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Pourquoi la distance de migration dépend-elle du log du poids moléculaire dans la SDS-PAGE ?

Pourquoi la distance de migration dépend-elle du log du poids moléculaire dans la SDS-PAGE ?


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Je veux vraiment savoir pourquoi dans le résultat de la SDS PAGE, le log du poids moléculaire (MW) et la distance de migration (distance du puits de chargement) ont une relation linéaire. Pourquoi est-ce log (MW) au lieu de MW ? Merci!


Une courbe standard SDS-PAGE de Rf vs LogMW est linéaire car la norme qui vous est donnée est conçue pour se comporter de cette façon. Une courbe SDS-PAGE étendue montrerait que le graphe réel est sigmoïde : les structures trop grandes ne peuvent pas entrer dans la matrice, et trop petites elles la traversent. Votre étalon a pris en compte le % composant le gel et la taille des protéines dont se compose l'étalon, ce qui garantit que vous obtenez les points de données linéaires sur le graphique semi-log.

Si nous regardons les données brutes bien que tracées linéairement, le graphique n'est pas entièrement linéaire. Les données sont beaucoup plus jolies et triviales à reconvertir en MW si nous transformons le MW. Ce sont les mêmes données, simplement transformées mathématiquement. Un peu plus de lecture à ce sujet ici.


La concentration d'acrylamide détermine la direction et l'ampleur des déplacements de gel de protéine membranaire hélicoïdale

SDS/PAGE est une technique d'analyse des protéines universellement utilisée en biochimie, biologie cellulaire, immunologie et virologie, où les protéines sont séparées par taille sur une matrice de gel de polyacrylamide. Cependant, la plupart des protéines membranaires hélicoïdales, qui sont des biomolécules qui constituent 20 à 30% des génomes et la majorité des cibles médicamenteuses, migrent vers des positions sur SDS/PAGE qui ont été pendant des décennies de manière imprévisible plus grandes ou plus petites que leur taille réelle. Nous avons constaté que l'amplitude et la direction de la migration parmi les mimétiques des protéines membranaires sont contrôlées par la concentration d'acrylamide dans le gel. Nos résultats facilitent l'analyse SDS/PAGE simple de ces biomolécules importantes.


Pourquoi les résidus de proline ralentissent-ils la migration des protéines en SDS-PAGE ?

Mais, sur la base des calculs à partir de ses résidus d'acides aminés, la masse de p53's n'est en réalité que de 43,7 kDa. Cette différence est due au nombre élevé de résidus de proline dans la protéine, ce qui ralentit sa migration sur SDS-PAGE, la faisant ainsi apparaître plus lourde qu'elle ne l'est réellement.[7] Cet effet est observé avec p53 d'une variété d'espèces, y compris les humains, les rongeurs, les grenouilles et les poissons.

De wiki. Qu'est-ce que la proline fait cela ? Est-ce seulement observé dans p53? Merci j'avance.

Ainsi, les gels de polyacrylamide sont fondamentalement de longues chaînes linéaires d'un polymère qui sont réticulées. La réticulation entre les chaînes linéaires prend quelque chose qui ressemble à l'origine à deux bâtons côte à côte et les transforme en une échelle. Et le gel entier n'est pas juste une échelle, c'est un champ énorme qui en est absolument rempli.

Ce n'est pas le poids de l'objet qui limite la vitesse à laquelle il peut aller d'un bout du champ à l'autre, c'est la facilité avec laquelle l'objet peut franchir les barreaux des échelles. Il se trouve que la facilité avec laquelle quelque chose peut passer à travers les trous a tendance à être assez bien corrélé avec son poids, mais ce n'est pas toujours le cas.

Sur une liaison peptidique, vous avez le carbone sp2 du groupe carbonyle d'un acide aminé lié à l'azote de l'amine d'un autre acide aminé. La liaison entre ces deux atomes ne tourne généralement pas car il existe une structure de résonance qui peut se former et cela donne à la liaison un caractère de double liaison partielle, et les doubles liaisons ne tournent pas.

Ensuite, vous avez l'azote susmentionné également lié au carbone sp3 qui a le groupe qui fait de l'acide aminé l'acide aminé qu'il est. Mais ce n'est qu'une seule liaison et il n'y a pas de structure de résonance qui empêche la liaison de tourner. Cependant, dans la proline, le groupe se reboucle et se rattache à l'azote. Si vous attachez quelque chose qui peut normalement pivoter à quelque chose qui ne peut pas pivoter à partir de deux positions différentes, vous supprimez la capacité de rotation de cette chose. Le carbone sp3 de la proline est attaché deux fois à un azote qui ne peut pas tourner.

