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Comment les scientifiques déterminent-ils la nature des ions traversant un canal/porteur/pompe ?

Comment les scientifiques déterminent-ils la nature des ions traversant un canal/porteur/pompe ?


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Le NCE (Sodium Calcium Exchanger) transporte 3 Na+ à l'intérieur de la cellule pour 1 Ca2+ à l'extérieur. Comment avons-nous compris cela, et d'autres mécanismes de ce genre? S'il s'agissait d'une protéine, nous pourrions la marquer avec GFP. Mais ce sont des ions. Je suppose que regarder les potentiels n'est pas très informatif non plus ; K+ et Na+ ont la même charge. Qu'est-ce qui est fait, expérimentalement?


Gène CFTR

Les CFTR gène fournit des instructions pour fabriquer une protéine appelée régulateur de conductance transmembranaire de la mucoviscidose. Cette protéine fonctionne comme un canal à travers la membrane des cellules qui produisent du mucus, de la sueur, de la salive, des larmes et des enzymes digestives. Le canal transporte des particules chargées négativement appelées ions chlorure dans et hors des cellules. Le transport des ions chlorure aide à contrôler le mouvement de l'eau dans les tissus, ce qui est nécessaire à la production d'un mucus fin et fluide. Le mucus est une substance glissante qui lubrifie et protège la muqueuse des voies respiratoires, du système digestif, du système reproducteur et d'autres organes et tissus.

La protéine CFTR régule également la fonction d'autres canaux, tels que ceux qui transportent des particules chargées positivement appelées ions sodium à travers les membranes cellulaires. Ces canaux sont nécessaires au fonctionnement normal d'organes tels que les poumons et le pancréas.


5.2 Transport passif

La prévention de la déshydratation est importante pour les plantes et les animaux. L'eau se déplace à travers les membranes plasmiques par un type de diffusion spécifique appelé osmose. Le gradient de concentration d'eau à travers une membrane est inversement proportionnel à la concentration de solutés, c'est-à-dire que l'eau se déplace à travers des protéines de canal appelées aquaporines d'une concentration d'eau plus élevée à une concentration d'eau plus faible. La concentration de soluté à l'extérieur et à l'intérieur de la cellule influence le taux d'osmose. La tonicité décrit comment la concentration extracellulaire de solutés peut modifier le volume d'une cellule en affectant l'osmose, souvent en corrélation avec l'osmolarité de la solution, c'est-à-dire la concentration totale de soluté de la solution. Dans une situation hypotonique, parce que le liquide extracellulaire a une concentration de solutés plus faible (osmolarité plus faible) que le liquide à l'intérieur de la cellule, l'eau pénètre dans la cellule, la faisant gonfler et éventuellement éclater. Les parois cellulaires des plantes les empêchent d'éclater, mais les cellules animales, comme les globules rouges, peuvent se lyser. Lorsqu'une cellule est placée dans une solution hypertonique, l'eau quitte la cellule car la cellule a un potentiel hydrique plus élevé que la solution extracellulaire. Lorsque les concentrations de soluté sont égales des deux côtés de la membrane (isotonique), aucun mouvement net d'eau dans ou hors de la cellule ne se produit. Les organismes vivants ont développé une variété de façons de maintenir l'équilibre osmotique, par exemple, les poissons marins sécrètent un excès de sel par les branchies pour maintenir une homéostasie dynamique.

Les informations présentées et les exemples mis en évidence dans la section soutiennent les concepts et les objectifs d'apprentissage décrits dans la grande idée 2 du cadre du programme de biologie AP ® . Les objectifs d'apprentissage énumérés dans le cadre du programme d'études fournissent une base transparente pour le cours de biologie AP ®, une expérience de laboratoire basée sur l'enquête, des activités pédagogiques et des questions d'examen AP ®. Un objectif d'apprentissage fusionne le contenu requis avec une ou plusieurs des sept pratiques scientifiques.

Connaissances essentielles 2.B.2 La croissance et l'homéostasie dynamique sont maintenues par le mouvement constant des molécules à travers les membranes.
Pratique scientifique 1.4 L'étudiant peut utiliser des représentations et des modèles pour analyser des situations ou résoudre des problèmes qualitativement et quantitativement.
Pratique scientifique 3.1 L'élève peut poser des questions scientifiques.
Objectif d'apprentissage 2.11 L'étudiant est capable de construire des modèles qui relient le mouvement des molécules à travers les membranes avec la structure et la fonction des membranes.
Connaissances essentielles 2.B.2 La croissance et l'homéostasie dynamique sont maintenues par le mouvement constant des molécules à travers les membranes.
Pratique scientifique 1.4 L'étudiant peut utiliser des représentations et des modèles pour analyser des situations ou résoudre des problèmes qualitativement et quantitativement.
Pratique scientifique 3.1 L'élève peut poser des questions scientifiques.
Objectif d'apprentissage 2.12 L'étudiant est capable d'utiliser des représentations et des modèles pour analyser une situation ou résoudre des problèmes qualitativement et quantitativement afin de déterminer si l'homéostasie dynamique est maintenue par le mouvement actif des molécules à travers les membranes.

Soutien aux enseignants

Discutez avec les élèves de ce que sont les membranes semi-perméables et de la façon dont les membranes artificielles peuvent être utilisées pour purifier l'eau par osmose inverse. Pour plus d'informations, allez ici.

Les élèves peuvent penser que diffusion et osmose sont identiques et que les termes sont interchangeables. Discutez avec les élèves de la différence entre diffusion et osmose. La diffusion est le mouvement des solutés d'une zone de concentration élevée vers une zone de concentration plus faible. L'osmose est le mouvement des molécules d'eau libres à travers une membrane semi-perméable en fonction du gradient de concentration de l'eau à travers la membrane, qui est inversement proportionnel à la concentration des solutés. En diffusion, les solutés se déplacent. En osmose, l'eau se déplace. Dans les deux cas, le but est le même : équilibrer la concentration en soluté.

Les questions du défi de la pratique scientifique contiennent des questions de test supplémentaires pour cette section qui vous aideront à vous préparer à l'examen AP. Ces questions portent sur les normes suivantes :
[APLO 2.25][APLO 2.27][APLO 4.3][APLO 4.17][APLO1.9] [APLO 2.16][APLO 2.17][APLO 2.18]

Les membranes plasmiques doivent permettre à certaines substances d'entrer et de sortir d'une cellule, et empêcher certaines matières nocives d'entrer et certaines matières essentielles d'en sortir. En d'autres termes, les membranes plasmiques sont sélectivement perméables - elles laissent passer certaines substances, mais pas d'autres. S'ils perdaient cette sélectivité, la cellule ne pourrait plus se maintenir et elle serait détruite. Certaines cellules nécessitent de plus grandes quantités de substances spécifiques que d'autres cellules, elles doivent avoir un moyen d'obtenir ces matériaux à partir de fluides extracellulaires. Cela peut se produire passivement, car certains matériaux se déplacent d'avant en arrière, ou la cellule peut avoir des mécanismes spéciaux qui facilitent le transport. Certains matériaux sont si importants pour une cellule qu'elle dépense une partie de son énergie à hydrolyser l'adénosine triphosphate (ATP) pour obtenir ces matériaux. Les globules rouges utilisent une partie de leur énergie pour cela. La plupart des cellules dépensent la majorité de leur énergie pour maintenir un déséquilibre des ions sodium et potassium entre l'intérieur et l'extérieur de la cellule.

Les formes les plus directes de transport membranaire sont passives. Le transport passif est un phénomène naturel et ne nécessite pas que la cellule exerce son énergie pour accomplir le mouvement. Dans le transport passif, les substances se déplacent d'une zone de concentration plus élevée vers une zone de concentration plus faible. Un espace physique dans lequel il existe une gamme de concentrations d'une seule substance est dit avoir un gradient de concentration.

Perméabilité sélective

Les membranes plasmiques sont asymétriques : l'intérieur de la membrane n'est pas identique à l'extérieur de la membrane. En fait, il existe une différence considérable entre la matrice de phospholipides et de protéines entre les deux feuillets qui forment une membrane. A l'intérieur de la membrane, certaines protéines servent à ancrer la membrane aux fibres du cytosquelette. Il existe des protéines périphériques à l'extérieur de la membrane qui se lient aux éléments de la matrice extracellulaire. Les glucides, liés aux lipides ou aux protéines, se trouvent également à la surface extérieure de la membrane plasmique. Ces complexes glucidiques aident la cellule à lier les substances dont la cellule a besoin dans le liquide extracellulaire. Cela ajoute considérablement à la nature sélective des membranes plasmiques (figure 5.7).

Rappelons que les membranes plasmiques sont amphiphiles : elles ont des régions hydrophiles et hydrophobes. Cette caractéristique facilite le mouvement de certains matériaux à travers la membrane et entrave le mouvement des autres. Un matériau liposoluble à faible poids moléculaire peut facilement glisser à travers le noyau lipidique hydrophobe de la membrane. Des substances telles que les vitamines liposolubles A, D, E et K traversent facilement les membranes plasmiques du tube digestif et d'autres tissus. Les médicaments et les hormones liposolubles pénètrent également facilement dans les cellules et sont facilement transportés dans les tissus et les organes du corps. De même, les molécules d'oxygène et de dioxyde de carbone n'ont pas de charge et traversent donc les membranes par simple diffusion.

Les substances polaires posent des problèmes pour la membrane. Alors que certaines molécules polaires se connectent facilement à l'extérieur d'une cellule, elles ne peuvent pas facilement traverser le noyau lipidique de la membrane plasmique. De plus, alors que les petits ions pourraient facilement glisser à travers les espaces de la mosaïque de la membrane, leur charge les empêche de le faire. Les ions tels que le sodium, le potassium, le calcium et le chlorure doivent avoir des moyens spéciaux de pénétrer les membranes plasmiques. Les sucres simples et les acides aminés ont également besoin d'aide pour le transport à travers les membranes plasmiques, réalisé par diverses protéines transmembranaires (canaux).

La diffusion

La diffusion est un processus passif de transport. Une seule substance a tendance à se déplacer d'une zone de forte concentration à une zone de faible concentration jusqu'à ce que la concentration soit égale dans un espace. Vous connaissez la diffusion de substances dans l'air. Par exemple, pensez à quelqu'un qui ouvre une bouteille d'ammoniac dans une pièce remplie de monde. Le gaz ammoniac est à sa concentration la plus élevée dans la bouteille, sa concentration la plus faible se situe aux bords de la pièce. La vapeur d'ammoniac se diffusera ou s'éloignera de la bouteille et progressivement, de plus en plus de personnes sentiront l'ammoniac au fur et à mesure qu'il se répand. Les matériaux se déplacent dans le cytosol de la cellule par diffusion, et certains matériaux se déplacent à travers la membrane plasmique par diffusion (Figure 5.8). La diffusion ne dépense aucune énergie. Au contraire, les gradients de concentration sont une forme d'énergie potentielle, dissipée au fur et à mesure que le gradient est éliminé.

Chaque substance séparée dans un milieu, tel que le liquide extracellulaire, a son propre gradient de concentration, indépendant des gradients de concentration d'autres matériaux. De plus, chaque substance diffusera selon ce gradient. Au sein d'un système, il y aura différents taux de diffusion des différentes substances dans le milieu.

Facteurs qui affectent la diffusion

Les molécules se déplacent constamment de manière aléatoire, à une vitesse qui dépend de leur masse, de leur environnement et de la quantité d'énergie thermique qu'elles possèdent, elle-même fonction de la température. Ce mouvement rend compte de la diffusion des molécules à travers le milieu dans lequel elles sont localisées. Une substance aura tendance à se déplacer dans n'importe quel espace à sa disposition jusqu'à ce qu'elle soit uniformément répartie dans tout l'espace. Une fois qu'une substance a complètement diffusé à travers un espace, en supprimant son gradient de concentration, les molécules continueront de se déplacer dans l'espace, mais il n'y aura pas de rapporter mouvement du nombre de molécules d'une zone à une autre. Cette absence de gradient de concentration dans lequel il n'y a pas de mouvement net d'une substance est connue sous le nom d'équilibre dynamique. Alors que la diffusion va de l'avant en présence d'un gradient de concentration d'une substance, plusieurs facteurs affectent le taux de diffusion.

  • Etendue du gradient de concentration : Plus la différence de concentration est grande, plus la diffusion est rapide. Plus la distribution du matériau se rapproche de l'équilibre, plus la vitesse de diffusion devient lente.
  • Masse des molécules diffusant : Les molécules plus lourdes se déplacent plus lentement donc, elles diffusent plus lentement. L'inverse est vrai pour les molécules plus légères.
  • Température : Des températures plus élevées augmentent l'énergie et donc le mouvement des molécules, augmentant le taux de diffusion. Des températures plus basses diminuent l'énergie des molécules, diminuant ainsi le taux de diffusion.
  • Densité du solvant : à mesure que la densité d'un solvant augmente, la vitesse de diffusion diminue. Les molécules ralentissent car elles ont plus de difficulté à traverser le milieu plus dense. Si le milieu est moins dense, la diffusion augmente. Parce que les cellules utilisent principalement la diffusion pour déplacer les matériaux dans le cytoplasme, toute augmentation de la densité du cytoplasme inhibera le mouvement des matériaux. Un exemple de ceci est une personne souffrant de déshydratation. À mesure que les cellules du corps perdent de l'eau, le taux de diffusion diminue dans le cytoplasme et les fonctions des cellules se détériorent. Les neurones ont tendance à être très sensibles à cet effet. La déshydratation conduit fréquemment à l'inconscience et éventuellement au coma en raison de la diminution du taux de diffusion dans les cellules.
  • Solubilité : Comme indiqué précédemment, les matériaux non polaires ou liposolubles traversent les membranes plasmiques plus facilement que les matériaux polaires, ce qui permet une vitesse de diffusion plus rapide.
  • Surface et épaisseur de la membrane plasmique : Une surface accrue augmente la vitesse de diffusion, alors qu'une membrane plus épaisse la réduit.
  • Distance parcourue : Plus la distance qu'une substance doit parcourir est grande, plus la vitesse de diffusion est lente. Cela place une limite supérieure sur la taille des cellules. Une grande cellule sphérique mourra parce que les nutriments ou les déchets ne peuvent pas atteindre ou quitter le centre de la cellule, respectivement. Par conséquent, les cellules doivent être soit de petite taille, comme dans le cas de nombreux procaryotes, soit aplaties, comme chez de nombreux eucaryotes unicellulaires.

Une variante de la diffusion est le processus de filtration. Dans la filtration, le matériau se déplace en fonction de son gradient de concentration à travers une membrane, parfois la vitesse de diffusion est augmentée par la pression, ce qui entraîne une filtration plus rapide des substances. Cela se produit dans le rein, où la pression artérielle force de grandes quantités d'eau et les substances dissoutes associées, ou solutés, hors du sang et dans les tubules rénaux. La vitesse de diffusion dans ce cas dépend presque totalement de la pression. L'un des effets de l'hypertension artérielle est l'apparition de protéines dans l'urine, qui sont « expulsées » par la pression anormalement élevée.

Transport facilité

Dans le transport facilité, également appelé diffusion facilitée, les matériaux diffusent à travers la membrane plasmique à l'aide de protéines membranaires. Il existe un gradient de concentration qui permettrait à ces matériaux de se diffuser dans la cellule sans dépenser d'énergie cellulaire. Cependant, ces matériaux sont des molécules polaires qui sont repoussées par les parties hydrophobes de la membrane cellulaire. Les protéines de transport facilitées protègent ces matériaux de la force répulsive de la membrane, leur permettant de diffuser dans la cellule.

