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Pourquoi les endonucléases de restriction ne digèrent-elles pas les plasmides transformés ?

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Dans le manuel que j'utilise, il explique que la bactérie ne digère pas son propre ADN chromosomique car les sites qui seraient coupés par sa propre endonucléase sont méthylés. Existe-t-il un mécanisme similaire impliqué pour protéger ses propres plasmides ? Si oui, comment les plasmides sont-ils coupés tout en servant de vecteurs ?


Les souches de laboratoire utilisées à des fins de clonage ont été génétiquement modifiées pour résoudre ce problème, généralement en supprimant les gènes des divers systèmes de restriction-modification. Il existe quatre grandes classes de systèmes de modification de restriction, dont je parlerai individuellement. Sauf référence individuelle, la plupart des informations ci-dessous sont basées sur les notes techniques des fournisseurs suivantes :

Promega : Quels sont les effets des systèmes de restriction-modification de l'ADN bactérien sur le clonage ?

New England Biolabs : Restriction de l'ADN étranger par E. coli K-12


Type I

Dans Escherichia coli, ce système se compose des gènes hsdR, hsdM et hsdS et est capable à la fois de restreindre (digérer) l'ADN non méthylé et de méthyler l'ADN hémiméthylé. Le knock-out de hsdR et/ou hsdM empêche respectivement la restriction et la méthylation. Cela permet l'ingénierie de souches à des fins spécifiques. Par exemple, une commune E. coli souche utilisée pour le clonage, DH5α, a le génotype hsdR17 (rK-, mK+) qui abroge l'activité de restriction mais maintient l'activité de méthylation. Cela signifie que l'ADN exogène ne sera pas restreint, mais sera méthylé et donc capable d'être ultérieurement transformé en souches r+ sans souci de dégradation, si le besoin s'en fait sentir.


Type II

Il s'agit de la classe d'enzymes de restriction couramment utilisée en laboratoire pour couper l'ADN, car elles reconnaissent généralement de courtes séquences palindromiques et coupent à l'intérieur ou à proximité du site de reconnaissance. Les E. coli les souches de fond K et B, dont la plupart des souches de laboratoire sont dérivées, ne contiennent pas d'enzymes de type II. L'enzyme de type II EcoRI, par exemple, a été isolée du E. coli Souche RY13 (Yoshimori, 1971; thèse de doctorat).


Type III

De même que le type II, les souches K et B ne possèdent pas ce système de restriction-modification, qui a d'abord été caractérisé en E. coli 15T-.


Type IV

Ce système diffère des autres en ce qu'il clive l'ADN méthylé et hémiméthylé, bien qu'il ne reconnaisse pas la méthylation par les systèmes de modification de type I ou de type II, ni la méthylation Dam ou Dcm. Dans E. coli, ce système se compose des gènes mcrA, mcrBC et mrr et est le plus problématique lors de la tentative de transformation de l'ADN d'organismes présentant une méthylation ubiquitaire de la cytosine ou de l'adénine (par exemple, les plantes et les mammifères). Par exemple, la souche de laboratoire T7 Express, qui est dérivée de la souche commune BL21, a le génotype (mcrC-mrr)114::IS10 qui supprime mcrBC, hsdRMS et mrr.


Note sur les méthylases Dam et Dcm

Ces enzymes bactériennes méthylent les résidus adénine et cytosine, respectivement, mais ne sont pas directement impliquées dans les systèmes de restriction-modification discutés ci-dessus. Cependant, certaines enzymes de type II utilisées pour le clonage sont sensibles à cette méthylation et des souches de laboratoire sont donc disponibles avec ces enzymes supprimées.


Endonucléases de restriction

Avec > 45 ans d'offre d'enzymes de restriction à la communauté de la recherche, NEB a acquis la réputation d'être un leader dans les technologies enzymatiques. Travaillant continuellement pour être digne de cette distinction, NEB s'efforce de développer des enzymes de la plus haute pureté et des performances inégalées.

