en A hébergeant des séquences A continues de longueur croissante (X-axe). Les sites de liaison MKRN1 sans segments riches en A associés sont présentés à des fins de comparaison sur la gauche. Nombre de sites de liaison dans chaque catégorie indiqué dans le graphique à barres ci-dessus

Poussés par cette notion, nous avons examiné la fraction inhabituellement élevée de lectures iCLIP non mappées dans l'ensemble de données MKRN1 pour les A de fuite non modélisés afin de tester l'hypothèse selon laquelle MKRN1 peut également se lier aux queues poly(A) (Fichier supplémentaire 1 : Tableau S2). Les lectures non mappées affichaient généralement une teneur en A accrue (Fig. 3a), par rapport à une RBP de contrôle indépendante [33], et 6 % des lectures se terminaient par au moins dix terminaux A (Fig. 3a, encadré). De plus, les événements de réticulation GFP-MKRN1 wt cartographiés ont été enrichis en amont des sites de polyadénylation annotés, comme illustré dans le SRSF4 gène (Fig. 3b, c). Nous avons comparé ce modèle de liaison à d'autres RBP en utilisant les données eCLIP accessibles au public du projet ENCODE [34]. La liaison de TIAL1, PUM1, QKI, UPF1 et HNRNPK, qui sont connus pour remplir différentes fonctions dans le 3′ UTR [35,36,37,38], était distribuée dans les corps 3′ UTR (Fig. 3b). En revanche, PABPC4 ainsi que CPSF6, un composant de la machinerie de clivage et de polyadénylation, ont culminé avec MKRN1 vers les sites de polyadénylation. Ensemble, ces résultats soutiennent que MKRN1, mais pas les autres protéines de liaison à l'UTR 3', se lie aux queues poly(A), où il coïncide avec la protéine de liaison poly(A).

MKRN1 se lie aux queues poly(A). une Les lectures MKRN1 iCLIP non mappées affichent une teneur en A accrue (plus de la moitié de tous les nucléotides de la lecture), mettant en évidence la liaison de la queue poly(A). Fraction cumulée des lectures iCLIP (oui-axe, réplicats fusionnés) qui n'ont pas pu être mappés sur le génome humain (voir la section « Matériaux et méthodes ») et présentent au moins un contenu A donné (X-axe). Les données iCLIP pour la RBP HNRNPH non apparentée [33] sont présentées à titre de comparaison. Le pourcentage cumulé de lectures avec un nombre minimum de bornes A est affiché sous forme d'encart. b Les événements de réticulation MKRN1 augmentent vers les extrémités 3' UTR. Le métaprofil des événements de réticulation MKRN1 et de sept RBP supplémentaires montre la somme normalisée des événements de réticulation par nt dans une fenêtre de 2001 nt autour des sites de polyadénylation annotés des transcrits avec > 1 kb 3'UTR. Les barres grises indiquent les fenêtres dans le corps 3′ UTR (−750 à −650) et à proximité du site poly(A) (−150 à −50), qui ont été utilisées pour calculer les facteurs d'enrichissement. c MKRN1 se lie près du site de polyadénylation du SRSF4 gène. Vue du navigateur du génome comme sur la figure 2a. La liaison globale à l'ARN de MKRN1 est fortement réduite lors de l'abrogation de l'interaction PABPC1. Autoradiographie (à gauche) d'expériences de réticulation UV (réplique 1, avec 4SU et réticulation UV à 365 nm répliques 2 et 3 dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S6A, B) comparant GFP-MKRN1 PAM2mut avec GFP-MKRN1 wt à différentes étapes de dilution pour l'étalonnage . Quantification du signal radioactif des complexes protéine-ARN et Western blot correspondant illustré à droite. Les images de gel non recadrées sont présentées dans le fichier supplémentaire 3 : Figure S11A,B. e MKRN1 est recruté sur l'ARN poly(A) à l'aide de PABPC1. La SDS-PAGE (coloration de Coomassie) montre la récupération de His-MKRN1 wt et/ou His-PABPC1 (marqués respectivement par des pointes de flèches en essence et grises) à partir du pulldown d'oligonucléotides d'ARN biotinylés, contenant les 22 derniers nt de la SRSF4 3′ UTR suivi de 20 A (A20 ARN) ou 20 nucléotides V (ARN contrôle A ou C ou G). Des billes sans ARN ont servi de témoins. Les répliques et les images de gel non recadrées sont présentées dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S6C, D et le fichier supplémentaire 3 : S11C-E, respectivement

Afin de tester si l'interaction avec PABPC1 influence la liaison à l'ARN MKRN1, nous avons effectué des expériences de réticulation UV avec GFP-MKRN1 PAM2mut, qui n'interagit plus avec PABPC1 (Fig. 1d, e). Étonnamment, la liaison à l'ARN de ce mutant était globalement réduite par rapport à GFP-MKRN1 wt (Fig. 3d, fichier supplémentaire 1 : figure S6A, B et fichier supplémentaire 3 : figure S11), indiquant que PABPC1 pourrait recruter MKRN1 dans l'ARN. Afin d'étayer cette découverte, nous avons effectué des tests de pulldown d'ARN in vitro avec des ARN recombinants His-PABPC1 et/ou His-MKRN1 et des ARN biotinylés. Notamment, l'ajout de His-PABPC1 a fortement augmenté le pulldown de His-MKRN1 avec le A20-abritant l'ARN mais pas l'ARN de contrôle (Fig. 3e et fichier supplémentaire 1 : Figure S6C,D), indiquant que PABPC1 stabilise MKRN1 au niveau des séquences poly(A).

En résumé, ces résultats suggèrent fortement que MKRN1 se lie en amont des tronçons riches en A dans les UTR 3' et les queues poly(A). Nous émettons l'hypothèse que ce modèle de liaison est défini via l'interaction de MKRN1 avec PABPC1, puisque (i) la liaison MKRN1 s'intensifie lorsque le tronçon riche en A associé atteint une longueur suffisante pour accueillir un domaine RRM de PABPC1, (ii) abolissant l'interaction MKRN1-PABPC1 entraîne une perte de la liaison à l'ARN de MKRN1 et (iii) PABPC1 renforce l'association de MKRN1 avec l'ARN in vitro. Dans un scénario concordant, il a été constaté que Drosophile Mkrn1 se lie avant un étirement étendu riche en A dans l'UTR 3' de oskar ARNm et que cette liaison est significativement réduite lors de l'épuisement de pAbp (Dold et al., bioRxiv, https://doi.org/10.1101/501643).