Le matériau transporté est d'abord attaché à des récepteurs de protéines ou de glycoprotéines sur la surface extérieure de la membrane plasmique. Cela permet d'éliminer le matériel nécessaire à la cellule du liquide extracellulaire. Les substances sont ensuite transmises à des protéines intégrales spécifiques qui facilitent leur passage. Certaines de ces protéines intégrales sont des collections de feuilles plissées bêta qui forment un pore ou un canal à travers la bicouche phospholipidique. D'autres sont des protéines porteuses qui se lient à la substance et facilitent sa diffusion à travers la membrane.

Canaux

Les protéines intégrales impliquées dans le transport facilité sont collectivement appelées protéines de transport et elles fonctionnent soit comme des canaux pour le matériel, soit comme des supports. Dans les deux cas, ce sont des protéines transmembranaires. Les canaux sont spécifiques à la substance transportée. Les protéines de canal ont des domaines hydrophiles exposés aux fluides intracellulaires et extracellulaires, elles ont en outre un canal hydrophile à travers leur noyau qui fournit une ouverture hydratée à travers les couches membranaires (Figure 5.9). Le passage à travers le canal permet aux composés polaires d'éviter la couche centrale non polaire de la membrane plasmique qui ralentirait ou empêcherait autrement leur entrée dans la cellule. Les aquaporines sont des protéines de canal qui permettent à l'eau de traverser la membrane à un débit très élevé.

Les protéines du canal sont soit ouvertes à tout moment, soit elles sont « fermées », ce qui contrôle l'ouverture du canal. La fixation d'un ion particulier à la protéine du canal peut contrôler l'ouverture, ou d'autres mécanismes ou substances peuvent être impliqués. Dans certains tissus, les ions sodium et chlorure passent librement à travers des canaux ouverts, alors que dans d'autres tissus, une porte doit être ouverte pour permettre le passage. Un exemple de ceci se produit dans le rein, où les deux formes de canaux se trouvent dans différentes parties des tubules rénaux. Les cellules impliquées dans la transmission des impulsions électriques, telles que les cellules nerveuses et musculaires, ont des canaux fermés pour le sodium, le potassium et le calcium dans leurs membranes. L'ouverture et la fermeture de ces canaux modifient les concentrations relatives sur les côtés opposés de la membrane de ces ions, ce qui facilite la transmission électrique le long des membranes (dans le cas des cellules nerveuses) ou dans la contraction musculaire (dans le cas des cellules musculaires).

Protéines porteuses

Un autre type de protéine enchâssée dans la membrane plasmique est une protéine porteuse. Cette protéine bien nommée se lie à une substance et, ce faisant, déclenche un changement de sa propre forme, déplaçant la molécule liée de l'extérieur de la cellule vers son intérieur (Figure 5.10) en fonction du gradient, la matière peut se déplacer dans le sens inverse. direction. Les protéines porteuses sont typiquement spécifiques d'une seule substance. Cette sélectivité s'ajoute à la sélectivité globale de la membrane plasmique. Le mécanisme exact du changement de forme est mal compris. Les protéines peuvent changer de forme lorsque leurs liaisons hydrogène sont affectées, mais cela peut ne pas expliquer complètement ce mécanisme. Chaque protéine porteuse est spécifique à une substance, et il existe un nombre fini de ces protéines dans n'importe quelle membrane. Cela peut entraîner des problèmes pour transporter suffisamment de matériau pour que la cellule fonctionne correctement. Lorsque toutes les protéines sont liées à leurs ligands, elles sont saturées et la vitesse de transport est à son maximum. L'augmentation du gradient de concentration à ce point n'entraînera pas une augmentation de la vitesse de transport.

Un exemple de ce processus se produit dans le rein. Le glucose, l'eau, les sels, les ions et les acides aminés nécessaires à l'organisme sont filtrés dans une partie du rein. Ce filtrat, qui comprend du glucose, est ensuite réabsorbé dans une autre partie du rein. Comme il n'y a qu'un nombre fini de protéines porteuses du glucose, s'il y a plus de glucose que les protéines ne peuvent en supporter, l'excès n'est pas transporté et il est excrété du corps dans l'urine. Chez une personne diabétique, cela est décrit comme « déverser du glucose dans l'urine ». Un groupe différent de protéines porteuses, appelées protéines de transport du glucose, ou GLUTs, est impliquée dans le transport du glucose et d'autres sucres hexoses à travers les membranes plasmiques dans le corps.

Les protéines de canal et de support transportent le matériel à des vitesses différentes. Les protéines de canal transportent beaucoup plus rapidement que les protéines porteuses.Les protéines de canal facilitent la diffusion à un rythme de dizaines de millions de molécules par seconde, tandis que les protéines porteuses fonctionnent à un rythme de mille à un million de molécules par seconde.

Osmose

L'osmose est le mouvement des molécules d'eau libres à travers une membrane semi-perméable en fonction du gradient de concentration de l'eau à travers la membrane, qui est inversement proportionnel à la concentration des solutés. Alors que la diffusion transporte le matériel à travers les membranes et à l'intérieur des cellules, l'osmose transporte seulement de l'eau à travers une membrane et la membrane limite la diffusion des solutés dans l'eau. Sans surprise, les aquaporines qui facilitent le mouvement de l'eau jouent un rôle important dans l'osmose, plus particulièrement dans les globules rouges et les membranes des tubules rénaux.

Mécanisme

L'osmose est un cas particulier de diffusion. L'eau, comme d'autres substances, passe d'une zone à forte concentration de molécules d'eau libres à une zone à faible concentration de molécules d'eau libres. Une question évidente est qu'est-ce qui fait bouger l'eau? Imaginez un bécher avec une membrane semi-perméable séparant les deux côtés ou moitiés (Figure 5.11). Des deux côtés de la membrane, le niveau d'eau est le même, mais il existe différentes concentrations d'une substance dissoute, ou soluté, qui ne peut pas traverser la membrane (sinon les concentrations de chaque côté seraient équilibrées par le soluté traversant la membrane). Si le volume de la solution des deux côtés de la membrane est le même, mais que les concentrations de soluté sont différentes, alors il y a différentes quantités d'eau, le solvant, de chaque côté de la membrane.

Pour illustrer cela, imaginez deux verres d'eau pleins. L'un contient une seule cuillère à café de sucre, tandis que le second contient un quart de tasse de sucre. Si le volume total des solutions dans les deux tasses est le même, quelle tasse contient le plus d'eau ? Parce que la grande quantité de sucre dans la deuxième tasse prend beaucoup plus de place que la cuillère à café de sucre dans la première tasse, la première tasse contient plus d'eau.

Revenant à l'exemple du bécher, rappelons qu'il a un mélange de solutés de chaque côté de la membrane. Un principe de diffusion est que les molécules se déplacent et se répandront uniformément dans le milieu si elles le peuvent. Cependant, seul le matériau capable de traverser la membrane diffusera à travers celle-ci. Dans cet exemple, le soluté ne peut pas diffuser à travers la membrane, mais l'eau le peut. L'eau a un gradient de concentration dans ce système. Ainsi, l'eau diffusera vers le bas de son gradient de concentration, traversant la membrane du côté où elle est la moins concentrée. Cette diffusion de l'eau à travers la membrane - l'osmose - se poursuivra jusqu'à ce que le gradient de concentration de l'eau s'annule ou jusqu'à ce que la pression hydrostatique de l'eau équilibre la pression osmotique. L'osmose se produit constamment dans les systèmes vivants.

L'exemple du bécher se produit ici dans un système ouvert où le volume de fluide peut augmenter et diminuer librement. Les cellules, quant à elles, sont composées de protéines et d'autres substances incorporées dans le cytoplasme aqueux. Ces substances pourraient être considérées comme des solutés aux fins de prédiction de l'osmose. La membrane cellulaire conserve la plupart des protéines et autres substances à l'intérieur de la cellule, ce qui fait que la cellule a une osmolarité plus élevée que l'eau pure.

Supposons que vous réalisiez une expérience dans laquelle vous placez des globules rouges dans un environnement d'eau pure. Que pensez-vous qu'il arriverait aux cellules? Parce que la concentration de soluté est plus élevée dans le globule rouge que dans le bécher, l'eau se précipiterait dans le globule rouge. Que pensez-vous qu'il adviendrait du globule rouge, étant donné que sa membrane cellulaire est constituée d'une surface fixe ? Il est probable que les globules rouges subissent une hémolyse, où ils gonflent d'eau et éclatent. Il faut cependant noter que la plupart des cellules ont des mécanismes pour les empêcher de prendre trop d'eau. Cependant, les globules rouges manquent de ces contrôles, ce qui les rend idéaux pour les études d'osmolarité.

Il s'agit d'une considération importante pour les cliniciens qui administrent des médicaments par voie intraveineuse. Comment le médicament devrait-il être formulé, en termes d'osmolarité, pour empêcher les globules rouges de subir une hémolyse ? Afin d'empêcher l'hémolyse des globules rouges dans le sang, les médicaments sont généralement formulés dans une solution isotonique avec le sang pour maintenir l'osmolarité.

Tonicité

La tonicité décrit comment une solution extracellulaire peut modifier le volume d'une cellule en affectant l'osmose. La tonicité d'une solution est souvent directement corrélée à l'osmolarité de la solution. L'osmolarité décrit la concentration totale de soluté de la solution. Une solution à faible osmolarité a un plus grand nombre de molécules d'eau par rapport au nombre de particules de soluté, une solution à osmolarité élevée a moins de molécules d'eau par rapport aux particules de soluté. Dans une situation dans laquelle des solutions de deux osmolarités différentes sont séparées par une membrane perméable à l'eau, mais pas au soluté, l'eau se déplacera du côté de la membrane avec une osmolarité inférieure (et plus d'eau) vers le côté avec une osmolarité plus élevée (et moins d'eau). Cet effet a du sens si vous vous souvenez que le soluté ne peut pas traverser la membrane, et donc le seul composant du système qui peut se déplacer - l'eau - se déplace le long de son propre gradient de concentration. Une distinction importante qui concerne les systèmes vivants est que l'osmolarité mesure le nombre de particules (qui peuvent être des molécules) dans une solution. Par conséquent, une solution trouble avec des cellules peut avoir une osmolarité plus faible qu'une solution claire, si la deuxième solution contient plus de molécules dissoutes qu'il n'y a de cellules.

Solutions hypotoniques

Trois termes - hypotonique, isotonique et hypertonique - sont utilisés pour relier l'osmolarité d'une cellule à l'osmolarité du liquide extracellulaire qui contient les cellules. Dans une situation hypotonique, le liquide extracellulaire a une osmolarité inférieure à celle du liquide à l'intérieur de la cellule et l'eau pénètre dans la cellule. (Dans les systèmes vivants, le point de référence est toujours le cytoplasme, donc le préfixe hypo- signifie que le liquide extracellulaire a une concentration en solutés plus faible, ou une osmolarité plus faible, que le cytoplasme cellulaire.) Cela signifie également que le liquide extracellulaire a une concentration en eau plus élevée dans la solution que la cellule. Dans cette situation, l'eau suivra son gradient de concentration et entrera dans la cellule.

Solutions hypertoniques

Comme pour une solution hypertonique, le préfixe hyper- se réfère au fluide extracellulaire ayant une osmolarité plus élevée que le cytoplasme de la cellule, par conséquent, le fluide contient moins d'eau que la cellule. Parce que la cellule a une concentration d'eau relativement plus élevée, l'eau quittera la cellule.

Solutions isotoniques

Dans une solution isotonique, le liquide extracellulaire a la même osmolarité que la cellule. Si l'osmolarité de la cellule correspond à celle du liquide extracellulaire, il n'y aura pas de mouvement net d'eau à l'intérieur ou à l'extérieur de la cellule, bien que l'eau continue d'entrer et de sortir. Les cellules sanguines et les cellules végétales dans les solutions hypertoniques, isotoniques et hypotoniques prennent des apparences caractéristiques (figure 5.12).

Lien vers l'apprentissage

Pour une vidéo illustrant le processus de diffusion dans les solutions, visitez ce site.


Instrumentation

Injection d'échantillon

Un port d'échantillon est nécessaire pour introduire l'échantillon en tête de colonne. Les techniques d'injection modernes utilisent souvent des orifices d'échantillonnage chauffés à travers lesquels l'échantillon peut être injecté et vaporisé de manière quasi simultanée. Une microseringue calibrée est utilisée pour délivrer un volume d'échantillon de l'ordre de quelques microlitres à travers un septum en caoutchouc et dans la chambre de vaporisation. La plupart des séparations ne nécessitent qu'une petite fraction du volume d'échantillon initial et un diviseur d'échantillon est utilisé pour diriger l'échantillon excédentaire vers les déchets. Les chromatographes en phase gazeuse commerciaux permettent souvent des injections avec et sans division lors de l'alternance entre les colonnes remplies et les colonnes capillaires. La chambre de vaporisation est généralement chauffée à 50 °C au-dessus du point d'ébullition le plus bas de l'échantillon et ensuite mélangée avec le gaz porteur pour transporter l'échantillon dans la colonne.

Figure 1 : Une vue en coupe transversale d'un injecteur direct de vaporisateur microflash.

Gaz vecteur

Le gaz vecteur joue un rôle important et varie selon le GC utilisé. Le gaz vecteur doit être sec, exempt d'oxygène et de phase mobile chimiquement inerte utilisé en chromatographie en phase gazeuse. L'hélium est le plus couramment utilisé car il est plus sûr, mais comparable à l'hydrogène en termes d'efficacité, a une plus grande plage de débits et est compatible avec de nombreux détecteurs. L'azote, l'argon et l'hydrogène sont également utilisés en fonction des performances souhaitées et du détecteur utilisé. L'hydrogène et l'hélium, qui sont couramment utilisés sur la plupart des détecteurs traditionnels tels que l'ionisation de flamme (FID), la conductivité thermique (TCD) et la capture d'électrons (ECD), offrent un temps d'analyse plus court et des températures d'élution plus basses de l'échantillon en raison de débits plus élevés et de faible poids moléculaire. Par exemple, l'hydrogène ou l'hélium en tant que gaz porteur donne la sensibilité la plus élevée avec le TCD car la différence de conductivité thermique entre la vapeur organique et l'hydrogène/hélium est supérieure à celle des autres gaz porteurs. D'autres détecteurs tels que la spectroscopie de masse, utilisent de l'azote ou de l'argon qui ont un bien meilleur avantage que l'hydrogène ou l'hélium en raison de leurs poids moléculaires plus élevés, ce qui améliore l'efficacité de la pompe à vide.

Tous les gaz vecteurs sont disponibles dans des réservoirs sous pression et des régulateurs de pression, des jauges et des débitmètres sont utilisés pour contrôler méticuleusement le débit du gaz. La plupart des alimentations en gaz utilisées doivent se situer entre 99,995% et 99,9995% de pureté et contenir de faibles niveaux (< 0,5 ppm) d'oxygène et d'hydrocarbures totaux dans le réservoir. Le système de gaz vecteur contient un tamis moléculaire pour éliminer l'eau et d'autres impuretés. Les pièges sont une autre option pour garder le système pur et optimal, sensible et éliminer les traces d'eau et d'autres contaminants. Une régulation de pression à deux étages est nécessaire pour minimiser les coups de bélier et surveiller le débit du gaz. Pour surveiller le débit du gaz, un régulateur de débit ou de pression était également requis à la fois sur le réservoir et sur l'entrée de gaz du chromatographe. Cela s'applique à un type de gaz différent qui utilisera un type de régulateur différent. Le gaz porteur est préchauffé et filtré avec un tamis moléculaire pour éliminer les impuretés et l'eau avant d'être introduit dans la chambre de vaporisation. Un gaz porteur est généralement requis dans le système GC pour traverser l'injecteur et pousser les composants gazeux de l'échantillon sur la colonne GC, qui mène au détecteur (voir plus de détails dans la section détecteur).