Les scientifiques du NEB continuent d'améliorer son portefeuille d'enzymes de restriction et d'explorer leur utilité dans les nouvelles technologies. Par conséquent, les scientifiques de l'ONÉ continuent de publier des articles scientifiques et de recevoir des subventions dans ce domaine. Avec le plus grand groupe de recherche et développement de l'industrie dédié aux enzymes de restriction, nous sommes fiers d'avoir été là les premiers : les premiers à commercialiser une enzyme recombinante, les premiers à introduire une enzyme de coupure. De plus, NEB a une histoire continue d'innovation en créant des enzymes de restriction avec des spécificités modifiées et des performances améliorées. Grâce à des recherches continues dans ces domaines, nous nous engageons à développer les innovations qui nous permettent d'offrir un maximum de confort et de performances.

L'ONE estime que l'abandon des produits contenant des animaux est un pas dans la bonne direction. Nous sommes ravis d'annoncer que nous sommes en train de changer tous les tampons de réaction pour qu'ils soient sans BSA ! En savoir plus sur www.neb.com/BSA-free.

Pour plus de détails sur les contrôles de qualité NEB&rsquos pour les endonucléases de restriction, visitez notre page Qualité des enzymes de restriction.


Toutes les enzymes de restriction de NEB sont passées à un nouveau système tampon. Visitez NEBCutSmart.com pour plus de détails.

Commodité

  • Les enzymes de restriction >215 sont 100% actives dans un seul tampon &ndash rCutSmart&trade Buffer.
  • >195 Les enzymes de restriction sont qualifiées pour gagner du temps, ce qui signifie que vous pouvez digérer l'ADN en 5 à 15 minutes, ou digérer l'ADN en toute sécurité pendant la nuit.
  • Choisissez parmi les enzymes de restriction >285, la plus grande sélection disponible dans le commerce.

Performance

  • Choisissez une enzyme de restriction haute fidélité (HF®), qui a été conçue pour une activité d'étoile réduite, une digestion rapide (5-15 minutes) et une activité à 100 % dans le tampon rCutSmart. Un flacon de 6X Purple Loading Dye est inclus avec la plupart des enzymes de restriction.
  • Toutes nos enzymes de restriction sont soumises à des tests de contrôle qualité rigoureux, garantissant les plus hauts niveaux de pureté et de cohérence d'un lot à l'autre.

Utilisez Enzyme Finder pour sélectionner l'enzyme de restriction par nom, séquence, surplomb ou type.


Guide de dépannage des enzymes de restriction

Le guide suivant peut être utilisé pour le dépannage des digestions par enzymes de restriction. Vous pouvez également être intéressé par des conseils supplémentaires pour optimiser les réactions de digestion.

Nous sommes ravis d'annoncer que nous sommes en train de changer tous les tampons de réaction pour qu'ils soient sans BSA. À partir d'avril 2021, NEB remplacera nos tampons de réaction actuels contenant de la BSA (NEBuffer & trade 1.1, 2.1, 3.1 et CutSmart & reg Buffer) par des tampons contenant de l'albumine recombinante (rAlbumin) (NEBuffer r1.1, r2.1, r3.1 et rCutSmart&trade tampon). Nous prévoyons que ce changement peut prendre jusqu'à 6 mois. Nous pensons que s'éloigner des produits contenant des animaux est un pas dans la bonne direction et sommes en mesure d'offrir cette amélioration au même prix. Plus de détails sur www.neb.com/BSA-free.

Pendant cette période de transition, vous pouvez recevoir un produit avec des tampons contenant du BSA ou de la rAlbumine. NEB a rigoureusement testé les deux et n'a constaté aucune différence dans les performances enzymatiques lors de l'utilisation de l'un ou l'autre des tampons. L'un ou l'autre tampon peut être utilisé avec votre enzyme. Tout le contenu du site Web sera modifié en avril pour refléter les changements, bien que vous ne puissiez pas recevoir immédiatement le nouveau tampon avec votre produit.