MKRN1 favorise le blocage des ribosomes au niveau des séquences poly(A)

Comme indiqué ci-dessus, nos données iCLIP ont démontré que MKRN1 marque le début des queues poly(A). Par conséquent, il est concevable que MKRN1 se lie également en amont d'événements de polyadénylation prématurés dans des cadres de lecture ouverts. Sur la base du modèle de liaison de MKRN1, de ses partenaires d'interaction et de son association avec les ribosomes, nous avons émis l'hypothèse que MKRN1 pourrait être impliqué dans la clairance de ces transcrits par le contrôle de qualité associé aux ribosomes (RQC). Dans ce processus, les ribosomes qui se traduisent en une séquence poly(A), par exemple lors de la lecture du codon stop ou d'une polyadénylation prématurée, sont bloqués et finalement recyclés [4, 5]. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé un test basé sur la cytométrie en flux récemment introduit qui surveille le blocage des ribosomes dans un double rapporteur de fluorescence [8, 10]. Dans ce journaliste, les gènes codant pour la protéine fluorescente verte et rouge (GFP et RFP, respectivement) sont séparés par une région de liaison avec un tronçon poly (A) comme séquence putative de blocage du ribosome (Fig. 4a). Le lieur est flanqué de deux sites P2A viraux qui favorisent l'allongement de la traduction en produits protéiques séparés, déconnectant ainsi la traduction de la région du lieur des produits de traduction GFP et RFP adjacents [39]. En conséquence, la traduction complète du rapporteur entraîne des quantités égales de trois protéines autonomes (GFP, peptide de liaison et RFP), tandis que l'avortement de la traduction dans la séquence de liaison altère la production de RFP, mais pas de GFP. Cela se traduit par un rapport RFP:GFP réduit [8], qui est mesuré à l'aide de la cytométrie en flux basée sur la fluorescence.

MKRN1 bloque les ribosomes au niveau des séquences poly(A). une Le double rapporteur de fluorescence abrite une GFP N-terminale, suivie d'un linker FLAG-SR-X et d'un RFP C-terminal, qui sont séparés par des sites P2A pour assurer la traduction en trois protéines distinctes [8]. Le rapport GFP:RFP résultant a été déterminé en utilisant la cytométrie en flux. Le fragment inséré K(AAA)20 code pour 20 lysines en répétant le codon AAA. Le vecteur de départ sans insert (K0) a servi de témoin. Les ribosomes schématiques illustrent la traduction des segments rapporteurs respectifs. b Les ribosomes ne parviennent pas à caler en l'absence de MKRN1. Des cellules HEK293T ont été transfectées avec des siRNA de contrôle ou des siRNAs ciblant MKRN1 (KD1 et KD2) ou ZNF598 pendant 24 h, suivi d'une transfection des plasmides rapporteurs pendant 48 h. Les transferts Western pour les KD sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S8A. Les signaux RFP et GFP ont été analysés par cytométrie en flux. Ratios RFP:GFP médians, normalisés à K0 en contrôle, sont affichés. Les barres d'erreur représentent s.d.m. P valeurs indiquées ci-dessus t test, correction de Benjamini-Hochberg, m ≥ 6 répétitions ns, non significatif). Analyses des inserts codant pour 12 lysines (K(AAA)12) et dix arginines (R(CGA)10) dans le double reporter de fluorescence sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S7A. c L'expression de MKRN1 wt peut sauver le blocage du ribosome. Des lignées cellulaires HEK293T avec des intégrations stables de constructions de type sauvage et de mutants MKRN1 insensibles au siRNA2, ou un vecteur vide, ont été transfectées avec MKRN1 siRNA2 pendant 24 h, suivi d'une transfection des plasmides rapporteurs pendant 48 h. Les signaux RFP et GFP ont été analysés par cytométrie en flux. Ratios RFP:GFP médians, normalisés à K0 dans les cellules WT, sont affichés. Les barres d'erreur représentent s.d.m. P valeurs indiquées ci-dessus t test, correction de Benjamini-Hochberg, m = 6 répétitions ns, non significatif). Analyses pour les plasmides rapporteurs avec inserts codant pour K(AAA)12 ou R(CGA)10 sont illustrés dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S7B. MKRN1 Assommer (MKRN1 KO) et des cellules HEK293T de type sauvage (WT) ont été transfectées avec les plasmides rapporteurs pendant 48 h. Mesures, analyses et visualisation comme dans c (m = 4 répétitions). Analyses pour les plasmides rapporteurs avec inserts codant pour K(AAA)12 ou R(CGA)10 sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 : Figure S7C ()

Comme indiqué précédemment, l'insertion d'un K(AAA)20 linker (codant 20 résidus de lysine) dans le rapporteur a entraîné un blocage prédominant des ribosomes par rapport au vecteur de départ (K0, Fig. 4b et Fichier supplémentaire 1 : Figure S7). Surtout, MKRN1 l'épuisement avec deux siARN indépendants a conduit à une récupération reproductible de l'expression RFP en aval de K(AAA)20, suggérant que de nombreux ribosomes n'ont pas réussi à décrocher à K(AAA)20 (MKRN1 KD1 et KD2 Fig. 4b, Fichier supplémentaire 1 : Figure S7A, S8A,B, et Fichier supplémentaire 3 : Figure S12). MKRN1 KD2 semblait légèrement plus efficace, peut-être parce que cet ARNsi diminuait simultanément les niveaux de transcription du paralogue proche MKRN2 (Fichier supplémentaire 1 : Figure S8B). L'impact spécifique de MKRN1 sur le décrochage des ribosomes a été renforcé en complétant le MKRN1 KD avec intégration stable de MKRN1 construits. Seul MKRN1 wt était capable d'inverser partiellement l'effet KD, de sorte que le blocage du ribosome était partiellement restauré, alors qu'aucun des mutants MKRN1 n'était fonctionnel dans ce test (Fig. 4c et fichier supplémentaire 1 : Figure S7B). De plus, nous avons constaté que MKRN1 KD2 n'a pas influencé l'abondance de l'ARN rapporteur sous-jacent (Fichier supplémentaire 1 : Figure S7D), indiquant que le RQC pour ce rapporteur n'est pas couplé à une déstabilisation appréciable de l'ARNm dans les cellules HEK293T, conformément à une étude précédente [8].

Afin de relier l'effet de MKRN1 à d'autres acteurs de la voie RQC, nous avons renversé ZNF598, l'ubiquitine ligase E3 qui a récemment été rapportée pour bloquer les ribosomes pendant le RQC [8,9,10]. Surtout, MKRN1 KD2 a altéré le décrochage des ribosomes dans une mesure similaire à celle de KD de ZNF598. Épuisement simultané de MKRN1 et ZNF598 n'était pas additif, indiquant que les deux protéines fonctionnent dans la même voie (Fig. 4b et fichier supplémentaire 1 : Figure S7A). Nous n'avons pas pu détecter d'interaction entre MKRN1 et ZNF598 dans les expériences de pulldown (Fig. 1d). Cependant, nous avons noté un certain niveau de régulation croisée, de sorte que ZNF598 l'expression a diminué dans MKRN1 KD1 (mais pas dans MKRN1 KD2), alors que ZNF598 surexpression réduite MKRN1 expression (Fichier supplémentaire 1 : Figure S8). Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que MKRN1 remplit une fonction spécifique dans RQC complémentaire de ZNF598.