Il a également un angle génial qui équivaut essentiellement à un pli dans une chaîne qui ne peut pas disparaître. La proline en soi n'est pas une chose importante qui rend difficile le passage à travers les trous, mais il y a toute cette autre protéine au-delà du pli qui doit aussi passer à travers le trou et, dans une certaine mesure, elle est forcée dans une position étrange qui n'est pas facile à passer à travers les trous.

Si vous avez une tonne de problèmes comme celui-ci, vous pouvez avoir du mal à franchir les échelons de l'échelle, et bien que la molécule elle-même ne pèse pas autant qu'une autre molécule, elle aura toujours plus de mal à passer d'un bout à l'autre. du champ à l'autre.

Encore une fois, le gel ne sépare pas les molécules en poids, il les sépare en fonction de la facilité avec laquelle elles passent à travers les trous. La totalité de la "masse moléculaire basée sur la distance de migration à travers un gel de polyacrylamide" n'est qu'une approximation. C'est généralement bon, mais il y a des cas où ce n'est pas le cas.


Den Biotechniques

Les méthodes techniques biochimiques sont des outils très importants en bioanalyse.

Quels facteurs affectent les méthodes d'électrophorèse

L'électrophorèse est l'un des outils importants des laboratoires de diagnostic, des laboratoires pharmaceutiques, des laboratoires médico-légaux et de nombreux autres laboratoires. Tout d'abord, nous devons savoir Qu'est-ce que l'électrophorèse? L'électrophorèse est le mouvement de particules dispersées par rapport à un fluide sous l'influence d'un champ électrique spatialement uniforme.

Ce phénomène électro-cinétique a été observé pour la première fois en 1807 par Ferdinand Frédéric Reuss (Moscow State University), qui a remarqué que l'application d'un champ électrique constant faisait migrer des particules d'argile dispersées dans l'eau. Cette méthode a été développée par “Arne.W.K.Tiselius” en 1937

Elle est finalement causée par la présence d'une interface chargée entre la surface des particules et le fluide environnant.

Facteurs affectant l'électrophorèse :

Le taux de migration (séparation des particules) lors de l'électrophorèse dépendra des facteurs suivants :

1. L'échantillon :
 
Le rapport charge/masse  de  l'échantillon  dicte  sa mobilité électrophorétique .  La  masse  consiste  en 
seulement la taille (poids moléculaire) mais aussi la forme de la molécule. 

une charge:Plus la charge est élevée, plus la mobilité électrophorétique est importante. #160 le médium. 
b) Taille : Les plus grosses molécules ont une petite mobilité électrophorétique par rapport aux plus petites particules. 
c) Forme : La protéine globulaire migrera plus vite que la protéine fibreuse
 

2. Le champ électrique :
Le taux de migration sous gradient de potentiel unitaire est appelé « Mobilité de l'ion » 8221. . Une augmentation du gradient de potentiel augmente le taux de migration.
 
3. Le médium :
Le milieu inerte peut exercer des effets d'adsorption et de tamisage moléculaire sur la particule en influençant son taux des migrations. 

Le  choix  du  tampon  dépend  du  type  de  l'échantillon  soumis à l'électrophorèse. 
 
b) Force ionique : La force ionique (I) est une mesure de l'environnement électrique des ions dans un sol ) proportion portée par les ions de l'échantillon.

Lorsque la force ionique diminue, une plus grande part du courant est transportée par les ions de l'échantillon, ce qui entraîne une séparation plus rapide.

Noter: La force ionique utilisée est généralement comprise entre 0,05 et 0,1M.

c) pH :
  Le pH détermine le degré d'ionisation des composés organiques, il peut également affecter la vitesse de migration de ces composés. Lorsque l'augmentation du pH, augmente l'ionisation des acides organiques. Diminution du pH, augmente l'ionisation des bases organiques. Par exemple.: un ampholyte (acide aminé) - L'acide aminé a à la fois des propriétés acides et basiques

Lire la suite: Chromatographie, types, principe et applications.


Comment puis-je améliorer les résultats de mes SDS PAGE ?

Frottis dans les gels pourrait être le résultat d'agrégats produits pendant le processus de chauffage. Même si FDS-PAGE déplie et protège la protéine de l'agrégation, le processus de chauffage produit parfois des agrégats « incassables » avec des tailles variables qui pénètrent dans le gel et créer un diffamer.

De même, pourquoi le SDS est-il ajouté à l'échantillon et au gel ? FDS-PAGE sépare les protéines principalement en masse car le détergent ionique FDS se dénature et se lie aux protéines pour les rendre uniformément chargées négativement. Ainsi, lorsqu'un courant est appliqué, tout FDS-protéines liées dans un échantillon migrera à travers le gel vers l'électrode chargée positivement.