Vidéos

Problème de digestion des enzymes de restriction : frottis d'ADN sur gel d'agarose

Apprenez-en plus sur les causes de ce problème courant et sur la manière dont les enzymes de NEB sont contrôlées pour éviter les taches d'ADN.

Pourquoi mon enzyme de restriction ne coupe-t-elle pas l'ADN ?

Vous n'obtenez pas le décolleté auquel vous vous attendiez ? Laissez un scientifique de l'ONE vous aider à dépanner votre réaction.

Problème de digestion enzymatique de restriction : trop de bandes d'ADN

Trouvez-vous des bandes inattendues dans votre réaction de digestion ? Voici quelques conseils pour vous aider à déterminer la cause.

Protocole de digestion enzymatique de restriction : coupe près de l'extrémité de l'ADN

Lorsque vous coupez près de l'extrémité d'une molécule d'ADN, assurez-vous de savoir combien de bases ajouter aux extrémités de vos amorces PCR.

GAIN DE TEMPS et protocole commercial pour les condensés d'enzymes de restriction

Besoin d'un protocole pour digérer rapidement et complètement ? Essayez ce protocole pour les enzymes qualifiées Time-Saver&trade de NEB.

Réduisez l'activité des étoiles avec des enzymes de restriction haute fidélité

NEB a conçu les enzymes HF® pour éliminer l'activité des étoiles. Apprenez comment et ce que cela signifie pour vos résumés.

Protocole standard pour les digestions enzymatiques de restriction

Laissez l'un des experts en enzymes de restriction de NEB vous aider à améliorer votre technique et à éviter les erreurs courantes dans la configuration de la digestion.