Pour une validation indépendante des résultats KD, nous avons généré un MKRN1 lignée cellulaire knock-out (KO) à l'aide de l'édition du génome CRISPR/Cas9 (Fichier supplémentaire 1 : Figure S8C, D). Les tests de Reporter ont montré que la perte complète de MKRN1 décrochage du ribosome altéré à K(AAA)20, bien qu'avec une taille d'effet plus petite par rapport au KD médié par siRNA (Fig. 4d et fichier supplémentaire 1 : Figure S7C). qPCR a indiqué une régulation positive compensatrice du paralogue MKRN2 dans le MKRN1 KO mais pas dans le MKRN1 KD (Fichier supplémentaire 1 : Figure S8B,D), ce qui pourrait expliquer la taille d'effet réduite du MKRN1 KO dans les tests rapporteurs. En accord avec un rôle partiellement redondant de MKRN2, nous constatons que l'épuisement simultané de MKRN1 et MKRN2, comme observé sur KD avec siRNA2 (Fichier supplémentaire 1 : Figure S8B), montre un effet plus important que KD avec siRNA1, qui ne change pas MKRN2 niveaux.

Sur la base de ces résultats, nous proposons MKRN1 en tant que nouvel acteur du RQC qui contribue à un blocage efficace des ribosomes au niveau des séquences poly(A). Nos expériences suggèrent que cette fonction dépend probablement de l'interaction de MKRN1 avec PABPC1 ainsi que de son activité E3 ubiquitine ligase.

MKRN1 médie l'ubiquitylation de RPS10 et PABPC1

Le RQC s'appuie sur une série d'événements d'ubiquitylation par plusieurs ubiquitine ligases E3, dont Listerin et ZNF598 [5]. Afin d'identifier les substrats d'ubiquitylation putatifs de MKRN1, nous avons effectué un profilage des restes d'ubiquitine pour comparer l'abondance relative des lysines modifiées par la diglycine dans MKRN1 KD et cellules de contrôle. Nous avons quantifié 2324 sites d'ubiquitylation (dans 1264 protéines) qui ont été détectés dans les quatre expériences répétées (Fichier supplémentaire 4 : Tableau S3). Notamment, MKRN1 l'épuisement a conduit à une diminution significative de l'abondance de 29 sites d'ubiquitylation sur 21 protéines (FDR < 10%, Fig. 5a). La comparaison de l'abondance relative des substrats putatifs dans les extraits totaux a montré qu'aucun d'entre eux n'a changé de manière significative dans le MKRN1 Cellules KD, suggérant que l'ubiquitylation ne déclenche pas une dégradation substantielle de ces protéines (Fichier supplémentaire 1 : Figure S9A et Fichier supplémentaire 5 : Tableau S4). Ce résultat a été confirmé par Western blot pour plusieurs protéines qui ont été identifiées comme des substrats putatifs de MKRN1 (Fichier supplémentaire 1 : Figure S9B).

MKRN1 ubiquityle la protéine ribosomique RPS10 et les régulateurs traductionnels. une Profilage des restes d'ubiquitine pour comparer l'abondance relative des sites d'ubiquitylation dans MKRN1 KD2 et les cellules témoins HEK293T. Les peptides rémanents d'ubiquitine ont été enrichis et analysés par spectrométrie de masse quantitative, quantifiant un total de 15 528 sites d'ubiquitylation sur 4790 protéines. 29 sites cibles MKRN1 putatifs avec une ubiquitylation significativement réduite lors MKRN1 KD2 (FDR < 10%, m = 4 réplicats) sont mis en évidence et étiquetés avec le nom de la protéine respective. Notez que de nombreuses protéines contiennent plusieurs sites d'ubiquitylation régulés différemment. b Réseau d'interaction protéique de 21 protéines avec des sites cibles d'ubiquitylation MKRN1 putatifs (significativement réduit, montré dans une). Les interactions fonctionnelles ont été obtenues à partir des bases de données STRING et BioGrid et de notre étude. Visualisation par Cytoscape. c Résultats du profilage des restes d'ubiquitine pour les sites d'ubiquitylation régulés de manière significative (FDR < 10%) dans les protéines du réseau en b. La moyenne et l'écart type de la moyenne (s.d.m., barres d'erreur) sont indiqués avec tous les points de données. Comparaison de l'interactome de GFP-MKRN1 wt (WT sur GFP, voir Fig. 1a) avec des substrats d'ubiquitylation putatifs MKRN1 du profilage des restes d'ubiquitine (UB, voir une). Des noms de protéines sont donnés pour tous les substrats d'ubiquitylation. e Résultats du profilage des restes d'ubiquitine pour sept sites d'ubiquitylation quantifiés dans RPS10 et RPS20. Les changements significatifs sont indiqués en noir (FDR < 10%) et les changements non significatifs en gris. Représentation comme dans c. F Comparaison des sites d'ubiquitylation dans les protéines cibles RPS10 (UniProt ID P46783), RPS20 (P60866), PABPC1 (P11940), PABPC4 (B1ANRO), IGF2BP1 (Q9NZI8), IGF2BP2 (F8W930) et IGF2BP3 (O00425) qui sont modifiés par ZNF598 et MKRN1 pendant RQC. g MKRN1 ubiquityle RPS10 et PABPC1 in vitro. His-RPS10 (left) or His-PABPC1 (right) were incubated with or without His-MKRN1. Ubiquitylation of the target proteins was assessed by Western blot. Replicates 2, 3, and uncropped gel images are shown in Additional file 3: Figure S12I,J for RPS10 and Additional file 3: Figure S12K,L for PABPC1

The majority of the ubiquitylation targets formed a functional cluster of translational regulators based on our own interactome data, previously reported protein-protein interactions, and functional annotations (Fig. 5b and Additional file 1: Figure S9C). Intriguingly, we identified a MKRN1-dependent ubiquitylation site on RPS10, a 40S ribosomal protein that was previously reported to be modified by ZNF598 during RQC [8,9,10]. Ici, MKRN1 KD led to a significant decrease in ubiquitylation at lysine 107 of RPS10 (K107 Fig. 5c–f). En outre, MKRN1 KD decreased ubiquitylation of a number of interaction partners including PABPC1/4, IGF2BP1/2/3, LARP1, MOV10, and ELAVL1 (Fig. 5d). In order to test whether MKRN1 can directly modify RPS10 and PABPC1, we performed in vitro ubiquitylation assays with recombinant proteins. Western blot experiments detected the appearance of multiple mono- and poly-ubiquitylated variants of RPS10 and PABPC1, illustrating that MKRN1 efficiently ubiquitylated both proteins (Fig. 5g). We therefore propose that rather than recruiting ZNF598 or another E3 ubiquitin ligase, MKRN1 plays an active role in RQC by regulatory ubiquitylation of RPS10.