Les gens demandent également combien de temps dois-je exécuter SDS PAGE ?

Les conditions typiques incluent des fonctionnements à 100-150 volts pendant 40-60 minutes ou jusqu'à ce que le front de teinture ait atteint le bas du gel. Le laisser Cours trop longue entraînera la perte de vos bandes de poids moléculaire inférieur.

Quelle est la différence entre SDS PAGE et Western blot ?

FDS-PAGE (1D) sépare les protéines en fonction du poids moléculaire, tandis que buvardage occidental est fait pour détecter la protéine d'intérêt en utilisant des anticorps spécifiques.


Purification et caractérisation de la ferrédoxine-NADP+ réductase à partir de chloroplastes de S. oleracea

Partie 1 : Electrophorèse et transfert de protéines dénaturées sur nitrocellulose

Se référer à l'exercice dans lequel le FNR a été soumis à une électrophorèse sur des gels de polyacrylamide coulés dans des solutions de dodécyl sulfate pour la préparation du gel de polyacrylamide (12,5 % de gel séparateur). Le tableau de cet exercice spécifie également les quantités de dodécyl sulfate, de 2-sulfanyléthanol, de glycérol et de colorant de suivi à ajouter à chaque échantillon de protéine, ainsi que le chauffage de l'échantillon dans le bain d'eau bouillante avant l'électrophorèse.

Effectuez l'électrophorèse comme vous le faisiez auparavant. La différence dans la situation actuelle est que vous pourrez observer les marqueurs séparés les uns des autres. N'oubliez pas de mesurer la distance parcourue par le colorant marqueur pendant la période de l'électrophorèse. Vous devez mesurer son mouvement par rapport à un ou deux des étalons préteints, qui seront reportés et visibles sur la feuille de nitrocellulose.

Les temps nécessaires à chaque étape de la procédure d'électrophorèse sur gels de polyacrylamide :

Préparation du moule pour le polyacrylamide (10 minutes).

Préparation du gel séparateur d'acrylamide 12,5 % et préparation des échantillons pour l'électrophorèse (40 minutes).

Préparation du gel d'empilement d'acrylamide à 4,5% (25 minutes).

Chargement et réalisation de l'électrophorèse (1,8 heures).

Démoulage du gel (10 minutes).

Un volume approprié de solution tampon utilisée pour l'électrotransfert doit être dégazé pendant au moins 1 h avant d'être versé dans la chambre. Cela minimisera la formation de mousse lorsque le courant est appliqué.

Mettre en place l'appareil pour l'électrotransfert (20 min).

Lorsque le front de colorant s'est déplacé presque jusqu'au fond du gel de polyacrylamide, arrêtez l'électrophorèse et suivez les instructions fournies ci-dessous (Figure 1.29) pour la mise en place de l'électrotransfert. Portez toujours des gants lorsque vous manipulez de la nitrocellulose car vos doigts sont recouverts de protéines qui pourraient s'y adsorber. N'oubliez pas que votre peau elle-même est presque entièrement constituée de protéines. Assurez-vous de marquer la feuille de nitrocellulose (crayon n°2) pour l'orientation.

Exécutez l'électrotransfert pendant la nuit (16 à 22 h) à 100 mA, courant constant (généralement autour de 30 V). La raison pour laquelle le courant constant est choisi dans ce cas est d'éviter l'échauffement qui se produirait si le courant était trop important. Pendant cette période d'électrotransfert, les polypeptides dans le polyacrylamide migreront latéralement hors du polyacrylamide et dans la feuille de nitrocellulose.


1 réponse 1

C'est probablement une bonne chose de comparer ici l'électrophorèse des protéines avec l'électrophorèse de l'ADN. Pour l'ADN, vous savez qu'il a un squelette de phosphosucre qui vient avec une charge négative à la température ambiante $mathrm$ par groupe phosphate. Cela signifie que le rapport charge-masse, comme l'indique la citation, est similaire, quelle que soit la longueur du fragment d'ADN. (Pas identiques, car différentes bases ont des masses différentes et l'ADN a généralement une distribution de bases apparemment aléatoire.) Pourtant, elles se déplacent toujours à des vitesses différentes.