Figure 3. Recommandations de gaz pour les colonnes remplies


Transport actif

Le transport actif, en termes simples, est le mouvement des particules à travers une protéine de transport d'une faible concentration à une concentration élevée aux dépens de l'énergie métabolique. 21 La source d'énergie la plus couramment utilisée par les cellules est l'adénosine triphosphate ou ATP, bien que d'autres sources telles que l'énergie lumineuse ou l'énergie stockée dans un gradient électrochimique soient également utilisées. 2 Dans le cas de l'ATP, l'énergie est récupérée chimiquement par hydrolyse. 22 L'hydrolyse de l'ATP provoque à son tour un changement de conformation de la protéine de transport qui permet le mouvement mécanique de la particule en question. 2 Les systèmes de transport actif sont donc des dispositifs de couplage d'énergie, car les processus chimiques et mécaniques sont liés pour réaliser le mouvement des particules. Le transport actif est classé en tant que transport actif primaire ou transport actif secondaire. La figure 4 (affichée ci-dessus) affiche une structure en ruban d'une vitamine B ABC couramment représentée12importateur de protéine de transport actif.

Transport actif primaire

Le transport actif primaire utilise l'énergie trouvée dans l'ATP, les photons et les gradients électrochimiques directement dans le transport des molécules d'une faible concentration à une concentration élevée à travers la membrane cellulaire. 23

Utilisation de l'ATP

La réaction d'hydrolyse catalysée par une enzyme éliminant un phosphate de l'ATP, formant ainsi de l'ADP, provoque un changement de conformation de la protéine de transport permettant aux particules d'entrer ou de sortir. 23 Les enzymes catalysant le transport actif primaire induit par l'ATP sont appelées ATPases. 2

Figure 5. Le transport actif primaire, avec l'utilisation d'ATP, est représenté ci-dessus en progressant de gauche à droite et de haut en bas.

L'exemple le plus universel d'hydrolyse de l'ATP entraînant le transport actif primaire dans les cellules est la pompe sodium-potassium. 2 La pompe sodium-potassium est chargée de contrôler les concentrations de sodium et de potassium à l'intérieur de la cellule. La pompe sodium-potassium est extrêmement importante pour maintenir le potentiel de repos des cellules.

Figure 6. Structure en ruban d'une pompe sodium-potassium ATPase.

Utilisation de l'énergie de gradient électrochimique

Un gradient électrochimique a deux composants : 1) un composant électrique causé par la différence de charge de chaque côté de la membrane cellulaire et 2) un composant chimique résultant de différentes concentrations d'ions à travers la membrane cellulaire. 24 Le gradient électrochimique est généré par la présence d'un gradient de protons (H + ). Un gradient de protons est une forme d'énergie interconvertible qui peut finalement être utilisée par la protéine de transport pour déplacer des particules à travers la membrane cellulaire. 2

Un exemple par excellence d'énergie de gradient électrochimique dans le transport actif primaire est la chaîne de transport d'électrons mitochondriale (ETC). 25 L'ETC utilise l'énergie produite par la réduction du NADH en NAD + pour créer un gradient de protons en pompant des protons dans l'espace mitochondrial interne.

Utiliser l'énergie photonique

L'énergie stockée dans un photon, l'unité de base de la lumière, est utilisée pour générer un gradient de protons par un processus similaire à celui des gradients électrochimiques. 24 Le passage progressif des électrons dans une chaîne de transport d'électrons réduit une molécule comme le NADH et génère finalement un gradient de protons.

La photosynthèse végétale est un exemple de transport actif primaire utilisant l'énergie photonique. 2 La chlorophylle absorbe un photon de lumière et perd par conséquent un électron qu'elle laisse passer la phéophytine, provoquant une chaîne de transport d'électrons ultérieure. 26 Cette ETC se termine finalement par la réduction du NADH en NAD + créant un gradient de protons à travers la membrane chloroplastique.

Transport actif secondaire

Le transport actif secondaire atteint un résultat identique au transport actif primaire en ce sens que les particules sont déplacées d'une faible concentration à une concentration élevée au détriment de l'énergie. 2 Le transport actif secondaire, cependant, fonctionne indépendamment du couplage direct de l'ATP. Au lieu de cela, l'énergie électrochimique générée par le pompage des ions hors de la cellule est utilisée. Le transport actif secondaire est classé comme symporteur ou antiporteur.

Symports

Le transport actif secondaire Symport utilise un mouvement descendant d'une particule pour transporter une autre particule contre son gradient de concentration. 27 Les Symports déplacent les deux particules dans la même direction à travers une protéine de transport transmembranaire.

Un exemple de symport courant est SGLT1, un symport de glucose. SGLT1 transporte une molécule de glucose dans la cellule pour deux ions sodium transportés dans la cellule. 28 Le symport SGLT1 est situé dans tout le corps, en particulier dans le néphron du rein.

Antiports

Le transport actif secondaire antiport déplace deux ou plusieurs particules différentes à travers la membrane cellulaire dans des directions opposées. 27 Le transport actif secondaire antiport déplace une particule vers le bas de son gradient de concentration et utilise l'énergie générée par ce processus pour déplacer une autre particule vers le haut de son gradient de concentration.

L'échangeur sodium-calcium présent chez l'homme dans les cellules excitables est un exemple simple et courant d'antiport. Trois ions sodium descendent leur gradient de concentration en échange d'un ion calcium. 29


Sélectivité ionique dans les canaux et les transporteurs

Benoît Roux, Simon Bernèche, Bernhard Egwolf, Bogdan Lev, Sergei Y. Noskov, Christopher N. Rowley, Haibo Yu Ion selectivity in channel and transporteurs. J Gen Physiol 1er mai 2011 137 (5) : 415-426. doi : https://doi.org/10.1085/jgp.201010577

Une multitude de processus biologiques nécessitent la participation de cations spécifiques, tels que H + , Na + , K + , Ca 2+ et Mg 2+ . Beaucoup de ces processus ne peuvent avoir lieu que lorsque les protéines ont la capacité de discriminer différents ions avec une très haute fidélité. Comment cela est possible est une question fondamentale qui fascine les scientifiques depuis longtemps. Au niveau le plus fondamental, il est prévu que la sélectivité ionique doit résulter d'un équilibre délicat d'interactions fortes. Pourtant, il est difficile d'identifier et de quantifier les facteurs microscopiques clés, car nombre d'entre eux ne peuvent pas être mesurés directement par des expériences. La théorie et les calculs peuvent contribuer en fournissant une route virtuelle pour compléter les informations manquantes. Étant donné que la sélectivité ionique est souvent dominée par des facteurs thermodynamiques, les simulations détaillées d'énergie libre de dynamique moléculaire (MD) deviennent des outils importants. Cela a été clairement illustré dès le début par des études de solvatation ionique (Straatsma et Berendsen, 1988 Åqvist, 1990) et de systèmes sélectifs d'ions (Lybrand et al., 1986 Grootenhuis et Kollman, 1989 Åqvist, 1992). Ces études pionnières ont inspiré nos propres efforts.

Dans cette perspective, nous visons à présenter notre compréhension de la sélectivité ionique telle qu'elle a évolué sur environ 15 ans à partir d'études basées sur diverses structures spécifiques : canaux gramicidine A (eg, Roux, 1996 Allen et al., 2006), le canal KcsA ( ex., Bernèche et Roux, 2000, 2001, 2003, 2005 Noskov et al., 2004a Egwolf et Roux, 2010), le canal NaK (Noskov et Roux, 2007), le transporteur LeuT (Noskov et Roux, 2008) et le Pompe Na/K (Ratheal et al., 2010). Nous discutons également des informations qui peuvent être obtenues à partir de modèles simples, qui peuvent être utilisés pour illustrer et clarifier les principes physiques fondamentaux régissant la sélectivité ionique dans les canaux et les transporteurs (Noskov et al., 2004a Noskov et Roux, 2007, 2008 Yu et Roux, 2009 Yu et al., 2009, 2010b Roux, 2010a).

Dans la section 1, nous présentons brièvement une partie du contexte historique qui a motivé et façonné nos études sur la sélectivité ionique au cours de la dernière décennie, qui ont été motivées par la détermination de la structure aux rayons X du canal KcsA K +. Nous procédons ensuite à une discussion du phénotype de la sélectivité (Section 2), des paysages d'énergie libre (Section 3), de la formulation théorique de modèles réduits (Section 4) et des problèmes de précision des champs de force (Section 5). L'examen se termine par une brève conclusion dans la section 6.

1. Contexte historique

La structure aux rayons X du canal KcsA K + a offert une première chance de visualiser l'architecture d'un canal biologique hautement sélectif (Doyle et al., 1998). La structure (Fig. 1 A) a montré que les ions K + entrant dans la région la plus étroite du pore, le filtre de sélectivité, sont coordonnés par les oxygènes carbonyle du squelette (Fig. 1 B). La structure des rayons X semblait offrir un support direct pour une explication structurelle simple et attrayante de la sélectivité ionique en étroite correspondance avec le mécanisme d'ajustement serré (Bezanilla et Armstrong, 1972), qui est ensuite devenu implicitement considéré comme allant de soi (Hille et al., 1999).L'idée générale, empruntée à la chimie hôte-invité, est que le pore étroit est parfaitement adapté (au niveau inférieur à l'angström) pour fournir une cavité de la taille appropriée pour s'adapter à K + , mais est incapable - pour des raisons structurelles - de s'adapter au Na + légèrement plus petit (Dietrich, 1985). Très tôt, cependant, des simulations MD basées sur des modèles tout-atomes ont suggéré que le filtre de sélectivité du canal KcsA pourrait être trop flexible pour satisfaire l'exigence du mécanisme traditionnel de snug-fit (Guidoni et al., 1999 Bernèche et Roux, 2000 Biggin et al., 2001). Dans les simulations MD effectuées à température ambiante, le filtre fluctuant semblait se déformer facilement pour bercer Na + avec un coût énergétique faible, une observation qui ne concordait pas avec l'explication structurelle proposée de la sélectivité (Hille et al., 1999).

Des simulations MD et des calculs de potentiel multi-ion de force moyenne (PMF) ont été utilisés pour prédire la position de tous les sites de liaison K + le long du pore, montrant que les barrières d'énergie libre s'opposant à la conduction ionique n'étaient pas plus grandes que quelques kBT et que le pore était sélectif pour K + sur Na + (Bernèche et Roux, 2001). Des simulations de perturbation alchimique de l'énergie libre (FEP) de tous les atomes (FEP/MD) ont été effectuées pour caractériser la sélectivité ionique en termes quantitatifs. L'affinité relative de K + et Na + ,gNa,K, a été calculé pour les cinq sites de liaison des cations situés le long du pore étroit (S0–S4 Fig. 1 B),

où G Na,K site = [ G Na site − G K site ] et Δ G Na,K vrac = [ G Na vrac − G K vrac ] . (Par cette définition, un site de liaison est K + sélectif lorsque ΔΔgNa,K est positif et Na + sélectif lorsqu'il est négatif). Les calculs ont montré que les sites de liaison des cations dans le filtre de sélectivité dynamique observés dans les simulations MD étaient en effet sélectifs pour K + sur Na + , en particulier le site S2 situé au centre du pore étroit. À l'époque, la suggestion d'un filtre flexible K + -sélectif subissant des fluctuations à l'échelle de l'angström semblait être conceptuellement incompatible avec les structures de rayons X à haute résolution disponibles.

Pour résoudre ce dilemme, une série d'expériences informatiques a ensuite été réalisée sur un large éventail de modèles atomiques d'un site de liaison KcsA (Noskov et al., 2004a). L'objectif était, premièrement, de présenter une démonstration convaincante que la sélectivité ionique était possible dans un site de liaison flexible vaguement restreint dans lequel les conditions du mécanisme classique d'ajustement serré n'étaient pas réalisées, et deuxièmement, de délimiter les éléments microscopiques donnant lieu à la sélectivité. dans de telles conditions. L'analyse a conduit à une conclusion surprenante et provocatrice. Il a été observé que de fortes différences d'énergie libre contrôlant la sélectivité provenaient principalement du nombre et du type de ligands de coordination ionique, sans qu'il soit nécessaire d'imposer la position de ces ligands à une précision inférieure à l'angström (Noskov et al., 2004a). La sélectivité pour K + sur Na + n'était significative (c'est-à-dire >4-5 kcal/mol) qu'avec huit ligands de type carbonyle. L'énergie libre relative de K + et Na + dans le pore résulte d'une compétition locale entre les interactions ion-ligand favorables et les interactions ligand-ligand défavorables. Cela a souligné l'importance de l'énergétique locale dans les sites de liaison flexibles, un concept plutôt nouveau.

Dans ce cadre, la coordination ionique par les ligands carbonyles a été décrite comme « dynamique » et comme un liquide », en contraste avec l'image ajustée avec sa géométrie imposée à une précision de position inférieure à l'angström. Cela a apparemment conduit à une confusion malheureuse, car certains ont pris la sémantique trop littéralement. Par liquide, on entendait que les carbonyles coordonnant l'ion fluctuent comme les ligands de la première couche de coordination d'un ion solvaté dans un liquide (c'est-à-dire que le premier pic de la fonction de distribution radiale des ligands autour de l'ion a des largeurs). De plus, l'énergie libre relative du K + et du Na + dans le pore résulte d'un équilibre d'interactions locales dynamiques, qui présente certaines similitudes avec la solvatation ionique dans un liquide (voir Section 4). Décrire la dynamique des protéines comme étant de type fluide (McCammon et al., 1977 Sheinerman et Brooks, 1998) ou de type liquide (Caspar et al., 1988 Kneller et Smith, 1994 Lindorff-Larsen et al., 2005) est en fait assez fréquent. Néanmoins, les raccourcis sémantiques peuvent générer de la confusion, car établir une distinction claire entre un matériau rigide et rigide par rapport à un matériau dynamique et flexible est en partie subjectif et dépendant du contexte. Les notions de rigidité et de flexibilité dans le cas des canaux ioniques n'ont de sens quantifiable qu'une fois les échelles de longueurs et d'énergies précisées (Allen et al., 2004). En chimie physique, il existe une longue tradition qui repose sur le critère de fusion de Lindemann (Lindemann, 1910), selon lequel un matériau est déclaré plus liquide que solide lorsque les fluctuations de la moyenne quadratique des atomes dépasser ∼10-15 % de la distance du voisin le plus proche. Ce type d'analyse a souvent été utilisé pour contraster les états repliés et dits de globules fondus d'une protéine (Zhou et Karplus, 1997, 1999 Jang et al., 2002). Avec des fluctuations de la moyenne quadratique 1 Å et des distances ion-carbonyle ∼3 Å, les ligands carbonyles sont de type liquide aux échelles de longueur atomique selon le critère de Lindemann. Mais les analogies avec la solvatation ionique dans un liquide ne doivent pas être surestimées. Il ne faut jamais perdre de vue que les fluctuations atomiques de MD sont au plus de l'ordre de ∼1 Å (Noskov et al., 2004a), et que la protéine joue sans équivoque un rôle structural essentiel en maintenant l'ion et les carbonyles restreints dans certains petite région.

Pour illustrer davantage comment la sélectivité de la taille pourrait être prise en charge dans un site de liaison flexible en l'absence de toute géométrie structurelle précise, des modèles simples (« jouets ») ont été introduits avec des groupes de type carbonyle confinés dans une région sphérique (Noskov et al., 2004a) . Par construction, aucune force de retenue n'empêche l'effondrement des ligands sur l'ion. Pourtant, les calculs FEP/MD ont montré qu'une sélectivité robuste pour K + pourrait se produire. Qu'un modèle aussi simple produise une sélectivité pour K + sur Na + était imprévu et assez surprenant pour beaucoup. Après ce travail, plusieurs études théoriques ont examiné des modèles de jouets réduits analogues pour explorer comment ils pourraient afficher une sélectivité de taille (Asthagiri et al., 2006 Bostick et Brooks, 2007, 2009, 2010 Thomas et al., 2007, 2011 Varma et Rempe, 2007 , 2008 Dudev et Lim, 2009). Bien que l'accent diffère, le consensus émergeant de ces études et de nos propres études a largement confirmé que, selon le nombre et le type de ligands, une sélectivité ionique robuste est possible dans un site de liaison flexible vaguement restreint pour lequel la notion classique de snug-fit ne ne s'applique pas.