Biological characterization of various forms of elongation factor 1 from rabbit reticulocytes

Two forms of elongation factor 1 (EF-1) have been tested for a variety of biological functions. One form, EF-1H, is a high-molecular-weight aggregate (Mr greater than 500,000) containing four distinct polypeptides (alpha, beta, gamma, delta). The other form, EF-1 alpha, consists of a single polypeptide which is the same as the alpha subunit of EF-1H. Both EF-1 alpha and EF-1H function catalytically in binding Phe-tRNA to ribosomes, and in poly(U)-directed polyphenylalanine synthesis. The activity of EF-1 alpha is enhanced in polyphenylalanine synthesis by a complementary component, EF-1 beta delta. It is also shown that EF-1 beta delta can facilitate an exchange of EF-1 alpha-bound GDP for GTP. The EF-1 alpha dissociation constants for GDP and GTP were 0.47 and 0.55 microM respectively, while the EF-1H dissociation constants for GDP and GTP were 2.0 and 1.6 microM, respectively. Thus, while EF-1 alpha and EF-1H had approximately the same affinities for GDP and GTP, the EF-1 alpha dissociation constants were about fourfold lower than the EF-1H dissociation constants. Attempts to isolate complexes of EF-1 alpha or EF-1H with GTP and Phe-tRNA or with GTP, Phe-tRNA, and ribosomes were unsuccessful using either Millipore filters, gel filtration, or sucrose density gradients. The results presented in this report, along with studies from other laboratories, strengthen the hypothesis that the general mechanism of the elongation cycle is similar in eucaryotes and procaryotes.


Résumé

Significant effort has been devoted to fabricating various biomaterials to satisfy specific clinical requirements. In this study, we developed a new type of guided tissue regeneration (GTR) membrane by electrospinning a suspension consisting of poly( l -lactic acid), multiwalled carbon nanotubes, and hydroxyapatite (PLLA/MWNTs/HA). MWNTs/HA nanoparticles were uniformly dispersed in the membranes, and the degradation characteristics were far improved. Cytologic research revealed that the PLLA/MWNTs/HA membrane enhanced the adhesion and proliferation of periodontal ligament cells (PDLCs) by 30% and inhibited the adhesion and proliferation of gingival epithelial cells by 30% also, compared with the control group. After PDLCs were seeded into the PLLA/MWNTs/HA membrane, cell/membrane composites were implanted into the leg muscle pouches of immunodeficient mice. Histologic examinations showed that PDLCs attached on the membranes functioned well in vivo. This new type of membrane shows excellent dual biological functions and satisfied the requirement of the GTR technique successfully in spite of a monolayer structure. Compared with other GTR membranes on sale or in research, the membrane can simplify the manufacturing process, reduce the fabrication cost, and avoid possible mistakes in clinical application. Moreover, it does not need to be taken out after surgery. PLLA/MWNTs/HA membranes have shown great potential for GTR and tissue engineering.


Résumé

Two different series of polyethylenimine (PEI) block copolymers grafted with linear poly(ethylene glycol) (PEG) were investigated as delivery systems for oligodeoxynucleotides (ODN) and ribozymes. The resulting interpolyelectrolyte complexes were characterized with respect to their physicochemical properties, protection efficiency against enzymatic degradation, complement activation, and biological activity under in vitro conditions. The effect of PEG molecular weight and the graft density of PEG blocks on complex characteristics was studied with two different series of block copolymers. The resulting ODN complexes were characterized by photon correlation spectroscopy (PCS) and laser Doppler anemometry (LDA) to determine complex size and zeta potential. Electrophoresis was performed to study the protective effects of the different block copolymers against enzymatic degradation of ODN. Intact ODN was quantified via densitometric analysis. Ribozymes, a particularly unstable type of oligonucleotides, were used to examine the influence of block copolymer structure on biological activity. The stabilization of ribozymes was also characterized in a cell culture model. Within the first series of block copolymers, the grafted PEG chains (5 kDa) had marginal influence on the complex size. Two grafted PEG chains were sufficient to achieve a neutral zeta potential. Within the second series, size and zeta potential increased with an increasing number of PEG chains. A high number of short PEG chains resulted in a decrease in complex size to values comparable to that of the homopolymer PEI 25 kDa and a neutral zeta potential, indicating a complete shielding of the charges. Complement activation decreased with an increasing number of short PEG 550 Da chains. Ribozyme complexes with PEG-PEI block copolymers achieved a 50% down-regulation of the target mRNA. This effect demonstrated an efficient stabilization and biological activity of the ribozyme, which was comparable to that of PEI 25 kDa. PEGylated PEI block copolymers represent a promising new class of drug delivery systems for ODN and ribozymes with increased biocompatibility and physical stability.


Affiliations

School of Chemistry, University of Birmingham, Edgbaston, Birmingham, UK

Thomas Leigh & Paco Fernandez-Trillo

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Contributions

T.L. and P.F.-T. reviewed the literature, organized the Review and designed the figures. P.F.-T. wrote the manuscript, with both authors contributing to the final version of the Review.

Corresponding author


3 STRUCTURE AND FUNCTION OF NATURAL RNA TRIPLE HELICES

Experimental techniques to detect major-groove triple helices in nucleic acids include circular dichroism spectroscopy, oligonucleotide binding assays (e.g., isothermal titration calorimetry, native gel-shift assay, surface plasmon resonance), fluorescence resonance energy transfer, infrared spectroscopy, structure mapping (chemical or nuclease), UV thermal denaturation assay, and compensatory base triple mutations (e.g., stepwise substitution of putative U•A-U with C + •G-C base triple) coupled with functional assay appropriate for triple helix-of-interest. These techniques generate results that would be consistent with the formation of a triple helix. Importantly, direct evidence comes from solving 3D structures using X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance (NMR), or single-particle cryogenic-electron microscopy (cryo-EM) methodologies. Because simplified in vitro systems for structural studies can artificially induce the formation of a triple helix, it is ideal to have a cell-based assay in which the parent RNA harboring the triple helix, either endogenous or exogenous, can be studied in its true physiological environment. To validate an RNA triple helix, experimental evidence from two or more orthogonal approaches is desired, preferably direct evidence coupled with a cell-based assay examining compensatory base triple mutants. The structure and function of natural RNA triple helices, defined herein as two consecutive base triples along helical axis, that have been visualized using X-ray crystallography, NMR and/or cryo-EM are described below. Thus far, three major biological functions have been determined: Catalysis, ligand binding, and stability element.

3.1 RNA triple helix is required for telomerase catalytic activity

150 to >3,000 nucleotides) and sequence, their structures from various eukaryotic organisms, such as budding yeast, ciliates, and vertebrates, have a conserved H-type pseudoknot (Figures 1c and 3) that includes a major-groove triple helix (Cash et al., 2013 J. L. Chen, Blasco, & Greider, 2000 Shefer et al., 2007 Theimer et al., 2005 Tzfati, Knight, Roy, & Blackburn, 2003 Ulyanov, Shefer, James, & Tzfati, 2007 ).