En effet, le gel est essentiellement une toile d'araignée pour le fragment d'ADN. Il doit en quelque sorte trouver les pores du gel et passer à travers. Ces pores ont des tailles différentes et réparties de manière aléatoire et ne sont pas tous parfaitement alignés comme vous le supposeriez pour une structure cristalline. Par conséquent, ce processus nécessite un certain mouvement perpendiculaire à la direction de la charge. Plus un fragment d'ADN est gros, plus il est difficile de changer constamment de direction pour passer à travers les pores mal alignés (et potentiellement petits), de sorte que la vitesse de diffusion est plus lente. Par conséquent, les fragments d'ADN de faible poids moléculaire errent loin à travers le gel tandis que les fragments de poids moléculaire élevé restent plus proches du point de départ. Étant donné que la taille et le poids moléculaire correspondent bien à la longueur en bases, les marqueurs sont souvent étiquetés en termes de $mathrm$ — paires de kilobases.

Des concepts similaires s'appliquent à l'électrophorèse des protéines SDS. En dénaturant les protéines avec le détergent SDS (sodium dodécyl sulfate), elles sont linéarisées et dotées d'une forte charge négative des groupements sulfate. Tout comme c'est le cas pour l'ADN, le nombre de molécules de sulfate de dodécyl est approximativement proportionnel à la longueur de la protéine en acides aminés. Et comme ils sont linéarisés, c'est-à-dire que leurs structures tertiaires et quaternaires (et dans une certaine mesure aussi leurs structures secondaires) sont détruites, ils se comportent très bien comme un fragment d'ADN lorsqu'ils sont forcés à travers un gel : plus ils sont courts, mieux ils passent et plus ils voyagent vite.

Dans le cas des protéines, cependant, les marqueurs ne sont généralement pas étiquetés comme un certain nombre d'acides aminés mais comme correspondant à un certain poids moléculaire (souvent donné en $mathrm$). C'est parce que les acides aminés varient considérablement en taille, de la très petite glycine au très gros tryptophane ou arginine. La proximité de l'un de ces acides aminés plus gros peut permettre l'ajout d'un sulfate de dodécyl supplémentaire par rapport à la proximité de petits acides aminés.

Mais pourquoi les plus grosses protéines/fragments d'ADN qui portent une plus grande charge négative ne traversent-ils pas le gel plus rapidement ? Une force plus grande n'est-elle pas appliquée sur eux ?

Je suis content que tu me l'aies demandé. Oui, une plus grande force est appliqué. Mais, comme vous vous en souvenez peut-être dans les cours de physique, $F=mcdot a$, donc par conséquent $a = frac$. Par conséquent, la plus grosse molécule peut subir une plus forte Obliger, mais en raison de la molécule plus élevée Masse, l'ensemble accélération est équivalent (encore une fois : pas identique mais similaire). Cela permet au réseau de gel discriminant par taille de faire le tri par taille.


Qu'est-ce que la dénaturation de la page sds ?

Le dodécyl sulfate de sodium (SDS) est un détergent anionique qui dénature les protéines en "enveloppant" le squelette polypeptidique - et le SDS se lie assez spécifiquement aux protéines dans un rapport massique de 1,4:1. Ce faisant, le SDS confère une charge négative au polypeptide proportionnellement à sa longueur - c'est-à-dire : les polypeptides dénaturés deviennent des « bâtonnets » de nuage de charge négative avec des densités de charge ou de charge égales par unité de longueur. Il est généralement nécessaire de réduire les ponts disulfure dans les protéines avant qu'elles n'adoptent la configuration de serpentins aléatoires nécessaire à la séparation par taille : cela se fait avec du 2-mercaptoéthanol ou du dithiothréitol. Par conséquent, lors de la dénaturation des séparations SDS-PAGE, la migration n'est pas déterminée par la charge électrique intrinsèque du polypeptide, mais par le poids moléculaire.

Et pour l'expérience proprement dite au-delà de la dénaturation : PAGE signifie électrophorèse sur gel de polyacylamide. Il s'agit d'une procédure qui sépare les protéines par taille en les faisant passer à travers une « matrice » de gel afin que les plus petites se déplacent plus rapidement que les plus grosses. Ceci est réalisé en créant un champ électrique avec le complexe sds-protéine se déplaçant vers l'extrémité chargée positivement du gel. Une fois que les plus petites protéines ont parcouru la majeure partie du gel, le courant est coupé et le gel est retiré et coloré avec un colorant qui lie les protéines afin que vous puissiez voir où elles se trouvent dans le gel.