2. Le concept fonctionnel de sélectivité ionique

Il est utile de noter que la notion de sélectivité ionique peut signifier différentes choses sur le plan opérationnel, en fonction du système moléculaire considéré (par exemple, un canal ionique ou un transporteur) et des conditions expérimentales utilisées pour sonder le système (par exemple, , liaison à l'équilibre ou flux hors équilibre et mesures de courant ionique). Dans le cas d'un transporteur, il est raisonnable de s'attendre à ce que la sélectivité de liaison des ions soit principalement régie thermodynamiquement par la liaison à l'équilibre, car la durée de vie des divers états conformationnels de la protéine est extrêmement longue. Cette situation se prête sans ambiguïté aux calculs FEP/MD. Dans le cas des canaux ioniques, la sélectivité peut signifier différentes choses, bien qu'en fin de compte, il soit entendu que les mauvais types d'ions devraient rencontrer plus de difficultés que le bon type d'ions à imprégner.

Classiquement, la sélectivité des canaux ioniques a été caractérisée en déterminant le rapport de perméabilité à partir du potentiel d'inversion (courant net nul) dans des conditions bioniques. Des études informatiques sont capables de simuler cette situation et d'expliquer l'origine du potentiel d'inversion dans une concentration ionique asymétrique avec une précision quasi quantitative pour la porine OmpF (Im et Roux, 2002) et la -hémolysine (Noskov et al., 2004b Egwolf et al ., 2010 Luo et al., 2010). Cependant, les mesures de potentiels d'inversion deviennent peu pratiques pour les canaux très sélectifs tels que les canaux K+. Dans ce cas, des méthodes alternatives telles que le soulagement du blocus Ba 2+ (Neyton et Miller, 1988a,b) ou Na + punchthrough (Nimigean et Miller, 2002) fournissent des stratégies plus efficaces pour caractériser la sélectivité avec une précision quantitative. Le bloc Ba 2+ est plus sensible à la profondeur des minima d'énergie libre des sites de liaison (c.

Implicitement, il est supposé que le phénomène de perméation et de sélectivité des ions à travers un pore conducteur ouvert peut être discuté indépendamment du déclenchement et de l'inactivation. En réalité, la situation est plus compliquée. Par exemple, le filtre de certains canaux K + est incapable de rester dans une conformation conductrice lorsqu'il est exposé à une solution ionique avec peu ou pas d'ions K +. Dans de telles conditions, le filtre se convertit rapidement en un état non conducteur car les ions K + sont nécessaires pour maintenir l'état conducteur du canal, donnant lieu à une sorte de super-sélectivité conformationnelle. Un exemple de ceci est fourni par le canal KcsA de type sauvage (Lockless et al., 2007). D'une pertinence possible pour ces observations, le filtre de sélectivité du canal bactérien KcsA récapitule la plupart des caractéristiques de l'inactivation de type C affichées par les canaux K + dépendants de la tension eucaryotes (Cordero-Morales et al., 2006, 2007 Cuello et al., 2010). Le phénomène complexe de super-sélectivité doit être distingué de la notion plus simple et peut-être plus traditionnelle de sélectivité d'état conducteur, qui est le sujet principal de cette Perspective. Des exemples de canaux qui présentent sans ambiguïté le phénomène de sélectivité de l'état conducteur en restant dans l'état conducteur même en l'absence totale de K + sont le canal MthK (Ye et al., 2010) et le synthétique KcsA D-Ala77 (Valiyaveetil et al. ., 2006). Les études computationnelles de la sélectivité dans les canaux K + se sont principalement concentrées sur le phénomène de la sélectivité de l'état conducteur (Bernèche et Roux, 2001 Luzhkov et Åqvist, 2001 Noskov et al., 2004a Thompson et al., 2009 Egwolf et Roux, 2010). Moins d'attention a été consacrée à la caractérisation du couplage complexe entre la liaison sélective des ions et la stabilité conformationnelle du filtre impliqué dans la super-sélectivité à l'aide de méthodes de calcul. Des études antérieures sur la stabilité relative de la structure conductrice et dite à faible K + du canal KcsA de type sauvage et sur la façon dont elle dépend de l'occupation des ions fournissent des exemples des défis et des difficultés qui pourraient se présenter (Domène et Furini, 2009 Boiteux et Bernèche, 2011). Aborder ces problèmes de manière systématique nécessitera des techniques informatiques avancées capables de décrire des changements conformationnels complexes dans les macromolécules (Domene et al., 2008 Pan et Roux, 2008 Pan et al., 2008 Maragliano et al., 2009).

3. Sélectivité du point de vue du paysage énergétique sans ions multiples

La vue la plus simple de la sélectivité de l'état conducteur commence par l'hypothèse qu'il existe des sites de liaison bien définis qui peuvent être occupés par K + ou Na + . Dans ce contexte, le problème peut être traité avec des simulations FEP/MD pour calculer l'énergie libre relative de K + et Na + dans le site de liaison d'intérêt via Eq. 1. Mais la sélectivité de l'état conducteur peut également être le résultat de facteurs cinétiques causés par des différences dans les barrières d'énergie libre (Thompson et al., 2009 Nimigean et Allen, 2011). De plus, il est bon de rappeler que les canaux ioniques ne sont pas vraiment conçus pour maintenir les ions en place, mais pour leur permettre de diffuser rapidement à travers la membrane. Par conséquent, il est probable que les sites de liaison à l'intérieur du pore, même lorsqu'ils existent, soient plutôt peu profonds et séparés par de petites barrières d'énergie libre.

Une analyse plus complète de la sélectivité de l'état conducteur nécessite la connaissance de toute la surface d'énergie libre régissant le processus de perméation multi-ionique, avec tous ses puits et barrières d'énergie libre (Bernèche et Roux, 2001 Roux et al., 2004 Furini et Domene, 2009). Ceci peut être réalisé en calculant le PMF pour les ions dans le pore, W(Z1,Z2,Z3), en utilisant des simulations MD d'échantillonnage parapluie (Bernèche et Roux, 2001, 2003). Par exemple, le PMF multi-ion des ions K + transloquant à travers le filtre de sélectivité KcsA affiche une série de sites de liaison de cations séparés uniquement par de petites barrières d'énergie libre (Bernèche et Roux, 2001), produisant une conductance de canal maximale de ∼300-500 pS, en bon accord avec les expériences (Bernèche et Roux, 2003). Le mécanisme de conduction ionique prédominant extrait des calculs de PMF est corroboré par les résultats de longues trajectoires MD non biaisées (Jensen et al., 2010).

Dans des conditions physiologiques, la conséquence fonctionnelle de la sélectivité élevée des canaux K + est principalement d'empêcher l'entrée des ions Na + du côté extracellulaire. Pour en savoir plus sur ce processus, des simulations MD tout-atome avec une membrane explicite ont été utilisées pour déterminer les PMF multi-ion correspondant à l'entrée d'un ion extracellulaire, Na + ou K + , dans le filtre de sélectivité du canal KcsA alors qu'il est dans son état conducteur et occupé par deux ions K + (Egwolf et Roux, 2010). Les calculs, résumés sur la figure 2, ont permis de capturer les principales différences entre l'entrée d'un ion K + ou Na + dans le pore. Plus important encore, les PMF de la figure 2A montrent que la région correspondant au site de liaison S2 près du centre du pore étroit apparaît comme la plus sélective pour K + sur Na + . En particulier, bien qu'il existe un minimum stable pour K + dans le site S2, l'ion Na + fait face à un paysage d'énergie libre en forte augmentation sans puits local dans cette région. Bien que S2 soit un emplacement stable pour K + , il peut s'agir d'un site de liaison stable pour Na + uniquement dans le contexte d'une configuration multi-ion, avec d'autres ions liés dans les sites S0 et S4. Cela a des implications importantes pour les études alchimiques FEP/MD de la sélectivité ionique dans le canal KcsA. Il est également possible de surveiller le nombre moyen d'oxygènes de coordination des groupes carbonyle du squelette ou des molécules d'eau autour des ions K + et Na + pendant le processus d'entrée pour voir comment il est en corrélation avec le paysage de l'énergie libre. Les résultats sont présentés sur la figure 2 B. Comme prévu, le nombre de molécules d'eau de coordination diminue à mesure que l'ion passe de la phase en vrac dans le filtre de sélectivité étroit, pour Z1 < 7 . De manière significative, l'augmentation de la sélectivité pour K + sur Na + qui est observée près du site S2 semble être majoritairement corrélée avec des changements dans le type de ligands de coordination (carbonyles vs molécules d'eau).

Le rôle critique de la région centrale près du site de liaison S2 de KcsA se reflète également dans la structure des pores des canaux homologues. Par exemple, l'une des principales différences entre le canal NaK cationique non sélectif et le canal K + -sélectif KcsA est l'élargissement du pore au niveau du site central de liaison S2 dans NaK (Shi et al., 2006). Cela a conduit à suggérer que la perte de sélectivité au niveau du site central S2 pourrait être la principale raison pour laquelle le canal NaK est capable de conduire Na + contrairement à KcsA (Zagotta, 2006), ce qui était corrélé aux simulations MD (Noskov et Roux , 2007). Les résultats de MD concernant le canal NaK (Noskov et Roux, 2007) ont ensuite été confirmés par des structures à rayons X supplémentaires (Alam et Jiang, 2009, 2011).

4. Etudes de sélectivité ionique basées sur des modèles réduits

Bien que des calculs tenant compte de la surface d'énergie libre multi-ion soient souhaitables (voir la section 3), des études théoriques basées sur des modèles réduits comprenant uniquement l'ion et les ligands de coordination les plus proches peuvent fournir un aperçu significatif lorsque la sélectivité concerne l'équilibre de liaison thermodynamique dans un puits. site défini. En règle générale, les interactions à longue distance à partir de parties distantes de la protéine ou du solvant ne devraient pas affecter directement les différences d'énergie libre relative si, par exemple, la charge de l'ion reste inchangée, comme c'est le cas avec Na + et K + . Cependant, les effets à longue distance peuvent avoir une influence indirecte lorsque, par exemple, la stabilité structurelle d'un site de liaison est affectée par une mutation dans un résidu distant, ou cela pourrait déclencher l'apparition d'une certaine super-sélectivité induite par la conformation (voir la section 2). Néanmoins, décrire des aspects de la sélectivité ionique à partir de l'énergétique locale, même s'il existe des transitions conformationnelles, est formellement possible en considérant une décomposition en énergie libre étape par étape (Deng et Roux, 2009).

(a) Formulation de modèles réduits.

Par construction, les modèles réduits ne traitent explicitement que l'ion et les ligands de coordination environnants. L'effet des atomes manquants de la protéine ou du solvant doit être incorporé indirectement via des contraintes spatiales qui agissent sur l'ion et les ligands. De toute évidence, les résultats peuvent être fortement affectés par le caractère de ces contraintes (par exemple, voir Yu et al., 2009), et des modèles réduits avec des contraintes très lâches ou très rigides peuvent conduire à des conclusions très différentes sur la sélectivité ionique. Une telle ambiguïté et un tel arbitraire augmentent la difficulté de tirer des conclusions significatives à partir d'études basées sur des modèles réduits.

Pour résoudre ce problème, un cadre mécanique statistique pour le déterminant structurel local de la sélectivité ionique dans les sites de liaison aux protéines a été formulé (Yu et al., 2010b). Premièrement, un sous-système local comprenant l'ion et le N des ligands de coordination est défini. Ensuite, l'influence du reste du système sur le sous-système est rigoureusement exprimée comme la somme de deux contributions distinctes. Le premier incorpore toutes les forces moléculaires maintenant l'ion et les ligands de coordination vaguement restreints à un sous-volume microscopique, mais il n'empêche pas les ligands de s'adapter à un ion plus petit ou plus grand, tandis que le second regroupe toutes les forces restantes qui contrôlent le géométrie précise des ligands de coordination les mieux adaptés à un ion donné. Une constante de ressort efficace,g, qui est déterminé à partir des fluctuations thermiques des ligands est introduit pour rendre compte de l'amplitude des forces de précision géométrique.

(b) Deux mécanismes de sélectivité ionique.

Le cadre révèle l'existence de deux mécanismes limitants distincts et idéalisés qui sont capables de donner lieu à une sélectivité ionique dans les sites de liaison aux protéines (Yu et al., 2010b). Dans une limite, les forces géométriques sont dominantes (λg→∞) et le site de liaison est presque rigide. Ensuite, on peut montrer que la différence d'énergie libregNa,K est fixé par la différence entre les interactions moyennes ion-ligand,

et que la sélectivité ionique est contrôlée stériquement par la taille de la cavité, selon le mécanisme familier d'ajustement serré. Dans l'autre limite, les forces géométriques sont négligeables (λg→0), et l'ion et les ligands sont libres de fluctuer et de s'adapter aux ions de différentes tailles. Nous avons appelé cette situation, un peu moins familière, la microgouttelette confinée. Dans ce cas, on peut montrer rigoureusement à partir d'un développement mécanique statistique que la différence d'énergie libre ΔΔgNa,K est déterminé par l'interaction entre les interactions moyennes ion-ligand et ligand-ligand,

Deux facteurs physiques clés contrôlent l'énergie libre relative dans la limite des microgouttelettes confinées : le nombre de ligands disponibles N et leurs propriétés physiques. Ce dernier comprend des facteurs électrostatiques (dipôle, charge et polarisabilité) ainsi que des facteurs non électrostatiques (forme, rayon et taille). Les différences d'énergie libre sont dominées par les contributions enthalpiques, comme −T??S est souvent négligeable (Noskov et Roux, 2006 Roux, 2010a). Cependant, il est important de considérer les énergies moyennées thermiquement car une analyse basée sur des minima énergétiques à partir de géométries optimisées peut conduire à des erreurs importantes (Yu et Roux, 2009 Dixit et Asthagiri, 2011).

Selon l'éq. 3, les interactions ion-ligand favorables (négatives) et défavorables (positives) ligand-ligand contribuent et rivalisent, de manière non triviale, pour contrôler la sélectivité dans la microgouttelette confinée. L'interaction ligand-ligand agit comme une souche énergétique. Des conclusions similaires ont été obtenues par Asthagiri et ses collaborateurs (Asthagiri et al., 2006 Dixit et al., 2009) à l'aide d'une analyse de la DM de tous les atomes et de modèles réduits. Les différences dans l'interaction moyenne ion-ligand, 〈 U ion − ligand 〉 (Na) − 〈 U ion − ligand 〉 (K) ⁠ , ne donnent pas lieu à une sélectivité dans la limite des microgouttelettes confinées, contrairement au mécanisme hôte-invité avec un rayon de cavité fixe comme décrit par l'Eq. 2, illustrant davantage l'importance des interactions ligand-ligand dans l'analyse des systèmes flexibles. Une discussion claire de cette question a été fournie dans Asthagiri et al. (2006). On peut noter qu'avec un ion et N ligands, il y a N paires ion-ligand et N(N-1)/2 paires ligand-ligand. Ainsi, on ne s'attend pas à ce que le site G Na,K affiche typiquement une simple dépendance par rapport à N.