Human TR was the first naturally occurring U•A-U major-groove RNA triple helix to have its 3D structure solved, which was almost 50 years after poly(U•A-U) triple helices had been reconstituted in a test tube by Felsenfeld and co-workers (Felsenfeld et al., 1957 Theimer et al., 2005 ). Since then, solution NMR structures have been solved for human TR (Figure 3), Kluyveromyces lactis TR and Tetrahymena thermophila TER (Table 1 Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Kim et al., 2008 Theimer et al., 2005 ). These structures show that the major-groove triple helix is composed of two to five U•A-U base triples along with a protonated C + •G-C base triple in K. lactis and a protonated A + •G-C base triple in T. thermophila (Table 1 Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Kim et al., 2008 Theimer et al., 2005 ). These major-groove triple helices are extended by nearby minor-groove base triples, forming a nearly continuous triple helix that may form cooperatively (Cash & Feigon, 2017 Chen, Chang, Chou, Bustamante, & Tinoco Jr., 2009 Kim et al., 2008 Theimer et al., 2005 ). Importantly, the presence of a major-groove triple helix in TR is further supported by mutating individual U•A-U base triples to the isosteric C•G-C base triple (Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 G. Chen et al., 2009 Qiao & Cech, 2008 Shefer et al., 2007 Theimer et al., 2005 ). For human TR, this compensatory mutational analysis showed that the C•G-C-containing mutant is thermodynamically more stable at pH 5 than pH 7 based on UV thermal denaturation assays and that the complete triple mutation is necessary to recover telomerase activity in an in vitro TRAP (telomeric repeat amplification protocol) assay, demonstrating that the triple helix is essential for catalysis (Theimer et al., 2005 ). A similar base triple compensatory mutational analysis was performed and similar outcomes were observed for K. lactis, Saccharomyces cerevisiae (TLC1) and T. thermophila TRs using various in vitro and cell-based assays to monitor telomerase activity (Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Qiao & Cech, 2008 Shefer et al., 2007 ). Collectively, these studies demonstrate that the triple helix structure, not sequence, is conserved and is required for telomerase activity.

Originally, it was thought that the 2′-hydroxyl of A176, which participates in a U•A-U base triple, played a direct role in catalysis (Qiao & Cech, 2008 ). However, cryo-EM structures of the human and Tétrahymène telomerase holoenzyme both show the pseudoknot forming an arc-like structure that partially encircles TERT, positioning the triple helix on the opposite side of TERT's active site (Jiang et al., 2015 Nguyen et al., 2018 ). In light of these recent structural findings, it appears that the triple helix contributes to the proper folding of the pseudoknot, whose structure is essential for a fully assembled and catalytically active RNP (Cash et al., 2013 Cash & Feigon, 2017 Liu & Theimer, 2012 Mihalusova, Wu, & Zhuang, 2011 Qiao & Cech, 2008 Shefer et al., 2007 Theimer et al., 2005 Tzfati et al., 2003 ). Thus, the dynamics of a distal tertiary structural element are coupled to catalysis.

3.2 RNA triple helix coordinates catalytic magnesium ions during splicing

Introns are intervening noncoding RNA sequences that are removed from precursor RNAs (e.g., mRNA, rRNA, and tRNA) in a process known as splicing. RNA splicing proceeds in two sequential phosphotransesterification reactions: First 5′ splice site cleavage and then 3′ splice site cleavage so that the two RNA segments can be ligated together. Interestingly, this splicing reaction occurs at a single catalytic center and requires a “catalytic triplex” for both group II introns and the eukaryotic spliceosome. High-resolution 3D structural studies of group II introns and the spliceosome have shown that their active site architectures are highly conserved, supporting the hypothesis that these RNA catalysts share a common molecular ancestor (see [Galej et al. ( 2018 )] for review).

Group II introns are self-splicing ribozymes found in all three domains of life. Based on RNA secondary structures, group II introns are classified as IIA to IIF and are generally 400–800 nucleotides in length (see [Smathers and Robart ( 2019 )] for a review). Group II introns form a six-domain structure (I–VI), with the catalytic triplex residing in domain V. A fully formed catalytic triplex consists of three consecutive base triples, which includes the so-called “catalytic triad” (Table 1 Chan et al., 2018 Haack et al., 2019 Marcia & Pyle, 2012 Toor et al., 2008 ). The catalytic triad is the most highly conserved region across group IIA–C introns. Two common catalytic triads are AGC and CGC, which refer to the nucleotides in the purine-rich strand of the catalytic triplex. For example, the AGC catalytic triad from the Pylaiella littoralis group IIB intron corresponds to the U• A -U/G• G -U/A• C -G catalytic triplex, where the underlined nucleotides denote the catalytic triad (Table 1 Chan et al., 2018 ). A combination of mutational, phosphorothioate substitution, and metal rescue analyses have shown that the catalytic triplex of the ai5γ group II intron from S. cerevisiae is essential for splicing because the phosphate backbone interacts with at least two divalent magnesium ions (Boulanger et al., 1995 Gordon, Fong, & Piccirilli, 2007 Gordon & Piccirilli, 2001 Sontheimer, Gordon, & Piccirilli, 1999 ). These two metal ions activate the nucleophile in the second step of splicing (i.e., exon-ligation) and stabilize the leaving groups during both splicing steps (Gordon et al., 2007 Gordon & Piccirilli, 2001 Sontheimer et al., 1999 ). 3D structural studies have subsequently confirmed that the negatively charged phosphate backbones of the catalytic triplex coordinate two magnesium ions with high affinity, consistent with a two metal-ion mechanism (Figure 4a Chan et al., 2018 Haack et al., 2019 Marcia & Pyle, 2012 , 2014 Robart, Chan, Peters, Rajashankar, & Toor, 2014 Steitz & Steitz, 1993 Toor et al., 2008 ). Along with metal binding, the triple helix is thought to mediate the transition between the two steps of splicing, for RNA structural probing studies and comparative analyses of crystallographic structures during the splicing reaction cycle have observed the catalytic triplex undergoing dynamic conformational transitions (Chan et al., 2018 Marcia & Pyle, 2012 ). Although group II introns require a maturase protein for activity in vivo, it appears that the maturase protein does not interact with the catalytic triplex, for the maturase protein is more than 10 Å from the catalytic triplex in a cryo-EM structure of the Lactococcus lactis group IIA intron-LtrA maturase complex (Qu et al., 2016 ). Altogether, most structural and mechanistic observations for the group II intron, including the catalytic triplex, apply to the eukaryotic spliceosome.