Principes de biochimie de Lehninger 7e

Réactions d'oxydoréduction Le complexe I, le complexe NADH déshydrogénase de la chaîne respiratoire mitochondriale, favorise la série suivante de réactions d'oxydoréduction, dans lesquelles $mathrm^<3+>$ et $mathrm^<2+>$ représente le fer dans les centres fer-soufre, $mathrm$ est l'ubiquinone, $mathrm_<2>$ est l'ubiquinol, et $mathrm$ est l'enzyme :
(1) $mathrm+H^<+>+mathrm-mathrm ightarrow mathrm^<+>$
mathrm-mathrm_<2>$
(2) E-FMNH Pourquoi la distance de migration dépend-elle du log du poids moléculaire en SDS-PAGE ? - Biologie,[nobr][H1àH2]

Matériaux et méthodes

Plasmides

Pour les études in vitro, murin Hoxa3 TIE (170 nts) et Hoxa11 TIE (216 nts) (les séquences ont été aimablement fournies par le Dr Maria Barna, qui ont été amplifiées à partir de l'ADNc de souris E10.5–12.5 Xue et al., 2015) ont été placées en amont de 5'UTR de Hbb-b1 (numéro d'accès : KU350152) (50 nts) et Renilla reniformis séquence codant pour la luciférase (numéro d'accès : M63501) (936 nts). Ces constructions ont été clonées dans le vecteur pUC19 dans le Hinsite dIII, puis utilisé comme matrice pour d'autres amplifications PCR et mutagenèse dirigée.

Pour les études in vivo, nous avons introduit un ÉcoSite de restriction RI en amont de la séquence de fusion hRLuc-neo dans le vecteur pmirGLO (Promega) en utilisant le kit de mutagenèse dirigée Quick Change II XL (Thermo Fischer Scientific). Des expériences de clonage ultérieures de Hoxa3 ATTACHER, Hoxa11 TIE et leurs mutants ont été réalisés dans le vecteur pmirGLO sur le site EcoRI à l'aide de NEBuilder La chaîne hi-fi Kit d'assemblage d'ADN. Tous les clones ont été vérifiés par séquençage.

Lignées cellulaires

Deux lignées cellulaires ont été utilisées pour nos tests in vivo : la lignée cellulaire rénale embryonnaire humaine HEK293FT (ATCC) achetée chez Invitrogen (réf R700-07) et la lignée cellulaire souche mésenchymateuse murine C3H10T1/2 (clone 8, ATCC CCL26). Les cellules HEK293FT ont été cultivées dans du milieu eagle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 2 mM de L-glutamine et 10 % de sérum bovin foetal (FBS) additionné de 100 unités/ml de pénicilline/streptomycine. Les sous-cultures ont été réalisées après un traitement trypsine-EDTA pour la dissociation dans des conditions subconfluentes (70-80%) 1:4 à 1:10 ensemencement à 2-4.10 4 cellules/cm 2 selon les instructions du fabricant. Les cellules C3H10T1/2 ont été cultivées dans du DMEM basal additionné de 2 mM de glutamine, 1,5 g/l de bicarbonate de sodium et 10 % de FBS additionné de 40 g/ml de gentamicine. Des repiquages ​​ont été effectués après un traitement trypsine-EDTA pour la dissociation dans des conditions subconfluentes (60-70 %). Les dilutions d'ensemencement ont été effectuées à 2000 cellules/cm2 une fois par semaine.

Transcription d'ARN

Des matrices de transcription ont été générées par amplification PCR à partir des plasmides pUC19-TIE. Les matrices amplifiées ont été utilisées pour la transcription in vitro avec l'ARN polymérase T7 recombinante en présence de m 7 GpppAnalogue de capuchon G ou analogue de capuchon non fonctionnel ApppG (New England Biolabs). Pour vérifier l'intégrité de l'ARN, une aliquote a été mélangée avec un colorant formamide et chargée sur un gel de polyacrylamide dénaturant à 4 %. L'ARN a été visualisé sous lumière UV après coloration au bromure d'éthidium. Pour éliminer les nucléotides non incorporés, l'échantillon d'ARN a été chargé sur une colonne de filtration sur gel Sephadex G25 (Pharmacia Fine Chemicals), les protéines ont ensuite été éliminées par extraction au phénol, et les transcrits d'ARN ont été précipités avec 0,25 M de NaCl dans l'éthanol. Après centrifugation, les culots d'ARN ont été séchés et remis en suspension dans de l'eau milli-Q autoclavée. La concentration des échantillons d'ARN purifiés a été déterminée par mesure d'absorbance à 260 nm.

Essais de traduction in vitro dans des extraits de traduction acellulaires

La traduction in vitro a été réalisée en utilisant des concentrations croissantes de transcrits d'ARNm avec un RRL non traité auto-fabriqué, un mélange d'acides aminés contenant tous les acides aminés à l'exception de la méthionine (1 mM de chaque), RNasin (Promega), 75 mM KCl, 0,5 mM MgCl2, 3,8 mCi [ 35 S] méthionine et eau milli-Q autoclavée. Le mélange réactionnel a été incubé à 30°C pendant 1 heure. Des aliquotes du mélange de traduction ont été analysées par SDS-PAGE (10 %) (Laemmli, 1970) et les produits de traduction ont été visualisés par imagerie au phosphore. Des tests de traduction in vitro avec de l'extrait de germe de blé (Promega) ont été effectués conformément aux instructions du fabricant. Essais de traduction in vitro avec extrait cellulaire HeLa et Drosophile Les extraits de cellules S2 ont été réalisés comme décrit précédemment (Thoma et al., 2004 Wakiyama et al., 2006).