Il convient de noter qu'il n'y a pas de contributions explicites des forces protéiques à la différence d'énergie libre Δ G Na,K site contrôlant la sélectivité ionique dans l'équation. 3. Néanmoins, il est important de garder à l'esprit que l'environnement surpeuplé imposé par le confinement est une caractéristique cruciale du contexte qui sous-tend la sélectivité dans de tels systèmes. Par exemple, il est bien entendu que les ligands totalement libres et non restreints (comme dans un liquide en vrac) ne présentent généralement pas une sélectivité élevée. Néanmoins, le confinement spatial n'a pas besoin d'être précis pour donner lieu à une sélectivité ionique. Des modèles d'énergie libre non triviaux peuvent émerger, même dans le contexte d'un confinement relativement générique et sans particularité. Ceci est en contraste frappant avec le mécanisme d'ajustement serré, qui nécessite des forces protéiques dictant une géométrie précise. Par conséquent, dans la limite des microgouttelettes confinées, la structure de la protéine joue un rôle essentiel pour soutenir la sélectivité, mais pas en imposant une taille de cavité spécifique avec une géométrie de ligand à une précision inférieure à l'angström, ni en contribuant directement aux différences d'énergie libre. Bien qu'il existe des différences d'accent, ces observations sont cohérentes avec l'analyse présentée par Varma et al. (2011).

À la lumière de cette analyse théorique, le snug-fit et la microgouttelette confinée apparaissent maintenant comme deux mécanismes physiques extrêmes et idéalisés de la sélectivité ionique. On s'attend à ce que les systèmes réels prennent un caractère mixte entre ces deux points de vue idéalisés. Certains sites de liaison ne peuvent pas être sélectifs sans forces architecturales supplémentaires stabilisant la géométrie du ligand (par exemple, le site Na2 dans LeuT), tandis que d'autres peuvent être fortement sélectifs dans la limite des microgouttelettes confinées (par exemple, le site S2 de KcsA ou le site Na1 dans LeuT) . Ces tendances robustes apparaissant dans la limite des microgouttelettes confinées correspondent à une sélectivité inhérente, qui est une propriété émergente définie par le nombre et le type de ligands formant le site de liaison (voir la section 4c ci-dessous).

Les résultats de la figure 3 montrent qu'il est extrêmement difficile de contrecarrer la sélectivité inhérente dans le cas du site KcsA S2 ou du site Na1 du LeuT avec de petites altérations de la structure ou des forces architecturales. Il est possible d'adapter la géométrie locale des ligands pour construire un site de liaison putatif Na + -sélectif KcsA ou un site K + -sélectif LeuT-Na1, mais les sites ne deviennent sélectifs que lorsque la protéine est rendue irréalistement rigide (λg>>10 kcal/mol/Å 2 ). Des résultats similaires ont été montrés précédemment dans une étude initiale (voir Fig. 3 de Noskov et al., 2004a). Cette analyse suggère que la stabilisation de la géométrie locale pour s'appuyer sur la sélectivité inhérente définie par le nombre et le type de ligands de coordination ionique est probablement un principe de conception important des sites de liaison sélectifs des ions dans les protéines et autres macromolécules biologiques. Par exemple, une certaine sélectivité inhérente pourrait être affichée par un site de liaison faiblement restreint existant dans une protéine imparfaitement repliée à un stade précoce de son évolution. Ensuite, la séquence d'acides aminés pourrait subséquemment subir des mutations pour augmenter la rigidité architecturale du site de liaison vers un mécanisme d'ajustement serré si cela confère un avantage fonctionnel, par exemple, voir l'analyse évolutive intéressante des protéases régulées par les cations par Page et Di Cera (2006 ). De ce point de vue, le renforcement de l'architecture locale peut servir à renforcer (plutôt qu'à s'opposer) à la sélectivité inhérente qui pourrait déjà exister au sein d'un site vaguement restreint.

(c) Relation avec la théorie classique de l'intensité du champ.

Le comportement thermodynamique dans la microgoutte confinée fluctuante présente certaines similitudes avec la théorie classique de l'intensité du champ d'Eisenman et Krasne (Eisenman, G. et S. Krasne. 1972. D'autres considérations sur la sélectivité ionique des molécules porteuses et des membranes. Actes de la quatrième Symposium du Congrès international de biosphysique sur la structure et la fonction des membranes), par exemple, les ligands à faible champ ont tendance à favoriser les cations plus gros, tandis que les ligands à haut champ ont tendance à favoriser les petits. Par exemple, la sélectivité peut se déplacer de manière marquée vers Na + si des oxygènes carboxylates (ligands à champ élevé) sont incorporés dans un site de liaison. Mais les arguments traditionnels d'intensité de champ ion-ligand n'expliquent pas pourquoi un site de liaison flexible de huit carbonyles reste fortement sélectif pour K + , car le dipôle du squelette amide carbonyle est environ deux fois plus grand que le dipôle d'une molécule d'eau l'interaction entre un cation et un seul squelette carbonyle est significativement plus grande que celle d'une molécule d'eau, et cette différence est encore plus importante dans le cas de Na + que pour K + (Noskov et Roux, 2006). En d'autres termes, les carbonyles sont des ligands à champ élevé selon les arguments traditionnels d'intensité de champ, et ils favoriseraient Na + par rapport à K + s'il n'y avait pas eu le contre-effet (l'énergie de déformation électrostatique) des interactions ligand-ligand (Noskov et Roux, 2006 Dixit et al., 2009).

(d) Une large gamme de sélectivités ioniques.

Même des modèles réduits à simple confinement peuvent donner lieu à une large gamme de sélectivités ioniques. Pour illustrer cela, une vaste collection de 1 077 modèles réduits a été caractérisée à l'aide de simulations FEP/MD (Roux, 2010a). Les modèles comprenaient quatre à neuf ligands oxygène de différents types, avec zéro à huit N-méthylacétamide, méthanol (CH3OH), ou de l'eau, de zéro à quatre diglycines (chacune avec deux carbonyles de squelette), et de zéro à deux acides acétiques neutres ou ionisés (CHCOOH ou CHCOO - , chacun avec deux ligands oxygène). Les résultats ont confirmé qu'une sélectivité non triviale peut survenir dans ces modèles réduits, sans avoir besoin d'une géométrie précise pour les ligands. La notion selon laquelle la sélectivité est une propriété émergente des microgouttelettes confinées auto-organisées est similaire au mécanisme de compétition charge/espace qui a été utilisé pour modéliser les canaux calciques, où la sélectivité résulte d'un équilibre entre l'électrostatique et le volume exclu d'ions dans la sélectivité encombrée. filtre (Gillespie et al., 2005 Gillespie, 2008).

E) La question des numéros de coordination.

Le nombre de ligands ainsi que leurs propriétés devraient jouer un rôle important dans la sélectivité (Noskov et al., 2004a). Cependant, certains chercheurs proposent que la sélectivité soit contrôlée principalement par le nombre de ligands de coordination, leurs propriétés physiques étant moins importantes (Bostick et Brooks, 2007, 2009, 2010 Thomas et al., 2007 Varma et Rempe, 2007, 2008 Dudev et Lim, 2009). Une discussion détaillée point par point des points de vue divergents nécessite un examen critique de leurs fondements mécaniques statistiques et va au-delà de cette perspective. Parmi les problèmes spécifiques à considérer figurent l'utilisation de la minimisation de l'énergie pour estimer les énergies libres dans les modèles réduits (Yu et Roux, 2009), les hypothèses sous-jacentes utilisées pour déduire la sélectivité des sites de liaison des protéines sur la base des nombres de coordination des ions dans l'eau en vrac (Yu et al., 2009), et la précision (et l'applicabilité) d'un cadre mécanique statistique approximatif basé sur la théorie quasi-chimique primitive pour la solvatation des ions dans les liquides en vrac pour la modélisation des sites de liaison des protéines (Roux et Yu, 2010) . Bien qu'il ne semble pas y avoir de consensus sur la meilleure approche pour disséquer les diverses contributions à la sélectivité ionique à l'heure actuelle, un message important à retenir est que les diverses études s'accordent sur le fait que des tendances non triviales peuvent émerger dans des modèles réduits avec des ligands faiblement restreints, en fonction tant sur le nombre que sur le type de ligands. L'importance de la chimie pour la sélectivité des ions - une notion à peine radicale - est clairement démontrée si l'on considère une analyse des sites de liaison des ions dans les protéines (Noskov et Roux, 2008), une caractérisation de 1 077 modèles réduits à partir de simulations FEP/MD (Roux, 2010a), ou une comparaison des énergies expérimentales libres de solvatation ionique dans divers liquides organiques (Fig. 2 dans Varma et al., 2011).secc

5. Champ de force, polarisation induite et mécanique quantique (QM)

Les conclusions dérivées des études informatiques de la sélectivité ionique dépendent de la précision des méthodes de calcul sous-jacentes. Les simulations de systèmes biomoléculaires sont essentiellement limitées par la précision de la surface d'énergie potentielle et l'échantillonnage statistique (Roux, 2010b). Pour obtenir des résultats significatifs, il faut rechercher un équilibre entre des représentations plus précises mais plus coûteuses de la surface énergétique et l'obligation d'échantillonner adéquatement les configurations pertinentes. La plupart des simulations de systèmes biomoléculaires sont basées sur des fonctions potentielles avec des charges atomiques effectives fixes (Åqvist, 1990 Cornell et al., 1995 MacKerell et al., 1998), qui expliquent en moyenne les effets de polarisation à plusieurs corps. De telles fonctions potentielles peu coûteuses en calcul permettent d'explorer de manière approfondie l'espace conformationnel avec de longues trajectoires MD (Jensen et al., 2010). Mais avec des ordinateurs de plus en plus puissants, les simulations basées sur des représentations plus sophistiquées deviennent abordables.

Une stratégie prometteuse pour améliorer la précision des études de DM est le développement de fonctions potentielles qui tiennent explicitement compte de la polarisation induite (Grossfield et al., 2003 Patel et al., 2004 Lamoureux et Roux, 2006 Whitfield et al., 2007 Yu et al. , 2010a,c). Bien que les simulations de protéines complètes avec des champs de force polarisables ne soient pas encore réalisées en routine, il existe déjà des résultats intéressants concernant la solvatation ionique dans l'eau (Lamoureux et al., 2006 Yu et al., 2010c) et dans les amides liquides (Grossfield et al., 2003 Yu et al., 2010a). Par exemple, selon les calculs FEP/MD, il existe une variation extrêmement forte de l'énergie libre relative de Na + et K + en fonction du nombre de N-méthylacétamide molécules dans les modèles réduits, alors que les variations d'énergie libre correspondantes avec les molécules d'eau sont beaucoup plus petites (Yu et al., 2010a). Cette observation met en évidence les différences quantitatives présentées par l'eau et les carbonyles en tant que ligands de coordination des ions.

Un autre domaine de progrès considérable concerne les simulations basées sur les théories de la structure électronique QM (Bucher et Rothlisberger, 2010). Ceux-ci peuvent être effectués dans le contexte de Car-Parrinello MD (CPMD http://www.cpmd.org/), qui est un algorithme pour générer une trajectoire MD d'un système périodique qui se rapproche de la surface de Born-Oppenheimer d'une fonctionnelle de densité méthode théorique (DFT). Typiquement, les simulations CPMD sont limitées à des systèmes de seulement quelques centaines d'atomes et quelques dizaines de picosecondes et sont plusieurs milliers de fois plus lentes que les simulations utilisant des champs de force polarisables. Le CPMD a été largement utilisé pour calculer la structure en solution des ions hydratés (Whitfield et al., 2007) et a récemment été utilisé pour modéliser les modes de coordination des ions dans le filtre de sélectivité KcsA (Bucher et al., 2007, 2010). En guise de mise en garde, les méthodes DFT conventionnelles ne sont pas exactes et sous-estiment souvent les attractions intermoléculaires résultant des forces dispersives de van der Waals. Cela peut conduire à des limitations dans la représentation de la solvatation d'ions tels que K + dans l'eau liquide. et al., 2007). Comme illustré sur la figure 4, il y a une certaine amélioration avec les simulations CPMD avec une correction empirique pour tenir compte de la dispersion de van der Waals, mais l'accord avec les fonctions de distribution expérimentales estimées à partir de la diffusion des neutrons et de la diffraction anormale ) est moins bonne que celle des simulations basées sur un champ de force polarisable (Whitfield et al., 2007). Notamment, le nombre de coordination de K + (à r = 3,5 ) est considérablement affectée par la correction de dispersion. Le nombre de coordination passe de 6,15 dans les simulations CPMD non corrigées à 7,45 dans les simulations CPMD avec correction de dispersion, une valeur supérieure à celle obtenue à partir du champ de force non polarisable (6,77) et du champ de force polarisable (6,80). Cela montre que les approximations actuellement utilisées dans les simulations CPMD peuvent affecter considérablement la solvatation des ions et doivent être considérées avec prudence. On ne peut pas supposer qu'une stratégie basée sur les méthodes QM soit intrinsèquement supérieure à une stratégie basée sur un champ de force bien calibré pour la modélisation de la sélectivité des canaux ioniques, mais elles restent des outils précieux pour paramétrer et valider ces simulations.

En fin de compte, ce qui compte, c'est de déterminer le degré de confiance concernant les conclusions tirées d'un calcul donné. Une bonne stratégie consiste à évaluer la validité d'une tendance dominante à l'aide de méthodes de haut niveau. Par exemple, l'importance de la répulsion carbonyle-carbonyle dans le filtre de sélectivité de KcsA, d'abord notée dans les simulations FEP/MD basées sur un champ de force non polarisable, a ensuite été évaluée à l'aide de calculs ab initio de haut niveau pour montrer que la répulsion entre molécules d'eau est plus petite que celle entre les groupes carbonyle (voir le matériel supplémentaire dans Noskov et al., 2004a). Plus récemment, l'importance de la répulsion carbonyle-carbonyle a été à nouveau démontrée dans les simulations CPMD du canal KcsA réalisées par Bucher et al. (2010). Il est également intéressant de revoir et de valider certaines conclusions précédentes sur la sélectivité élevée en K + du site de liaison S2 dans KcsA en utilisant des calculs FEP/MD avec un modèle polarisable ou un calcul entièrement QM basé sur DFT (Fig. 1 C). Les résultats donnés dans le tableau I indiquent que dans tous les cas, l'énergie libre relative de Na + et K + est assez similaire, indiquant que des conclusions significatives ont été tirées des calculs FEP/MD basés sur le champ de force non polarisable.

6. Conclusion

Les premières simulations MD du canal KcsA ont mis au premier plan l'idée provocatrice que la sélectivité ionique pouvait être obtenue de manière robuste malgré une flexibilité structurelle considérable, incitant à réexaminer les facteurs microscopiques donnant lieu à la sélectivité ionique à l'aide d'un large éventail d'expériences de calcul. Certaines de ces expériences de calcul représentaient des situations assez artificielles (par exemple, la désactivation de la répulsion carbonyle-carbonyle dans KcsA), tandis que d'autres impliquaient des modèles réduits (par exemple, quelques ligands confinés de type carbonyle). Les idées sur la nécessité de sites de liaison rigides et précis ont été réévaluées et les problèmes que l'on croyait réglés auparavant ont été rouverts.

Les notions classiques sur la sélectivité de l'état conducteur telles que le mécanisme d'ajustement serré, l'intensité du champ et les profils d'énergie libre sont toujours importantes, mais elles partagent maintenant la scène avec des concepts supplémentaires et moins familiers relatifs aux systèmes flexibles et peu restreints. La notion provocatrice selon laquelle la sélectivité ionique dans un site de liaison flexible peut émerger de l'énergétique locale est désormais fermement ancrée. Cette analyse a permis de délimiter l'existence de deux mécanismes idéalisés différents capables de soutenir la sélectivité ionique (Yu et al., 2010b).