The eukaryotic spliceosome is an RNP complex whose composition is dynamic throughout the splicing cycle: Five small nuclear RNPs (i.e., U1, U2, U4, U5, and U6 snRNPs) and numerous proteins to form a multi-megadalton complex. This RNP is responsible for pre-mRNA splicing in eukaryotes (see [Wilkinson, Charenton, & Nagai, 2019 ] for review). Like group II introns, the active site of the spliceosome has a catalytic triplex that (a) includes a catalytic triad and (b) uses its phosphate backbone to coordinate two catalytic magnesium ions, which stabilize the leaving groups of each step in the splicing reaction (Figure 4a and Table 1 Fica, Mefford, Piccirilli, & Staley, 2014 Fica et al., 2013 Gordon, Sontheimer, & Piccirilli, 2000 Sontheimer, Sun, & Piccirilli, 1997 Yean, Wuenschell, Termini, & Lin, 2000 ). The intermolecular catalytic triplex forms via Watson–Crick base pairing between the U2 and U6 snRNAs, and the Hoogsteen strand nucleotides in U6 snRNA includes two nucleotides (underlined GA) from the ACAGA GA sequence that recognizes the 5′-splice site of intron (Bertram et al., 2017 Fica et al., 2014 Hang et al., 2015 Mefford & Staley, 2009 Wan et al., 2016 Yan et al., 2015 Yan, Wan, Bai, Huang, & Shi, 2016 ). These interactions bring together the 5′-splice site and the metal-bound catalytic triplex at the active site. Thus far, cryo-EM structures of the spliceosome have predicted a relatively rigid catalytic center, including the catalytic triplex, once the activated spliceosome forms (L. Zhang, Vielle, Espinosa, & Zhao, 2019 ). In contrast, yeast genetic studies suggest the catalytic core undergoes conformational rearrangements, toggling between catalytically active and inactive conformations (Eysmont, Matylla-Kulinska, Jaskulska, Magnus, & Konarska, 2019 ). Most nucleobases in the U2–U6 catalytic triplex appear to be dispensable for splicing in S. cerevisiae whole-cell extract, suggesting that proteins play an important role in stabilizing the U2–U6 snRNAs (Bao, Boon, Will, Hartmuth, & Luhrmann, 2018 ). Unlike group II introns, the catalytic triplex of the spliceosome is embedded in a protein cavity therefore, most RNA–protein contacts are established between the sugar-phosphate backbone of the catalytic triplex and the side chains of arginine, lysine, glutamine, and serine. However, a cryo-EM structure of the S. cerevisiae spliceosome C complex suggests that the side chain of His5 from CWC2P has the potential to mediate two hydrogen bonds: One with N2 of the Hoogsteen G in the G •G-C base triple and one with O6 of G in the U•C-G base triple (Figure 4b and Table 1 Wan et al., 2016 ). This putative arrangement illustrates a novel way in which proteins may recognize two stacked base triples. Finally, it should be mentioned that the minor spliceosome is predicted to form a similar catalytic triplex by the U6atac and U12 snRNAs based on sequence conservation and biochemical studies. The catalytic triplex in group II self-splicing introns and the spliceosome demonstrates how triple helices can mediate essential biological functions and likely more examples remain to be discovered.

3.3 RNA triple helix as a ligand-binding site

Riboswitches are highly conserved RNA structural elements (or aptamers) used primarily by bacteria to control gene expression in response to intracellular ligand binding. Comme un cis-regulatory element typically in the 5′ untranslated region of mRNAs, riboswitches can sense ligands, usually a metabolite or ion, and subsequently adopt a ligand-bound structure that will accordingly turn transcription or translation ON/OFF (see [Breaker, 2018 ] for a review). Over 100,000 riboswitches have been discovered among

47 riboswitch classes, which are classified by ligand identity (P. J. McCown, Corbino, Stav, Sherlock & Breaker, 2017 ).

Thus far, 3D structures have been solved for

30 different riboswitch classes and six of them revealed a major-groove triple helix in their ligand-bound states: Cyclic-dimeric-guanosine monophosphate (c-di-GMP)-II, guanidine-III, prequeosine (PreQ1)-II, PreQ1-III, S-adenosylmethionine (SAM)-II, and SAM-V (Table 1 Gilbert et al., 2008 L. Huang & Lilley, 2018 L. Huang et al., 2017 Kang et al., 2014 Liberman et al., 2013 Liberman et al., 2015 Smith et al., 2011 ). In general, riboswitch triple helices are composed of two canonical U•A-U base triples and one to four noncanonical base triples that are arranged together in a classic H-type pseudoknot or a related variant (Figures 1c and 5). Importantly, the ligand in all six riboswitches is recognized by the triple helix. For the five RNA-derived ligands, their nucleobases participate in a noncanonical base triple or quadruplet (Figure 5 and Table 1). For example, the adenine moiety of SAM is engaged in an ASAM•U reverse Hoogsteen base pair of an ASAM•U•U triple and PreQ1 is recognized by cytidine via trans-Watson–Crick interactions in an A•U•PreQ1•C quadruplet (Figure 5a,b Gilbert et al., 2008 L. Huang & Lilley, 2018 Kang et al., 2014 Liberman et al., 2013 Liberman et al., 2015 ). In the c-di-GMP-II riboswitch crystal structure, the two guanine bases of c-di-GMP are differentially recognized: One guanine engages in a minor-groove c-di-GMP•A-U base triple whereas the other guanine forms hydrogen bonds with nearby nucleotides and a hydrated magnesium ion (Figure 5c Smith et al., 2011 ). Interestingly, ligands that lack a nucleobase moiety can also be recognized by a triple helix. The one lone example, the guanidinium ion, is coordinated by a guanine in a noncanonical A•C-G base triple and another guanine in a G•A-U•C quadruplet (Figure 5d L. Huang et al., 2017 ). Because several hundred “undiscovered” riboswitch classes are predicted (P. J. McCown, Corbino, Stav, Sherlock, & Breaker, 2017 ), it will be interesting to learn if these riboswitches use triple helices to capture ligands, particularly ligands that do not have chemical moieties mimicking nucleotides.