Sondage chimique

Des expériences de sondage ont été réalisées comme décrit précédemment (Alghoul et al., 2021).

Sondage avec DMS

La modification par DMS a été réalisée sur 2 pmoles de chaque ARN (Hoxa3 CRAVATE et Hoxa11 ATTACHER). L'ARN est d'abord incubé 15 min dans du tampon DMS (50 mM Na cacodylate [pH 7,5], 5 mM MgCl2, et 100 mM KCl) et 1 g d'ARNt total de levure (Sigma-Aldrich) puis modifié avec du réactif DMS 1,25% (dilué avec de l'éthanol 100%) avec 10 min d'incubation à 20°C et arrêté sur glace. Les transcrits modifiés ont été précipités avec 0,25 M de NaCl, 0,1 mg/ml de glycogène dans de l'éthanol. Les culots d'ARN ont été séchés et remis en suspension dans de l'eau milli-Q autoclavée. Les nucléotides modifiés ont été détectés par des arrêts d'extension d'amorce qui ont été quantifiés. L'intensité des arrêts RT est proportionnelle à la réactivité pour chaque nucléotide.

Sonder avec CMCT

De même, une modification par CMCT a été réalisée sur 2 pmoles de chaque ARN (Hoxa3 CRAVATE et Hoxa11 ATTACHER). Chaque ARN est incubé 20 min dans du tampon CMCT (50 mM de borate de Na [pH 8,5] 5 mM de MgCl2 100 mM de KCl) et 1 µg d'ARNt total de levure. Ensuite, les modifications ont été effectuées avec 10,5 g/l de réactif CMCT avec 20 min d'incubation à 20°C et arrêtées sur de la glace. Les transcrits modifiés ont été précipités avec 0,25 M de NaCl, 0,1 mg/ml de glycogène dans de l'éthanol. Les culots d'ARN ont été séchés et remis en suspension dans de l'eau milli-Q autoclavée. Les nucléotides modifiés ont été détectés par des arrêts d'extension d'amorce qui ont été quantifiés. L'intensité des arrêts RT est proportionnelle à la réactivité pour chaque nucléotide.

Rallonge d'apprêt

La RT a été réalisée dans une réaction de 20 l avec 2 pmoles d'ARN et 0,9 pmoles d'amorces marquées par fluorescence 5'. Nous avons utilisé des amorces fluorescentes Vic et Ned (Thermo Fischer Scientific) de même séquence pour toutes les réactions RT qui sont complémentaires à la Hbb-b1 5'UTR à partir des nucléotides 6-37 :

Tout d'abord, l'ARN a été déplié par une étape de dénaturation à 95°C pendant 2 min. Ensuite, les amorces fluorescentes ont été hybridées pendant 2 min à 65°C suivies d'une incubation sur glace pendant 2 min. Les échantillons ont été incubés dans un tampon contenant 83 mM de KCl, 56 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 0,56 mM chacun des quatre désoxynucléotides (dNTP), 5,6 mM de DTT et 3 mM de MgCl.2. La RT a été réalisée avec 1 unité de transcriptase inverse du virus de la myoblastose aviaire (AMV) (Promega) à 42°C pendant 2 min, 50°C pendant 30 min et enfin 65°C pendant 5 min. En parallèle, des réactions de séquençage ont été réalisées dans des conditions similaires, mais complétées par 0,5 mM de didésoxythymidine ou de didésoxycitidine triphosphate (ddTTP ou ddCTP) (protocole adapté de Gross et al., 2017). L'ADNc synthétisé a été extrait au phénol-chloroforme et précipité. Après centrifugation, les culots d'ADNc ont été lavés, séchés et remis en suspension dans 10 ul de formamide Hi-Di désionisé (formamide hautement désionisé fraîchement préparé). Les échantillons ont été chargés sur une plaque à 96 puits pour le séquençage sur un analyseur génétique Applied Biosystems 3130xl. Les électrophérogrammes résultants ont été analysés à l'aide du logiciel QuSHAPE (Karabiber et al., 2013), qui aligne le signal à l'intérieur et à travers les capillaires, ainsi qu'aux références didésoxy du nucléotide à une position spécifique et corrige la décroissance du signal. Les réactivités normalisées vont de 0 à 2, 1,0 à 2,0 étant la plage des positions hautement réactives. Un modèle de structure secondaire préliminaire a d'abord été initié par mfold (Mathews et al., 2016) puis édité en fonction des valeurs de réactivité.