Une grande partie des progrès a reposé sur une combinaison de simulations MD tout-atome sur des structures connues avec un solvant et une membrane explicites et l'analyse de modèles réduits. Nous pensons que les modèles réduits, bien qu'utiles pour identifier et illustrer les principes physiques fondamentaux, seront toujours subordonnés aux études sur les structures réelles des protéines. Bien que les caractéristiques des modèles réduits puissent faire l'objet de débats, il est important de rappeler que les résultats des calculs MD de tous les atomes sur KcsA, NaK et LeuT ont, jusqu'à présent, été en bon accord avec les expériences. Ce succès relatif des simulations informatiques suggère qu'elles fournissent une représentation réaliste de ces systèmes moléculaires et qu'elles peuvent contribuer à mieux comprendre la sélectivité ionique.

Jusqu'à présent, la plupart des efforts ont été implicitement concentrés sur les facteurs régissant la sélectivité de l'état conducteur, avec une bonne quantité d'attention consacrée aux notions d'équilibre thermodynamique. Des efforts supplémentaires seront nécessaires pour mieux comprendre le phénomène complexe de la super-sélectivité induite par la conformation, qui reste mal compris. La recherche sur la sélectivité des canaux ioniques continuera de progresser, avec des structures de canaux supplémentaires, ainsi que des améliorations dans les modèles informatiques.

Annexe

Éq. 3, extrait de Yu et al. (2010b), est étroitement liée à l'équation. 2 de Varma et al. (2011). La différence entre les interactions ion-ligand moyennes pour Na + et K + , U ion − ligand 〉 (Na) − 〈 U ion − ligand 〉 (K) ⁠ , dans l'Eq. 3 est équivalent à [ Δ UK → Na IL ] ⁠ , et la différence entre les interactions ligand-ligand moyennes pour Na + et K + , 〈 U ligand − ligand 〉 (Na) − 〈 U ligand − ligand 〉 (K) ⁠ , dans l'éq. 3 correspond à [ Δ U K → Na LL + Δ U K → Na intra ] ⁠ . Les différences d'entropie entre les ions, − T S K → Na ⁠ , sont souvent faibles en pratique et peuvent être négligées par souci de simplicité (Roux, 2010a).Le terme restant est la contribution énergétique interne moyenne du champ externe imposée par le reste de la protéine Δ U K → Na champ ⁠ . En supposant que le champ externe de la protéine correspond à un potentiel de confinement sévère agissant sur les ligands, U champ ⁠ , sa moyenne est proportionnelle à ∫ dx U champ ( x ) exp [ − U total ( x ) / k BT ] ⁠ , qui devrait être faible car le facteur de Boltzmann est négligeable à tous les points X où U champ est non nul (X représente tous les degrés de liberté pertinents).

Cette série Perspectives comprend des articles d'Andersen, Alam et Jiang, Nimigean et Allen, Dixit et Asthagiri, et Varma et al. (prévu pour le numéro de juin 2011).


Qu'est-ce que la diffusion simple

La diffusion simple est un type de diffusion non assisté dans lequel une particule passe d'une concentration plus élevée à une concentration plus faible. Le mouvement directionnel à travers le gradient de concentration est passif. Une fois que les molécules sont uniformément réparties, les molécules des deux côtés de la membrane cellulaire atteignent un équilibre où aucun mouvement net des molécules n'est observé. Généralement, de petites molécules non polaires comme l'oxygène, le dioxyde de carbone et l'éthanol diffusent librement à travers la membrane cellulaire. Le taux de diffusion dépend de la température, de la taille moléculaire et de la pente du gradient de concentration. La température affecte l'énergie cinétique des particules dans une solution. Les grosses particules sont soumises à une résistance plus élevée dans une solution par rapport aux particules plus petites. De plus, lorsque le gradient de concentration est élevé, davantage de molécules traverseront la membrane. La diffusion simple à travers la membrane cellulaire est montrée dans Figure 1.

Figure 1 : Diffusion simple


Diffusion facilitée

La diffusion facilitée est le passage de molécules ou d'ions à travers une membrane biologique à travers des protéines de transport spécifiques et ne nécessite aucun apport d'énergie. La diffusion facilitée est utilisée en particulier dans le cas de grosses molécules polaires et d'ions chargés une fois que ces ions sont dissous dans l'eau, ils ne peuvent pas diffuser librement à travers les membranes cellulaires en raison de la nature hydrophobe des queues d'acides gras des phospholipides qui composent les bicouches. Le type de protéines porteuses utilisées dans la diffusion facilitée est légèrement différent de ceux utilisés dans le transport actif. Ce sont toujours des protéines porteuses transmembranaires, mais ce sont des canaux transmembranaires fermés, ce qui signifie qu'ils ne subissent pas de translocation interne et ne nécessitent pas d'ATP pour fonctionner. Le substrat est pris dans un côté du support fermé, et sans utiliser d'ATP, le substrat est libéré dans la cellule. Ils peuvent être utilisés comme biomarqueurs potentiels.


2.4.7 Expliquer comment les vésicules sont utilisées pour transporter des matériaux à l'intérieur d'une cellule entre le réticulum endoplasmique rugueux, l'appareil de Golgi et la membrane plasmique.

Une fois que les protéines ont été synthétisées par les ribosomes, elles sont transportées vers le réticulum endoplasmique rugueux où elles peuvent être modifiées. Les vésicules portant la protéine bourgeonnent alors hors du réticulum endoplasmique rugueux et sont transportées vers l'appareil de Golgi pour être encore modifiées. Après cela, les vésicules transportant la protéine bourgeonnent hors de l'appareil de Golgi et transportent la protéine jusqu'à la membrane plasmique. Ici, les vésicules fusionnent avec la membrane expulsant leur contenu (les protéines modifiées) à l'extérieur de la cellule. La membrane revient alors à son état initial. C'est un processus appelé exocytose. L'endocytose est un processus similaire qui implique la traction de la membrane plasmique vers l'intérieur de sorte que le pincement d'une vésicule de la membrane plasmique se produise et que cette vésicule puisse transporter son contenu n'importe où dans la cellule.


LE PROCESSUS PHOTOSYNTHÉTIQUE

John Whitmarsh
Unité de recherche sur la photosynthèse, Service de recherche agricole/USDA
Département de biologie végétale et Centre de biophysique et de biologie computationnelle,
Université de l'Illinois à Urbana-Champaign

Govindjee
Département de biologie végétale et Centre de biophysique et de biologie computationnelle
Université de l'Illinois à Urbana-Champaign

Sommaire

La principale source d'énergie pour presque toute la vie est le Soleil. L'énergie de la lumière du soleil est introduite dans la biosphère par un processus connu sous le nom de photosynthèse, qui se produit dans les plantes, les algues et certains types de bactéries. La photosynthèse peut être définie comme le processus physico-chimique par lequel les organismes photosynthétiques utilisent l'énergie lumineuse pour conduire la synthèse de composés organiques. Le processus photosynthétique dépend d'un ensemble de molécules protéiques complexes situées dans et autour d'une membrane hautement organisée. Grâce à une série de réactions de transduction d'énergie, la machinerie photosynthétique transforme l'énergie lumineuse en une forme stable qui peut durer des centaines de millions d'années. Ce chapitre introductif se concentre sur la structure de la machinerie photosynthétique et les réactions essentielles pour transformer l'énergie lumineuse en énergie chimique.

Table des matières

1. Introduction

2. Bref historique

3. Classification des organismes photosynthétiques

4. Principes de la transformation de l'énergie photosynthétique

5. La photosynthèse oxygénique

6. Photosynthèse anoxygénique

7. Contrôle du transport d'électrons intraprotéiques

8. La photosynthèse globale et l'atmosphère

Remerciements

Les références

1. INTRODUCTION

2. BREF HISTORIQUE

3. CLASSIFICATION DES ORGANISMES PHOTOSYNTHETIQUES

4. PRINCIPES DE LA TRANSFORMATION ÉNERGÉTIQUE PHOTOSYNTHÉTIQUE

Les réactions lumineuses convertissent l'énergie sous plusieurs formes (Fig. 1). La première étape est la conversion d'un photon en un état électronique excité d'une molécule de pigment d'antenne située dans le système d'antenne. Le système d'antenne se compose de centaines de molécules de pigment (principalement de la chlorophylle ou de la bactériochlorophylle et des caroténoïdes) qui sont ancrées à des protéines dans la membrane photosynthétique et servent un complexe protéique spécialisé appelé centre de réaction. L'état excité électronique est transféré sur les molécules d'antenne sous forme d'exciton. Certains excitons sont reconvertis en photons et émis sous forme de fluorescence, certains sont convertis en chaleur et certains sont piégés par une protéine du centre de réaction. (Pour une discussion sur l'utilisation de la fluorescence comme sonde de la photosynthèse, voir par exemple, Govindjee et al., 1986 et Krause et Weis, 1991.) Les excitons piégés par un centre de réaction fournissent l'énergie pour la réaction photochimique primaire de la photosynthèse - le transfert d'un électron d'une molécule donneuse à une molécule acceptrice. Les molécules du donneur et de l'accepteur sont attachées au complexe protéique du centre de réaction. Une fois que la séparation de charge primaire se produit, les réactions de transfert d'électrons subséquentes sont énergétiquement descendantes.

Dans les organismes photosynthétiques oxygénés (voir section 5), deux centres de réaction différents, appelés photosystème II et photosystème I, fonctionnent simultanément mais en série. Dans la lumière, le photosystème II alimente le photosystème I en électrons. Les électrons sont transférés du photosystème II au photosystème I par des porteurs intermédiaires. La réaction nette est le transfert d'électrons d'une molécule d'eau au NADP+, produisant la forme réduite, NADPH. Dans le processus photosynthétique, une grande partie de l'énergie initialement fournie par l'énergie lumineuse est stockée sous forme d'énergie libre redox (une forme d'énergie libre chimique) dans le NADPH, pour être utilisée plus tard dans la réduction du carbone. De plus, les réactions de transfert d'électrons concentrent les protons à l'intérieur de la vésicule membranaire et créent un champ électrique à travers la membrane photosynthétique. Dans ce processus, les réactions de transfert d'électrons convertissent l'énergie libre redox en un potentiel électrochimique de protons. L'énergie stockée dans le potentiel électrochimique du proton est utilisée par un complexe protéique lié à la membrane (ATP-Synthase) pour attacher de manière covalente un groupe phosphate à l'adénosine diphosphate (ADP), formant l'adénosine triphosphate (ATP). Les protons traversent le complexe protéique ATP-Synthase qui transforme l'énergie libre électrochimique en un type d'énergie libre chimique connue sous le nom de potentiel de transfert de groupe phosphate (ou liaison phosphate à haute énergie) (Klotz, 1967). L'énergie stockée dans l'ATP peut être transférée à une autre molécule en transférant le groupe phosphate. L'effet net des réactions lumineuses est de convertir l'énergie radiante en énergie libre redox sous forme de NADPH et en énergie de transfert de groupe phosphate sous forme d'ATP. Dans les réactions lumineuses, le transfert d'un seul électron de l'eau au NADP+ implique environ 30 ions métalliques et 7 groupes aromatiques. Les ions métalliques comprennent 19 Fe, 5 Mg, 4 Mn et 1 Cu. Les aromatiques comprennent les quinones, la phéophytine, le NADPH, la tyrosine et une flavoprotéine. Le NADPH et l'ATP formés par les réactions lumineuses fournissent l'énergie nécessaire aux réactions sombres de la photosynthèse, appelées cycle de Calvin ou cycle photosynthétique de réduction du carbone. La réduction du CO2 atmosphérique en hydrate de carbone se produit dans la phase aqueuse du chloroplaste et implique une série de réactions enzymatiques. La première étape est catalysée par la protéine Rubisco (D-ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase/oxygénase), qui attache le CO2 à un composé à cinq carbones. La réaction produit deux molécules d'un composé à trois carbones. Les réactions biochimiques ultérieures impliquent plusieurs enzymes qui réduisent le carbone par transfert d'hydrogène et réarrangent les composés carbonés pour synthétiser les glucides. Le cycle de réduction du carbone implique le transfert et le réarrangement de l'énergie de liaison chimique.

Dans les organismes photosynthétiques anoxygéniques (voir section 6), l'eau n'est pas utilisée comme donneur d'électrons. Le flux d'électrons est cyclique et est entraîné par un seul photosystème, produisant un gradient électrochimique de protons qui est utilisé pour fournir de l'énergie pour la réduction du NAD+ par un atome H externe ou un donneur électronique (par exemple, H2S ou un acide organique) dans un processus connu sous le nom de "flux d'électrons inverse". La fixation du CO2 se produit par différentes voies dans différents organismes.

5. PHOTOSYNTHÈSE OXYGÉNIQUE

5.1 Chloroplastes - Structure et organisation
Chez les plantes, le processus de photosynthèse se produit à l'intérieur des chloroplastes, qui sont des organites présents dans certaines cellules. Les chloroplastes fournissent l'énergie et le carbone réduit nécessaires à la croissance et au développement des plantes, tandis que la plante fournit au chloroplaste du CO2, de l'eau, de l'azote, des molécules organiques et des minéraux nécessaires à la biogenèse des chloroplastes. La plupart des chloroplastes sont situés dans des cellules foliaires spécialisées, qui contiennent souvent 50 chloroplastes ou plus par cellule. Chaque chloroplaste est défini par une membrane d'enveloppe interne et externe et a la forme d'une lentille convexe de ménisque de 5 à 10 microns de diamètre (Fig. 2), bien que de nombreuses formes et tailles différentes puissent être trouvées dans les plantes. Pour plus de détails sur la structure des chloroplastes, voir Staehlin (1986). La membrane de l'enveloppe interne agit comme une barrière, contrôlant le flux de molécules organiques et chargées à l'intérieur et à l'extérieur du chloroplaste. L'eau passe librement à travers les membranes de l'enveloppe, tout comme d'autres petites molécules neutres comme le CO2 et l'O2. Il existe des preuves que les chloroplastes étaient autrefois des bactéries libres qui ont envahi une cellule non photosynthétique il y a longtemps. Ils ont conservé une partie de l'ADN nécessaire à leur assemblage, mais une grande partie de l'ADN nécessaire à leur biosynthèse se trouve dans le noyau cellulaire. Cela permet à une cellule de contrôler la biosynthèse des chloroplastes dans son domaine.

À l'intérieur du chloroplaste se trouve un système membranaire complexe, connu sous le nom de membrane photosynthétique (ou membrane thylakoïde), qui contient la plupart des protéines nécessaires aux réactions lumineuses. Les protéines nécessaires à la fixation et à la réduction du CO2 sont situées à l'extérieur de la membrane photosynthétique dans la phase aqueuse environnante. La membrane photosynthétique est composée principalement de lipides et de protéines de glycérol. Les lipides du glycérol sont une famille de molécules caractérisées par un groupe de tête polaire hydrophile et deux chaînes latérales d'acides gras hydrophobes. Dans les membranes, les molécules lipidiques s'organisent en bicouche, la tête polaire vers la phase aqueuse et les chaînes d'acides gras alignées à l'intérieur de la membrane formant un noyau hydrophobe (Fig. 3). La membrane photosynthétique est vésiculaire, définissant un espace fermé avec un espace d'eau externe (phase stromale) et un espace d'eau interne (lumière). L'organisation de la membrane photosynthétique peut être décrite comme des groupes de membranes empilées (comme des piles de pain pita ou chapati avec la poche interne représentant l'espace aqueux interne), interconnectées par des membranes non empilées qui dépassent des bords des piles (Fig. 2). Les expériences indiquent que l'espace aqueux interne de la membrane photosynthétique est probablement continu à l'intérieur du chloroplaste. On ne sait pas pourquoi la membrane photosynthétique forme une structure si compliquée. Pour comprendre l'énergétique de la photosynthèse, la structure compliquée peut être ignorée et la membrane photosynthétique peut être considérée comme une simple vésicule.