With various binding modes of ligands and base triples being observed, it is not surprising that a broad range of equilibrium dissociation constants have been measured for the six riboswitch-ligand complexes: 200 pM to 2 nM for c-di-GMP-II, 60 μM for guanidine-III, 17.9 nM–6.6 μM for PreQ1-II, 6.5–900 nM for PreQ1-III, 670 nM for SAM-II, and 0.5–150 μM for SAM-V (Gilbert et al., 2008 L. Huang & Lilley, 2018 Kang et al., 2014 Lee, Baker, Weinberg, Sudarsan, & Breaker, 2010 Liberman et al., 2013 Liberman et al., 2015 P. J. McCown, Liang, Weinberg, & Breaker, 2014 Meyer, Roth, Chervin, Garcia, & Breaker, 2008 Poiata, Meyer, Ames, & Breaker, 2009 Sherlock & Breaker, 2017 ). Importantly, divalent ions can strengthen ligand-binding affinity up to 85-fold for the Streptococcus pneumoniae PreQ1-II riboswitch (Kang et al., 2014 ), a finding that prompts the question: To what extent is the triple helix (or pseudoknot) formed in the absence of ligand (see [Jones & Ferre-D'Amare, 2017 ] for review on ligand-binding pocket conformations)? Having three electronegative strands, triple helices are more stable in the presence of magnesium ions (Felsenfeld et al., 1957 ). Thus, it is difficult to parse whether ligands bind to a preformed triple helix or if ligand binding induces the formation of a triple helix. At least for the metX SAM-II riboswitch, both magnesium and ligand-binding seem to be required for the fully-folded ligand-bound conformation, although magnesium plays a critical role in pre-organizing the riboswitch toward a binding-competent state but it still lacks the triple helix in the absence of SAM (B. Chen, Zuo, Wang, & Dayie, 2012 Haller, Rieder, Aigner, Blanchard, & Micura, 2011 Roy et al., 2017 ). Similarly, two U•A-U base triples in the Lactobacillus rhamnosus PreQ1-II riboswitch include A nucleotides from the ribosome-binding site therefore, the triple helix forms after ligand binding (Aytenfisu, Liberman, Wedekind, & Mathews, 2015 Liberman et al., 2013 Souliere et al., 2013 Warnasooriya et al., 2019 ). Another consideration is that proteins could participate in the folding and conformational states of some riboswitches, although proteins are not required for ligand binding to the current experimentally validated riboswitches (Breaker, 2012 ). Importantly, the RNA triple helix can mediate both ligand binding and expression output for select riboswitches and the functional coupling is only beginning to be understood (Dutta & Wedekind, 2019 ).

Finally, it should be noted that riboswitches using a triple helix as a ligand-binding site are not coupled to a single mechanism for controlling gene expression. The ligand-bound forms of the c-di-GMP-II (Lee et al., 2010 ) and guanidine-III (Sherlock & Breaker, 2017 ) riboswitches turn ON translation while PreQ1-II (Dutta, Belashov, & Wedekind, 2018 Meyer et al., 2008 Neuner, Frener, Lusser, & Micura, 2018 Van Vlack, Topp, & Seeliger, 2017 ), PreQ1-III (Liberman et al., 2015 Van Vlack et al., 2017 ), metX SAM-II (Gilbert et al., 2008 ), and SAM-V riboswitches (L. Huang & Lilley, 2018 Poiata et al., 2009 ) turn OFF translation. Thus, there are instances where ligand binding leads to sequestration of the ribosome-binding site into a triple helix to turn OFF translation and other instances where the ribosome-binding site is released upon ligand binding, thereby turning ON translation. Proteins are involved in these processes to turn translation ON/OFF. Ribosomal protein S1 interacts with various conformations of the Thermoanaerobacter tengcongensis PreQ1-I riboswitch, a structure whose ligand-binding site resides in a minor-groove triple helix (Jenkins, Krucinska, McCarty, Bandarian, & Wedekind, 2011 Lund, Chatterjee, Daher, & Walter, 2019 ). Likewise, it will be interesting to learn if proteins can recognize riboswitches that possess a major-groove triple helix. Overall, riboswitches show how triple helices play an important role in sensing ligands and in regulating expression of prokaryotic genes.

3.4 RNA triple helix as a stability element

RNA triple helices have been cleverly co-opted by viruses to stabilize RNA. The first example was a triple helix found in the polyadenylated nuclear (PAN) RNA, which is a highly abundant nuclear lncRNA expressed by the Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus (KSHV) during the lytic phase of infection and plays various roles in gene expression (Conrad, 2016 Mitton-Fry et al., 2010 Sun, Lin, Gradoville, & Miller, 1996 Zhong, Wang, Herndier, & Ganem, 1996 ). The KSHV PAN RNA triple helix resides at the 3′ end and consists of two cis-acting RNA elements: A stem-loop structure containing a U-rich internal loop and a 3′-poly(A) tail (Figure 6a). An X-ray crystal structure of the KSHV PAN RNA triple helix shows the U-rich internal loop engaged with oligo A9, forming five U•A-U major-groove base triples and three A-minor base triples (Figure 6a Mitton-Fry et al., 2010 ). This extensive network of tertiary interactions protects the poly(A) tail and inhibits rapid nuclear RNA decay, establishing one mechanism by which PAN RNA accumulates to high levels in KSHV-infected cells (Conrad, 2016 Conrad, Mili, Marshall, Shu, & Steitz, 2006 Conrad, Shu, Uyhazi, & Steitz, 2007 Conrad & Steitz, 2005 Mitton-Fry et al., 2010 Sun et al., 1996 Zhong et al., 1996 ). Notably, the triple-helical structure itself, without any protein cofactors, is necessary and sufficient to inhibit deadenylation catalyzed by purified recombinant PARN (poly(A)-specific ribonuclease) in an in vitro system (Conrad et al., 2006 ). Collectively, the KSHV PAN RNA triple helix revealed a novel mechanism by which a viral lncRNA counteracted nuclear RNA decay. Because the mechanism was originally found in a viral lncRNA, this work prompted the question: Do other viral and host RNAs harbor triple-helical RNA stability elements?

Indeed, similar stability elements abound in nature, for more than 200 have been computationally identified in (a) lncRNAs expressed by dsDNA viruses, the MALAT1 lncRNA in vertebrates and likely the MENβ lncRNA in mammals (b) genomic ssRNA(+) from dicistroviruses and (c) transposable elements, including those that are transposase mRNAs from plants, fungi, slime mold, and stickleback fish retroviruses (Brown et al., 2012 Tycowski, Shu, Borah, Shi, & Steitz, 2012 Tycowski, Shu, & Steitz, 2016 Wilusz et al., 2012 B. Zhang et al., 2017 ). Among the 200+ stability elements predicted to date, the functionality of about 10 has been confirmed by their ability to stabilize heterologous intronless β-globin or GFP reporter mRNAs, a function that is likely mediated by formation of a triple helix (Brown et al., 2012 Tycowski et al., 2012 , 2016 Wilusz et al., 2012 ). More interestingly, structural analyses revealed that the stability elements can be classified as single or double domain, whereby each U-rich internal loop represents a domain (Figure 6a,b Tycowski et al., 2016 ). Most of the plant transposable elements possess a double-domain stability element (Tycowski et al., 2016 ). Here, the upper domain resembles the canonical KSHV PAN U-rich stem-loop whereas the lower domain shows two notable structural differences: A 3- or 4-nucleotide-long bulge and the A-minor stem interrupted by a bulge or an internal loop (Tycowski et al., 2016 ). Like the single-domain stability elements, the poly(A) tail is predicted to interact with both U-rich internal loops, although mutational studies indicate the upper domain of the TWIFB1_OSa structure is responsible for most stabilization activity (Figure 6b Tycowski et al., 2016 ). Currently, there is no 3D structure of a double-domain stability element therefore, it will be interesting to learn the structural significance of the upper domain over the lower domain and if the poly(A) tail engages in tertiary interactions with the stem connecting the upper and lower domains.