Analyse du gradient de saccharose

Pour analyser l'assemblage des complexes de pré-initiation ribosomique sur l'ARN d'intérêt, les complexes ont été chargés sur des gradients de saccharose de 7 à 47 % contenant 5 mM de MgCl2, Tris-HCl 25 mM (pH 7,5), DTT 1 mM et KCl 50 mM. Nous avons utilisé les inhibiteurs spécifiques de la traduction GMP-PNP (4 mM), cycloheximide (1 mg/ml), généticine (0,7 mM), hygromycine (0,5 mg/ml) et edeine (10 mM), ils ont été ajoutés au RRL avec un mélange contenant les 20 acides aminés à 1,5 mM chacun, RNasin (Promega), 35 mM KCl et 0,24 ou 2,4 mM MgCl2, avant l'incubation avec l'ARNm radioactif d'intérêt coiffé en 5'. Les complexes de pré-initiation assemblés ont été formés par incubation dans RRL à 30°C pendant 5 min. Ensuite, 8 mM de MgAc2 a été ajouté et un volume de 7% de saccharose. Les échantillons ont ensuite été déposés sur la surface de 11 ml de gradient de saccharose à 7-47% et centrifugés pendant 2 h 30 min dans un rotor SW41 à 37 000 tr/min à 4°C. Après centrifugation, l'ensemble du gradient a été fractionné et l'ARNm a été localisé en mesurant la radioactivité dans chaque fraction collectée par comptage Cerenkov dans un compteur à scintillation.

Spectrométrie de masse et traitement des données

Les extraits de protéines ont été digérés avec de la trypsine de qualité séquencée (Promega) comme décrit précédemment (Chicher et al., 2015 Prongidi-Fix et al., 2013). Les digestions peptidiques ont été analysées par nano LC-MS/MS et les données MS ont été recherchées par l'algorithme Mascot par rapport à la base de données UniProtKB de Oryctolagus cuniculus (lapin). Les identifications ont été validées avec un taux de fausses découvertes de protéines inférieur à 1 % à l'aide d'une stratégie de base de données leurres. Le nombre total de spectres de fragmentation MS/MS a été utilisé pour quantifier chaque protéine à partir de trois réplicats biologiques indépendants. Ce comptage spectral a été soumis à un test binomial négatif en utilisant une régression Edge R GLM à travers le R-package. Pour chaque protéine identifiée, une valeur p ajustée corrigée par Benjamini-Hochberg a été calculée, ainsi qu'un changement de facteur de protéine (FC est le rapport de la moyenne des comptages spectraux d'un complexe spécifique divisé par la moyenne des comptages spectraux d'une référence complexe protéique). Les résultats ont été présentés dans une parcelle de volcan en utilisant le journal des protéines2 FC et leur log ajusté correspondant10valeurs p. Les protéines qui ont été régulées à la hausse dans chaque condition sont indiquées en rouge (Hoxa3 CRAVATE contre Hbb-b1 ARNm, Hoxa11 CRAVATE contre Hbb-b1 ARNm, et Hoxa3 CRAVATE contre Hoxa11 ATTACHER).

Dosage de la luciférase in vivo

Pour le dosage de la luciférase in vivo, des cellules HEK293T et des cellules C3H10T1/2 ont été transfectées dans des plaques à six puits avec diverses constructions du vecteur pmirGlo (Promega). La transfection a été réalisée en utilisant le réactif de transfection Turbofect (Thermo Fischer Scientific) selon les instructions du fabricant. Les cellules ont été recueillies 24 heures après la transfection. Le dosage de la luciférase a été effectué à l'aide du kit de luciférase Dual-Glo (Promega) conformément aux instructions du fabricant. Les activités de luciférase de Firefly ont été mesurées pour surveiller l'efficacité de la transfection afin de normaliser les activités RLuc pour chaque construction.