5.2 Absorption de la lumière - Le système d'antenne
La photosynthèse végétale est principalement pilotée par la lumière visible (longueurs d'onde de 400 à 700 nm) qui est absorbée par les molécules pigmentaires (principalement la chlorophylle a et b et les caroténoïdes). La structure chimique de la molécule de chlorophylle a est illustrée à la figure 4. Dans la chlorophylle b, CH3 dans le cycle II est remplacé par le groupe CHO. Les plantes apparaissent vertes à cause de la chlorophylle, qui est si abondante que des régions de la terre apparaissent vertes depuis l'espace. Le spectre d'absorption de la chlorophylle a et b du chloroplaste et des caroténoïdes ainsi que le spectre d'action de la photosynthèse d'un chloroplaste est illustré à la Fig. 5. La lumière est collectée par 200-300 molécules de pigment qui sont liées à des complexes protéiques de récolte de lumière situés dans la photosynthèse membrane. Les complexes de collecte de lumière entourent les centres de réaction qui servent d'antenne. La structure tridimensionnelle du complexe de récolte de lumière (Kühlbrandt et al., 1994) montre que la protéine détermine la position et l'orientation des pigments de l'antenne. La photosynthèse est initiée par l'absorption d'un photon par une molécule d'antenne, qui se produit en une femtoseconde environ (10-15 s) et provoque une transition de l'état électronique fondamental à un état excité. En 10-13 s, l'état excité décroît par relaxation vibrationnelle jusqu'au premier état singulet excité. Le sort de l'énergie de l'état excité est guidé par la structure de la protéine. En raison de la proximité d'autres molécules d'antenne avec des états d'énergie identiques ou similaires, l'énergie de l'état excité a une forte probabilité d'être transférée par transfert d'énergie de résonance à un voisin proche. Le transfert d'énergie d'exciton entre les molécules d'antenne est dû à l'interaction du moment dipolaire de transition des molécules. La probabilité de transfert dépend de la distance entre les dipôles de transition des molécules donneuse et acceptrice (1/R6), de l'orientation relative des dipôles de transition et du chevauchement du spectre d'émission de la molécule donneuse avec le spectre d'absorption de la molécule acceptrice (voir van Grondelle et Amesz, 1986). Les systèmes d'antennes photosynthétiques sont très efficaces pour ce processus de transfert. Dans des conditions optimales, plus de 90 % des quanta absorbés sont transférés en quelques centaines de picosecondes du système d'antenne au centre de réaction qui agit comme un piège pour l'exciton. Un modèle simple de l'antenne et de son centre de réaction est illustré à la Fig. 6.

La photochimie dans le photosystème II est initiée par la séparation des charges entre P680 et la phéophytine, créant P680+/Pheo-. La séparation des charges primaires prend environ quelques picosecondes (Fig. 8). Les étapes ultérieures de transfert d'électrons ont été conçues par évolution pour empêcher la séparation de charge primaire de se recombiner. Ceci est accompli en transférant l'électron dans les 200 picosecondes de la phéophytine à une molécule de plastoquinone (QA) qui est liée en permanence au photosystème II. Bien que la plastoquinone agisse normalement comme un accepteur à deux électrons, elle fonctionne comme un accepteur à un électron sur le site QA. L'électron sur QA- est ensuite transféré à une autre molécule de plastoquinone qui est faiblement liée au site QB. La plastoquinone au site QB diffère de l'AQ en ce qu'elle fonctionne comme un accepteur à deux électrons, devenant complètement réduite et protonée après deux changements photochimiques du centre de réaction. La réduction complète de la plastoquinone nécessite l'ajout de deux électrons et deux protons, c'est-à-dire l'ajout de deux atomes d'hydrogène. La plastoquinone réduite (Fig. 9) se détache alors du centre réactionnel et diffuse dans le noyau hydrophobe de la membrane. Après quoi, une molécule de plastoquinone oxydée trouve son chemin vers le site de liaison QB et le processus est répété. Comme le site QB est proche de la phase aqueuse externe, les protons ajoutés à la plastoquinone lors de sa réduction sont prélevés à l'extérieur de la membrane.

Le photosystème II est le seul complexe protéique connu qui peut oxyder l'eau, entraînant la libération d'O2 dans l'atmosphère. Malgré des années de recherche, on sait peu de choses sur les événements moléculaires qui conduisent à l'oxydation de l'eau. Sur le plan énergétique, l'eau est un mauvais donneur d'électrons. Le potentiel médian d'oxydo-réduction (Em,7) de l'eau est de +0,82 V (pH 7). Dans le photosystème II, cette réaction est entraînée par le centre de réaction oxydé, P680+ (le potentiel médian de P680/P680+ est estimé à +1,2 V à pH 7). La façon dont les électrons sont transférés de l'eau au P680+ reste un mystère (Govindjee et Coleman, 1990). Il est connu que P680+ oxyde une tyrosine sur la protéine D1 et que Mn joue un rôle clé dans l'oxydation de l'eau. Quatre ions Mn sont présents dans le complexe oxydant de l'eau. La spectroscopie d'absorption des rayons X montre que le Mn subit une oxydation induite par la lumière. L'oxydation de l'eau nécessite deux molécules d'eau et implique quatre renouvellements séquentiels du centre de réaction. Ceci a été montré par une expérience démontrant que la libération d'oxygène par le photosystème II se produit avec une dépendance à quatre flashs (Fig. 10 Joliot et al., 1969 Joliot et Kok, 1975). Chaque réaction photochimique crée un oxydant qui enlève un électron. La réaction nette entraîne la libération d'une molécule d'O2, le dépôt de quatre protons dans la phase aqueuse interne et le transfert de quatre électrons vers le site QB (produisant deux molécules de plastoquinone réduites) (examiné par Renger, 1993 Klein et al ., 1993 et ​​Lavergne et Junge , 1993).

Les centres de réaction du photosystème II contiennent un certain nombre de composants redox sans fonction connue. Un exemple est le cytochrome b559, une protéine hème, qui est un composant essentiel de tous les centres de réaction du photosystème II (discuté par Whitmarsh et Pakrasi, 1996). Si le cytochrome n'est pas présent dans la membrane, un centre de réaction PS II stable ne peut pas être formé. Bien que la structure et la fonction de Cyt b559 restent à découvrir, on sait que le cytochrome n'est pas impliqué dans l'activité enzymatique primaire de PS II, qui est le transfert d'électrons de l'eau à la plastoquinone. Pourquoi les centres de réaction PS II contiennent des composants redox qui ne sont pas impliqués dans les réactions enzymatiques primaires est une question déroutante. La réponse peut être trouvée dans les réactions chimiques inhabituelles qui se produisent dans PS II et le fait que le centre de réaction fonctionne à un niveau de puissance très élevé. Le photosystème II est une enzyme de transformation d'énergie qui doit basculer entre divers états à haute énergie qui impliquent la création des puissants oxydants nécessaires pour éliminer les électrons de l'eau et la chimie complexe de la réduction de la plastoquinone qui est fortement influencée par les protons. En saturant la lumière, un seul centre de réaction peut avoir un débit d'énergie de 600 eV/s (équivalent à 60 000 kW par mole de PS II). Le fonctionnement à un niveau de puissance aussi élevé endommage le centre de réaction.Il se peut que certains des composants redox "extra" dans le photosystème II puissent servir à protéger le centre de réaction.

Photosystem II a une autre caractéristique déroutante. Il a été démontré que de nombreuses plantes et algues possèdent un nombre important de centres de réaction du photosystème II qui ne contribuent pas au transport photosynthétique des électrons (par exemple, Chylla et Whitmarsh, 1989). On ne sait pas pourquoi les plantes consacrent des ressources à la synthèse de centres de réaction qui ne contribuent apparemment pas à la conversion d'énergie (pour des revues de l'hétérogénéité du photosystème II, voir Ort et Whitmarsh, 1990 Guenther et Melis, 1990 Govindjee, 1990 Melis, 1991 Whitmarsh et al., 1996 Lavergne et Briantais, 1996)

Le complexe photosystème I catalyse l'oxydation de la plastocyanine, une petite protéine Cu soluble, et la réduction de la ferrédoxine, une petite protéine FeS (Fig. 11). Le photosystème I est composé d'un hétérodimère de protéines qui agissent comme des ligands pour la plupart des porteurs d'électrons (Krauss et al., 1993). Le centre de réaction est desservi par un système d'antennes composé d'environ deux cents molécules de chlorophylle (principalement de la chlorophylle a) et la photochimie primaire est initiée par un dimère de chlorophylle a, P700. Contrairement au photosystème II, de nombreuses molécules de chlorophylle d'antenne dans le photosystème I sont liées aux protéines du centre de réaction. De plus, les centres FeS servent de porteurs d'électrons dans le photosystème I et, pour autant que l'on sache, le transfert d'électrons du photosystème I n'est pas couplé à la translocation de protons. La séparation de charge primaire se produit entre un donneur primaire, P700, un dimère de chlorophylle et un monomère de chlorophylle (Ao). Les événements et taux de transfert d'électrons ultérieurs sont illustrés sur la figure 12 (voir Golbeck, 1994).

5.4 Transport d'électrons
Le transport des électrons de l'eau au NADP+ nécessite trois complexes protéiques liés à la membrane fonctionnant en série - le photosystème II, le complexe cytochrome bf et le photosystème I (Fig. 3). Les électrons sont transférés entre ces grands complexes protéiques par de petites molécules mobiles (plastoquinone et plastocyanine chez les plantes). Parce que ces petites molécules transportent des électrons (ou des atomes d'hydrogène) sur des distances relativement longues, elles jouent un rôle unique dans la conversion d'énergie photosynthétique. Ceci est illustré par la plastoquinone (PQ), qui remplit deux fonctions clés. La plastoquinone transfère des électrons du centre de réaction du photosystème II au complexe cytochrome bf et transporte des protons à travers la membrane photosynthétique (voir Kallas, 1994). Il le fait en faisant passer des atomes d'hydrogène à travers la membrane du photosystème II au complexe cytochrome bf. Parce que la plastoquinone est hydrophobe, son mouvement est limité au noyau hydrophobe de la membrane photosynthétique. La plastoquinone fonctionne en diffusant à travers la membrane jusqu'à ce qu'en raison de collisions aléatoires, elle se lie à un site spécifique du complexe photosystème II. Le centre de réaction du photosystème II réduit la plastoquinone au site QB en ajoutant deux électrons et deux protons créant PQH2. La molécule de plastoquinone réduite se délie du photosystème II et diffuse de manière aléatoire dans la membrane photosynthétique jusqu'à ce qu'elle rencontre un site de liaison spécifique sur le complexe cytochrome bf. Le complexe cytochrome bf est un complexe protéique lié à la membrane qui contient quatre porteurs d'électrons, trois cytochromes et un centre FeS. La structure cristalline a été résolue pour le cytochrome f du navet (Martinez et al., 1994) et le centre FeS des mitochondries du cœur bovin (Iwata et al., 1996). Dans une séquence de réaction compliquée qui n'est pas entièrement comprise, le complexe cytochrome bf élimine les électrons de la plastoquinone réduite et facilite la libération des protons dans l'espace aqueux interne. Les électrons sont finalement transférés au centre de réaction du photosystème I. Les protons libérés dans l'espace aqueux interne contribuent à l'énergie libre chimique des protons à travers la membrane.

Le transfert d'électrons du complexe cytochrome bf au photosystème I est médié par une petite protéine Cu, la plastocyanine (PC). La plastocyanine est soluble dans l'eau et agit dans l'espace d'eau interne de la membrane photosynthétique. Le transfert d'électrons du photosystème I au NADP+ nécessite de la ferrédoxine, une petite protéine FeS, et de la ferredoxine-NADP oxydoréductase, une flavoprotéine périphérique qui opère sur la surface externe de la membrane photosynthétique. La ferrédoxine et le NADP+ sont solubles dans l'eau et se trouvent dans la phase aqueuse externe.

Le trajet des électrons est largement déterminé par l'énergétique de la réaction et la distance entre les porteurs. L'affinité électronique des porteurs est représentée sur la figure 13 par leurs potentiels médians, qui montrent l'énergie libre disponible pour les réactions de transfert d'électrons dans des conditions d'équilibre. (Il convient de garder à l'esprit que les conditions de réaction pendant la photosynthèse ne sont pas en équilibre.) Après la séparation des charges primaires, le transport des électrons est énergétiquement descendant (d'un potentiel redox inférieur (plus négatif) à un potentiel redox plus élevé (plus positif).). C'est le flux descendant d'électrons qui fournit de l'énergie gratuite pour la création d'un gradient chimique de protons.

Les membranes photosynthétiques limitent efficacement le transport des électrons à deux dimensions. Pour les porteurs d'électrons mobiles, limiter la diffusion à deux dimensions augmente le nombre de rencontres aléatoires (Whitmarsh, 1986). De plus, comme la plastocyanine est mobile, tout complexe cytochrome bf peut interagir avec un certain nombre de complexes du photosystème I. Il en est de même pour la plastoquinone, qui opère couramment à une stoechiométrie d'environ six molécules par complexe photosystème II.

La réaction est énergétiquement ascendante (DG = +32 kJ/mol) et est entraînée par le transfert de protons à travers la protéine ATP synthase. Le complexe ATP Synthase est composé de deux sous-unités principales, CF0 et CF1 (Fig. 14). La sous-unité CF0 traverse la membrane photosynthétique et forme un canal de protons à travers la membrane. La sous-unité CF1 est fixée au sommet du CF0 à l'extérieur de la membrane et est située dans l'espace aqueux. CF1 est composé de plusieurs sous-unités protéiques différentes, appelées a, b, g, d et e. La partie supérieure de la sous-unité CF1 est composée de trois ab-dimères qui contiennent les sites catalytiques pour la synthèse d'ATP. Une percée majeure récente a été l'élucidation de la structure de l'ATPase des mitochondries du cœur de bœuf par Abrahams et al. (1994). Les processus moléculaires qui associent le transfert de protons à travers la protéine à l'addition chimique de phosphate à l'ADP sont mal compris. Il est connu que la phosphorylation peut être entraînée par un gradient de pH, un champ électrique transmembranaire ou une combinaison des deux. Des expériences indiquent que trois protons doivent traverser le complexe ATP synthase pour la synthèse d'une molécule d'ATP. Cependant, les protons ne sont pas impliqués dans la chimie de l'ajout de phosphate à l'ADP. Paul Boyer et ses collaborateurs ont proposé un mécanisme de site de liaison alterné pour la synthèse d'ATP (Boyer, 1993). Un modèle basé sur leur proposition est qu'il y a trois sites catalytiques sur chaque CF1 qui cycle entre trois états différents (Fig. 15). Les états diffèrent par leur affinité pour l'ADP, le Pi et l'ATP. À tout moment, chaque site est dans un état différent. Ce modèle est soutenu par la structure de l'ATPase élucidée par Abrahams et al. (1994). Initialement, un site catalytique sur CF1 lie un ADP et une molécule de phosphate inorganique de manière relativement lâche. En raison d'un changement de conformation de la protéine, le site devient un site de liaison étroit, qui stabilise l'ATP. Ensuite, le transfert de protons induit une altération de la conformation des protéines qui amène le site à libérer la molécule d'ATP dans la phase aqueuse. Dans ce modèle, l'énergie du gradient électrochimique de protons est utilisée pour abaisser l'affinité du site pour l'ATP, permettant sa libération dans la phase aqueuse. Les trois sites sur CF1 agissent en coopération, c'est-à-dire que les états conformationnels des sites sont liés. Il a été proposé que les protons affectent le changement de conformation en entraînant la rotation de la partie supérieure (les trois ab-dimères) de CF1. Un tel modèle de rotation a récemment été soutenu par l'enregistrement d'une rotation de la sous-unité gamma par rapport aux sous-unités alpha-bêta par Sabbert et al. (1996). Ce mécanisme de site tournant nécessiterait des vitesses aussi élevées que 100 tours par seconde. Il est à noter que les flagelles qui propulsent certaines bactéries sont entraînés par une pompe à protons et peuvent tourner à 60 tours par seconde.