Among the 200+ stability elements discovered to date, the MALAT1 and MENβ structures are distinctly different from all others (Figure 6). The MALAT1 and MENβ lncRNAs undergo 3′-end processing by RNase P due to the presence of tRNA-like structures in their transcripts and the resulting mature forms of MALAT1 and MENβ terminate with genomically encoded A-rich tracts rather than 3′-poly(A) tails (Sunwoo et al., 2009 Wilusz, Freier, & Spector, 2008 ). The single-domain MALAT1 and MENβ stability elements have U-rich internal loops uniquely interrupted by G and C nucleotides that interact with the complementary nucleotides in the downstream A-rich tract so that the triple helices have a blunt end, rather than a 3′-poly(A) tail overhang predicted for others (Figure 6 Brown et al., 2012 , 2014 Wilusz et al., 2012 ). The blunt-ended triple helix of MALAT1 effectively inhibits the rapid phase of nuclear RNA decay whereas the KSHV PAN RNA triple helix only reduces the rapid phase according to a cell-based intronless β-globin reporter decay assay in HeLa-TetOff cells (Brown et al., 2014 Conrad et al., 2006 ). However, the decay machinery for the MALAT1 and KSHV PAN triple helices may be different. While KSHV PAN undergoes a deadenylation-dependent decay due to its poly(A) tail, the 3′ end of MALAT1 is sequestered into a blunt-ended triple helix therefore, it may first require a helicase, such as DHX9, to disrupt the triple helix and/or undergo oligouridylation (Brown et al., 2016b Jain, Bacolla, Chakraborty, Grosse, & Vasquez, 2010 Wilusz et al., 2012 ). Moreover, the MALAT1 triple helix interacts with a protein, methyltransferase-like protein 16 (METTL16 Brown et al., 2016b Warda et al., 2017 ). METTL16 is an N 6 -methyladenosine (m 6 A) RNA methyltransferase and how the METTL16-triple helix complex affects the half-life of MALAT1 remains unknown as well as the biological function of the complex itself (Pendleton et al., 2017 ). A weak m 6 A site has been detected in the upper stem of the MALAT1 stability element using miCLIP (m 6 A individual-nucleotide resolution crosslinking and RNA immunoprecipitation), although it is unknown if METTL16 catalyzes formation of this m 6 A mark and/or recognizes it (Linder et al., 2015 Pendleton et al., 2017 ). Lastly, another unique function of the MALAT1 triple helix is that it upregulates translation in the context of a GFP reporter system (Wilusz et al., 2012 ). Therefore, understanding the mechanism of translational upregulation mediated by a triple helix may potentially lead to the discovery of novel triple helices having roles in the cytoplasm.

In summary, triple-helical RNA stability elements exist for multiple classes of RNAs, including those that localize to the nucleus and cytoplasm as well as those expressed by viruses, animals, fungi, and plants. Understanding the structure and function of these unique stability elements has led to novel experimental tools as well as drug targets. For example, the MALAT1 triple helix has been used to study the functional role of the poly(A) tail in transposons and used as a stability tool for RNAs in cell-based systems (Doucet, Wilusz, Miyoshi, Liu, & Moran, 2015 Nissim, Perli, Fridkin, Perez-Pinera, & Lu, 2014 Vogan et al., 2016 Zhan, Xie, Zhou, Liu, & Huang, 2018 ). Moreover, MALAT1 is upregulated in multiple cancer types and its triple helix is required for this accumulation, making it a potential drug target (Gutschner, Hammerle, & Diederichs, 2013 ). Most triple-helical RNA stability elements remain uncharacterized and likely hold the potential to revealing more unique insights into the roles of RNA triple helices in biology.

3.5 Other RNA triple helices

Other RNA triple helices containing major-groove base triples have been observed. Notably, two consecutive U•A-U base triples were observed in an NMR structure of the 7SK stem-loop 1 in complex with a peptide representing the RNA-binding domain of the HIV Tat protein (Pham et al., 2018 ). Interestingly, arginine sandwich motifs recognize the Hoogsteen face of G in C-G base pairs flanking the U•A-U base triples. A similar mode of recognition of a C-G base pair adjacent to a U•A-U base triple in HIV-1 TAR RNA has been demonstrated for arginine residues in HIV Tat and a lab-evolved RNA recognition motif (Belashov et al., 2018 Pham et al., 2018 ). Also noteworthy, an X-ray crystal structure of Campylobacter jejuni Cas9 in complex with guide RNA and DNA revealed an unusual arrangement of a U•A•G major-groove base triple and an A•A-U minor-groove base triple being interrupted by a base quintuple and an extrahelical residue, A63 (Yamada et al., 2017 ). Parce que C. jejuni tracrRNA (trans-activating CRISPR RNA) lacks two consecutive major-groove base triples, it is not included in the table of triple helices (Table 1). Nonetheless, it is notable that Cas9 does not establish base triple-specific interactions except for an arginine-phosphate backbone contact (Yamada et al., 2017 ). Rather, the extrahelical base of A63 stacks with a histidine residue and the N1 of A63 forms a hydrogen bond with an asparagine residue (Yamada et al., 2017 ). Therefore, it is possible that proteins recognize flanking sequences and structures of triple helices instead of the triple helix itself.

Additional RNA triple helices have been reported, although some have only partial triple helix character or there is no 3D structure and/or cell-based compensatory mutagenesis studies performed to validate triple helix. In vitro-selected aptamers having base triples were not discussed in this review because they are non-natural RNAs. Finally, R•D-D triple helices comprised of noncoding RNA and genomic DNA were not discussed because this review is focused on triple helices in which all three strands are RNA.


Immune cells within the tumor microenvironment: Biological functions and roles in cancer immunotherapy

The immune cells within the tumor microenvironment (TME) play important roles in tumorigenesis. It has been known that these tumor associated immune cells may possess tumor-antagonizing or tumor-promoting functions. Although the tumor-antagonizing immune cells within TME tend to target and kill the cancer cells in the early stage of tumorigenesis, the cancer cells seems to eventually escape from immune surveillance and even inhibit the cytotoxic function of tumor-antagonizing immune cells through a variety of mechanisms. The immune evasion capability, as a new hallmark of cancer, accidently provides opportunities for new strategies of cancer therapy, namely harnessing the immune cells to battle the cancer cells. Recently, the administrations of immune checkpoint modulators (represented by anti-CTLA4 and anti-PD antibodies) and adoptive immune cells (represented by CAR-T) have exhibited unexpected antitumor effect in multiple types of cancer, bringing a new era for cancer therapy. Here, we review the biological functions of immune cells within TME and their roles in cancer immunotherapy, and discuss the perspectives of the basic studies for improving the effectiveness of the clinical use.

Mots clés: Cancer immunotherapy Immune cells Tumor microenvironment.


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