Dosage de co-transfection des siRNA et du plasmide rapporteur dans les cellules HEK293T

Des cellules HEK293FT ont été utilisées pour tester l'effet sur l'inhibition du knock-down d'eIF2D et d'un pool d'ARNsi non cible, en tant que contrôle négatif, sur l'expression de RLuc (hRluc-neo) dans les vecteurs pmirGLO. Nous avons utilisé les siRNA humains ON-TARGETplus contre eIF2D (numéro de catalogue L-003680-01-00) et siRNA-NT (numéro de catalogue D-001810-10-05) achetés auprès d'Horizon Discovery. Les cellules HEK293T ont été cultivées selon les instructions du fabricant (ATCC) pendant 24 heures et utilisées pour la co-transfection par les siRNA et le plasmide rapporteur. Nous avons utilisé 2 × 10 5 cellules dans 1 ml de milieu de culture sans antibiotiques. Après avoir atteint 70 % de confluence, les cellules ont été transfectées par 5 pmoles d'ARNsi dans différents puits avec 500 ng de plasmide rapporteur. Les transfections ont été réalisées avec de la Lipofectamine 2000 (Invitrogen) selon les instructions du fabricant. Après 48 heures, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS 1x) et incubées avec du tampon de lyse passive 1x pendant 15 min. Le dosage de la luciférase a été effectué selon les instructions du fabricant. La concentration en protéines a été mesurée par le test de Bradford. L'impact du silence sur l'inhibition de la traduction médiée par TIE a été mesuré par dosage de la luciférase selon les instructions du fabricant comme mentionné précédemment.

Western blot contre eIF2D et GAPDH

L'efficacité de silençage a été quantifiée par western blot en utilisant un anticorps polyclonal de lapin anti-eIF2D (12840-1-AP) de Proteintech et un anticorps polyclonal de souris anti-GAPDH (sc-1377179) de Santa Cruz Biotechnology. Pour cela, 20 µg d'extraits protéiques ont été déposés sur SDS-PAGE 10% polyacrylamide. Après migration, les protéines ont été transférées sur une membrane Immobilin-P (Millipore) à 10 V pendant 1 h dans un appareil semi-sec (Trans-Blot SD) sur une membrane PVDF (polyfluorure de vinylidène) préalablement activée avec du méthanol à 100 %. pendant quelques secondes et un tampon de transfert pH 8 (25 mM Tris 200 mM glycine 20% éthanol). Après transfert, la membrane a été saturée pendant 2 h par du tampon de blocage (5% de lait, 0,05% de Tween-20, PBS 1X). Les anticorps primaires ont été ajoutés aux dilutions recommandées par les fabricants dans du tampon de blocage, les membranes ont été incubées une nuit à 4°C. Ensuite, les membranes ont été lavées trois fois par PBST (PBS 1 x 0,05% Tween-20) pour éliminer l'excès d'anticorps primaires. Ensuite, les membranes ont été incubées avec un anticorps secondaire conjugué à la HRP pendant 1 h à température ambiante suivi de trois étapes de lavage. Le signal produit par réaction entre HRP et ECL (Kit ECL Plus Western Blotting Detection System, GE Healthcare) a été détecté par chimiluminescence en utilisant l'imagerie Chemidoc (Biorad).

Essai d'impression d'orteil de ribosome

Le test d'impression des orteils a été adapté à partir de protocoles précédemment établis (Martin et al., 2016 Martin et al., 2011). Brièvement, les RRL ont été incubés 5 min à 30°C puis 10 min sur glace avec du tampon contenant 1 U/μl de RNasine recombinante (Promega), 75 mM KCl 0,5 mM MgCl2et 1,3 mM de puromycine avant l'assemblage du complexe d'initiation. Ensuite, les complexes de pré-initiation ont été formés par incubation avec 500 nM de l'ARN d'intérêt en présence d'inhibiteurs spécifiques tels que le cycloheximide (1 mg/ml) ou le GMP-PNP (4 mM) pendant 5 min à 30°C et puis 20 min sur glace. Ensuite, les complexes de pré-initiation ont été complétés par un volume de tampon A glacé contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM de KAc, 2,5 mM de MgAc2, 2 mM de DTT, 1 mM d'ATP et 0,25 mM de spermidine et placés sur de la glace. Afin de séparer les complexes ribosomiques de la fraction non ribosomique, les échantillons ont été centrifugés à 88 000 tr/min dans un rotor S100AT3 (Sorvall-Hitachi) à 4°C pendant 1 h. Après centrifugation, les culots contenant les complexes de pré-initiation ont été remis en suspension dans 30 l de tampon A glacé et incubés avec un oligonucléotide d'ADN marqué radioactivement en 5' complémentaire des nts 22-51 de la séquence codante RLuc pendant 3 min à 30°C. Ensuite, 1 ul d'un 320 mM Mg(Ac)2, 4 l d'un mélange de dNTP (contenant 5 mM de dATP, dGTP, dTTP et dCTP), 10 unités d'ARNsine recombinante (Promega) et 1 unité/μl de transcriptase inverse AMV (Promega) ont été ajoutés et incubés pendant 1 h à 30°C. Les ADNc synthétisés ont été analysés sur 8% PAGE à côté des échelles de séquençage.