5.7 Synthèse des glucides
Toutes les plantes et algues éliminent le CO2 de l'environnement et le réduisent en glucides par le cycle de Calvin. Le processus est une séquence de réactions biochimiques qui réduisent le carbone et réarrangent les liaisons pour produire des glucides à partir de molécules de CO2. La première étape est l'ajout de CO2 à un composé à cinq carbones (ribulose 1,5-bisphosphate) (Fig. 16). Le composé à six carbones est divisé, donnant deux molécules d'un composé à trois carbones (3-phosphoglycérate). Cette réaction clé est catalysée par Rubisco, un grand complexe de protéines hydrosolubles. La structure tridimensionnelle a été déterminée par analyse aux rayons X pour Rubisco isolé de tabac (Schreuder et al. 1993) d'une cyanobactérie (Synechococcus) (Newman et Gutteridge, 1993) et d'une bactérie pourpre (Rhodospirillum rubrum) (Schneider et al. 1990). La réaction de carboxylation est énergiquement descendante. Le principal apport d'énergie dans le cycle de Calvin est la phosphorylation par l'ATP et la réduction subséquente par le NADPH du composé initial à trois carbones formant un sucre à trois carbones, le triosephosphate. Une partie du triosephosphate est exportée du chloroplaste et constitue la pierre angulaire de la synthèse de molécules plus complexes. Dans un processus connu sous le nom de régénération, le cycle de Calvin utilise certaines des molécules de triosephosphate pour synthétiser le ribulose 1,5-bisphosphate riche en énergie nécessaire à la réaction de carboxylation initiale. Cette réaction nécessite l'apport d'énergie sous la forme d'un ATP. Au total, treize enzymes sont nécessaires pour catalyser les réactions du cycle de Calvin. Le rendement de conversion énergétique du cycle de Calvin est d'environ 90 %. Les réactions n'impliquent pas de transduction d'énergie, mais plutôt le réarrangement de l'énergie chimique. Chaque molécule de CO2 réduite en sucre [CH2O]n nécessite 2 molécules de NADPH et 3 molécules d'ATP.

Rubisco est une enzyme bifonctionnelle qui, en plus de lier le CO2 au ribulose bisphosphate, peut également lier l'O2. Cette réaction d'oxygénation produit le 3-phosphoglycérate qui est utilisé dans le cycle de Calvin et un composé à deux carbones (2-phosphoglycolate) qui n'est pas utile pour la plante. En réponse, un ensemble compliqué de réactions (connues sous le nom de photorespiration) est initiée qui sert à récupérer le carbone réduit et à éliminer le phosphoglycolate. La réaction d'oxygénation de Rubisco semble n'avoir aucune utilité pour la plante. Certaines plantes ont développé des structures spécialisées et des voies biochimiques qui concentrent le CO2 près de Rubisco. Ces voies (C4 et CAM), servent à diminuer la fraction des réactions d'oxygénation (voir le chapitre de ce volume sur la réduction du carbone).

6. PHOTOSYNTHÈSE ANOXYGÉNIQUE

La détermination des structures tridimensionnelles du centre de réaction des bactéries pourpres non soufrées, Rhodopseudomonas viridis et Rhodobacter sphaeroides, a fourni une opportunité sans précédent de comprendre la structure et la fonction des centres de réaction photosynthétiques (Deisenhofer et al., 1984, 1985 Feher et al., 1989 Lancaster et al., 1995). Les positions des composants de transfert d'électrons dans le centre de réaction de Rhodobacter sphaeroides sont indiquées sur la figure 17 (Norris et van Brakel, 1986), et celles des trois sous-unités protéiques L, M et H, sur la figure 18. La réaction le centre contient quatre molécules de bactériochlorophylle et deux molécules de bactériophéophytine. Deux des molécules de bactériochlorophylle forment le donneur principal (P870). À l'heure actuelle, il existe une controverse quant à savoir si une molécule de bactériochlorophylle est un intermédiaire dans le transfert d'électrons du P870 à la bactériophéophytine. Cependant, il existe un accord sur le fait que les étapes restantes impliquent deux molécules de quinone (QA et QB) et que deux changements du centre de réaction entraînent la libération de quinone réduite (QH2) dans la membrane photosynthétique. Bien qu'il existe un Fe non hémique entre les deux molécules de quinone, il existe des preuves convaincantes que ce Fe n'est pas directement impliqué dans le transfert d'un électron de QA à QB. Étant donné que le donneur principal (P870), les accepteurs de bactériophéophytine et de quinone du centre de réaction bactérien violet sont similaires au centre de réaction du photosystème II, le centre de réaction bactérien est utilisé comme guide pour comprendre la structure et la fonction du photosystème II.

Le transfert d'électrons entraîné par la lumière est cyclique chez Rhodobacter sphaeroides et d'autres bactéries violettes (Fig. 19). Le centre de réaction produit de la quinone réduite, qui est oxydée par le complexe du cytochrome bc. Les électrons du complexe cytochrome bc sont transférés vers un porteur d'électrons soluble, le cytochrome c2, qui réduit le donneur primaire oxydé P870+. Le produit des réactions de transfert d'électrons entraînées par la lumière est l'ATP. Les électrons pour la réduction du carbone sont extraits d'un donneur organique, tel que le succinate ou le malate ou de l'hydrogène gazeux, mais pas par le centre de réaction. L'énergie nécessaire pour réduire le NAD+ est fournie par le transport d'électrons cyclique entraîné par la lumière sous la forme d'ATP. La voie de transformation de l'énergie est compliquée. Le succinate est oxydé par une enzyme liée à la membrane (succinate déshydrogénase) qui transfère les électrons à la quinone, qui est la source d'électrons pour la réduction du NAD+. Cependant, le transfert d'électrons de la quinone réduite vers le NAD+ est énergétiquement ascendant. Par un mécanisme mal compris, une enzyme liée à la membrane est capable d'utiliser l'énergie stockée dans le potentiel électrochimique du proton pour conduire les électrons de la quinone réduite vers le NAD+.


Stimulant Cl - sécrétion

Les leucokinines sont une famille d'octapeptides, que Holman et ses collaborateurs ont d'abord isolés de la tête du cafard. Leucophée maderaeen utilisant les contractions de l'intestin postérieur de la blatte comme test biologique (Holman et al., 1989). La séquence pentamère Phe-X-Ser-Trp-Gly-NH2, se terminant par un amide C-terminal, est commun à la plupart des kinines. La stimulation de la contraction et l'évacuation du tractus gastro-intestinal nous ont incités à rechercher d'autres effets excréteurs en amont. Nous avons découvert que les leucokinines de la blatte ont une activité diurétique dans les tubules de Malpighi du moustique de la fièvre jaune (Hayes et al., 1989). Les taux de sécrétion de fluide ont augmenté de 0,49 nl min -1 à 0,91 nl min -1 en présence de leucokinine-VIII (tableau 3). Depuis lors, des effets diurétiques des leucokinines ont été observés chez le grillon domestique (Acheta domesticus Coast et al.,1990), criquet (Locusta migratrice Schoofs et al., 1992), le ver de l'épi du maïs (Helicoverpa zea Blackburn et al., 1995), la mouche des fruits (O'Donnell et al., 1996) et la mouche domestique (Musca domestica Iaboni et al., 1998). La culékinine est la kinine native du moustique, que le laboratoire de Hayes a isolée et séquencée (Hayes et al., 1994). Comme la leucokinine, elle stimule la contraction de l'intestin postérieur chez la blatte et diminue la tension transépithéliale dans les tubules de Malpighi du moustique.

L'analyse du liquide sécrété par Aèdes Les tubules de Malpighi en présence de leucokinine-VIII ont révélé des augmentations significatives de la sécrétion transépithéliale de NaCl et de KCl, comme si la leucokinine rendait le Cl - plus facilement disponible pour la sécrétion transépithéliale avec Na + et K + (tableau 3). Des études électrophysiologiques confirment cette hypothèse : la leucokinine-VIII a augmenté la conductance transépithéliale Cl - (Pannabecker et al., 1993). En particulier, l'ajout de leucokinine-VIII au milieu péritubulaire de Aèdes Les tubules de Malpighi entraînent l'effondrement immédiat de la tension transépithéliale vers 0 mV ainsi qu'une diminution de 6 fois la résistance transépithéliale (Pannabecker et al., 1993). De faibles valeurs de tension et de résistance transépithéliales sont caractéristiques des épithéliums dits « fuyants », qui sont spécialisés pour transporter le soluté et l'eau à des débits élevés. Ainsi, la leucokinine-VIII a transformé un épithélium modérément "serré", avec une tension transépithéliale de 59,3 mV (lumen-positive) et une résistance transépithéliale de 57,8 cm 2 , en un épithélium " fuyant ", avec une tension transépithéliale de seulement 5,7 mV ( lumière positive) et une résistance transépithéliale de seulement 9,9Ωcm 2 (Pannabecker et al., 1993). Le changement a eu lieu avec une vitesse semblable à celle d'un interrupteur et s'est tout aussi rapidement inversé lors du lessivage de la leucokinine (Beyenbach, 2003).

L'effet diurétique de la leucokinine dépend du Cl - , ce qui confirme l'effet sur une voie de transport empruntée par le Cl - (Hayes et al., 1989 Pannabecker et al., 1993). Deux voies de transport Cl - sont possibles. Le laboratoire d'O'Donnell a des preuves de Cl - passant à travers les cellules étoilées dans Drosophile Les tubules de Malpighi (O'Donnell et al., 1998), ce qui a été confirmé dans le laboratoire de Dow, où la leucokinine augmente les concentrations intracellulaires de Ca 2+ , le deuxième messager de la leucokinine, dans les cellules étoilées mais pas dans les cellules principales (Terhzaz et al ., 1999). Bien que nous ayons trouvé des canaux Cl - dans la membrane apicale des cellules étoilées des tubules de Malpighi de A. aegypti(O'Connor et Beyenbach, 2001), les preuves prépondérantes indiquent une voie Cl - extracellulaire activée par la leucokinine. En particulier, la leucokinine affecte une seule barrière épithéliale telle que celle attendue de la jonction cloisonnée (serrée) située entre les cellules épithéliales. La preuve de l'augmentation de la conductance Cl - des jonctions cloisonnées dans A. aegypti Les tubules de Malpighi sont les suivants : (1) Cl transépithélial - les potentiels de diffusion n'approchent que 15% des potentiels de Nernst dans des conditions de contrôle mais 77% en présence de leucokinine, ce qui signifie une augmentation majeure du Cl transépithélial - conductance (2) le grand Cl transépithélial symétrique - potentiels de diffusion pour le Cl dirigé à la fois lumière-bain et bain-lumière - les gradients sont plus susceptibles d'être générés à travers une seule barrière telle que la jonction cloisonnée qu'à travers deux membranes cellulaires en série (3) l'effet de la leucokinine sur la résistance transépithéliale est complètement inversée en abaissant la concentration en Cl - de 150 mmol l -1 à 5 mmol l -1 dans les solutions extracellulaires et non intracellulaires (de manière significative, la concentration en Cl - doit être abaissée des deux côtés de l'épithélium pour inverser la effets de la leucokinine, témoignant d'une voie Cl - extracellulaire activée par la leucokinine) et (4) les changements électrophysiologiques observés de l'épithélium serré à l'épithélium fuyant induits par la leucokinine nin ne peut s'expliquer que par une augmentation de la conductance paracellulaire. Enfin, la leucokinine active également la conductance transépithéliale Cl - dans les tubules inhibée par le cyanure ou le dinitrophénol, indiquant un changement de conductance d'une structure telle que la jonction septate qui ne dépend pas immédiatement du métabolisme cellulaire (Beyenbach, 2003 Pannabecker et al., 1993) .

Chez le grillon domestique, la leucokinine a des effets diurétiques similaires à ceux de Drosophile Tubules de Malpighi (Coast, 2001 Coast et al., 1990). De plus, le Ca 2+ médie les effets de la leucokinine dans les deux Acheta et Drosophile Tubules de Malpighi (Coast, 1998 O'Donnell et al., 1998). La différence notable entre les deux espèces est que les tubules de Malpighi du grillon n'ont pas de cellules étoilées (Coast, 2001 Hazelton et al., 1988).En conséquence, la présence de cellules étoilées n'est pas une condition nécessaire pour que la leucokinine exprime son mécanisme d'action diurétique. En effet, des études récentes dans notre laboratoire ont montré que les cellules étoilées ne sont pas nécessaires pour médier les effets de la leucokinine dans les tubules de Malpighi de A. aegypti (M. J. Yu et K. W. Beyenbach, soumis).

Partout où la voie de transduction du signal de la leucokinine a été étudiée, le Ca 2+ s'est avéré servir de second messager (Coast, 1998). Les mesures réelles des concentrations intracellulaires de Ca 2+ montrent que la leucokinine augmente les concentrations de Ca 2+ dans les cellules étoilées des tubules de Malpighi de la mouche des fruits (O'Donnell et al., 1998) et dans les cellules principales des tubules de Malpighi du grillon domestique (Coast, 1998 ). Des études dans notre laboratoire ont montré que le Ca 2+ extra- et intracellulaire est nécessaire à la transduction du signal dans Aèdes Tubules de Malpighi (Yu et Beyenbach, 2002). Le Ca 2+ dans le milieu péritubulaire ou l'hémolymphe est particulièrement important. En l'absence de Ca 2+ péritubulaire, la leucokinine-VIII ne produit que des tentatives partielles et transitoires (oscillantes) pour produire l'état épithélial qui fuit. Pour observer le passage complet et durable à l'épithélium qui fuit, le Ca 2+ doit pouvoir pénétrer dans la cellule à partir du milieu péritubulaire ou de l'hémolymphe. Les canaux Ca 2+ sensibles à la nifédipine dans la membrane basolatérale des cellules principales qui sont activées par la leucokinine assurent la médiation de cette entrée Ca 2+. Des études détaillées des rôles relatifs du Ca 2+ intra- et extracellulaire dans AèdesLes tubules de Malpighi suggèrent la séquence de transduction du signal illustrée sur la figure 5. La leucokinine se lie au récepteur couplé à la protéine G au niveau de la membrane basolatérale des cellules principales. Les récepteurs de la leucokinine qui ont été isolés des escargots d'étang (Lymnaea stagnalis), les tiques du bétail (Boophilus microplus) et la mouche des fruits ont une séquence compatible avec un récepteur couplé aux protéines G (Radford et al., 2002 Holmes et al., 2003). De plus, AlF4 - , activateur connu des protéines G, duplique les effets de la leucokinine dans Aèdes Tubes de Malpighi (Yu et Beyenbach, 2001). On pense que la stimulation de la protéine G active la phospholipase C et génère de l'inositol (1,4,5)-triphosphate et du diacylglycérol. IP3continue à libérer le Ca 2+ intracellulaire des réserves. L'augmentation subséquente de la concentration cytoplasmique de Ca 2+ et/ou l'épuisement des réserves intracellulaires de Ca 2+ activent les canaux Ca 2+ dans la membrane basolatérale. Le Ca 2+ extracellulaire entrant dans la cellule produit et maintient l'épithélium dans un état de fuite tant que la leucokinine est présente. La façon dont le Ca 2+ ou d'autres agents provoquent l'augmentation de la conductance ou de la perméabilité jonctionnelle est actuellement un domaine d'investigation actif (Beyenbach, 2003). Les cellules étoilées peuvent bien médier la sécrétion transépithéliale de Cl - dans des conditions de contrôle dans Aèdes tubules de Malpighi. Cependant, en présence de leucokinine, une conductance de Cl - jonctionnelle cloisonnée médie la sécrétion transépithéliale de Cl - en présence de leucokinine.


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