  • Vérifiez la sensibilité à la méthylation de l'enzyme (s) pour déterminer si l'enzyme est bloquée par la méthylation de la séquence de reconnaissance
  • Utiliser le tampon recommandé fourni avec l'enzyme de restriction
  • Nettoyer l'ADN pour éliminer tout contaminant susceptible d'inhiber l'enzyme
  • Lors de la digestion d'un fragment PCR, assurez-vous d'avoir au moins 6 nucléotides entre le site de reconnaissance et l'extrémité de la molécule d'ADN
  • Réduire le nombre d'unités
  • Ajoutez du SDS (0,1&ndash0,5%) au tampon de chargement pour dissocier l'enzyme de l'ADN ou utilisez Gel Loading Dye, Purple (6X) (NEB #B7024)
  • Utilisez un tampon de fonctionnement frais et propre
  • Utilisez un gel d'agarose frais
  • Nettoyer l'ADN (NEB #T1030)
  • Vérifiez la sensibilité à la méthylation de l'enzyme (s) pour déterminer si l'enzyme est bloquée par la méthylation de la séquence de reconnaissance
  • L'ADN isolé d'une source bactérienne peut être bloqué par la méthylation de Dam et Dcm
  • Si l'enzyme est inhibée par la méthylation Dam ou Dcm, faites croître le plasmide dans un barrage-/dcm- souche (NEB #C2925)
  • L'ADN isolé d'une source eucaryote peut être bloqué par méthylation CpG
  • Les enzymes qui ont une faible activité dans les tampons contenant du sel (NEBuffer r3.1) peuvent être sensibles au sel, alors nettoyez l'ADN (NEB #T1030) avant la digestion
  • Les procédures de purification d'ADN qui utilisent des colonnes de centrifugation peuvent entraîner des niveaux élevés de sel, qui inhibent l'activité enzymatique. 1 Pour éviter cela, la solution d'ADN ne doit pas représenter plus de 25 % du volume réactionnel total.
  • Nettoyer le fragment PCR avant la digestion de restriction (NEB #T1030)
  • Utiliser le tampon recommandé fourni avec l'enzyme de restriction
  • Utilisez au moins 3&ndash5 unités d'enzyme par &mug d'ADN
  • Augmenter le temps d'incubation
  • Certaines enzymes ont une activité plus faible sur l'ADN supercolied. Augmenter le nombre d'unités enzymatiques dans la réaction.
  • Certaines enzymes peuvent présenter un clivage plus lent vers des sites spécifiques. Augmentez le temps d'incubation, 1&ndash2 heures est généralement suffisant.
  • Certaines enzymes nécessitent la présence de deux sites de reconnaissance pour couper efficacement
  • Doser l'ADN substrat en présence d'un ADN témoin. L'ADN de contrôle ne se scindera pas s'il y a un inhibiteur présent. L'ADN Mini prep est particulièrement sensible aux contaminants.
  • Nettoyer l'ADN avec une colonne de centrifugation (NEB #T1030) ou augmenter le volume pour diluer le contaminant
  • Diminuer le nombre d'unités dans la réaction
  • Ajouter du SDS (0,1 à 0,5 %) au tampon de chargement pour dissocier l'enzyme du substrat
  • Utiliser le tampon recommandé fourni avec l'enzyme de restriction
  • Diminuer le nombre d'unités enzymatiques dans la réaction
  • Assurez-vous que la quantité d'enzyme ajoutée ne dépasse pas 10 % du volume réactionnel total. Cela garantit que la concentration totale de glycérol ne dépasse pas 5% v/v
  • Diminuer le temps d'incubation. L'utilisation du temps de réaction minimum requis pour une digestion complète aidera à prévenir l'activité des étoiles.
  • Essayez d'utiliser une enzyme de restriction haute fidélité (HF). Les enzymes HF ont été conçues pour réduire l'activité des étoiles.
  • Les enzymes qui ont une faible activité dans les tampons contenant du sel (par exemple, NEBuffer r3.1) peuvent être sensibles au sel. Assurez-vous de nettoyer l'ADN (NEB #T1030) avant la digestion.
  • Les procédures de purification d'ADN qui utilisent des colonnes de centrifugation peuvent entraîner des niveaux élevés de sel, qui inhibent l'activité enzymatique. 1 Pour éviter cela, la solution d'ADN ne doit pas représenter plus de 25 % du volume réactionnel total.
  • Nettoyer le fragment PCR avant la digestion par restriction (NEB #T1030)
  • Utiliser le tampon recommandé fourni avec l'enzyme de restriction
  • Utilisez au moins 5&ndash10 unités d'enzyme par &mug d'ADN
  • Digérer l'ADN pendant 1&ndash2 heures


1 Les kits Monarch (NEB #T1010, NEB #T1020 et NEB #T1030) utilisent des colonnes conçues pour minimiser le transfert de sel dans l'ADN élué, leur utilisation peut donc minimiser ce problème.


Comment puis-je savoir si mon enzyme va couper ?

Qu'il s'agisse d'effectuer une digestion à des fins de clonage ou de diagnostic, nous vous suggérons de vérifier deux fois pour vous assurer que vos résultats ne seront pas affectés par la méthylation. De manière pratique, la majorité des enzymes de restriction couramment utilisées en laboratoire n'ont pas de sites de reconnaissance qui pourraient chevaucher un site de méthylation. Le tableau de référence rapide ci-dessous répertorie 10 enzymes courantes qui peuvent être affectées par la méthylation. Ce tableau n'est en aucun cas exhaustif, vous pouvez donc consulter la base de données REBASE pour des informations plus détaillées.

Enzyme Méthylation du barrage Méthylation Dcm Méthylation EcoKI
Apai Pas affecté Bloqué par méthylation chevauchante Pas affecté
Bsal Pas affecté Bloqué par méthylation chevauchante Pas affecté
ClaI Bloqué par méthylation chevauchante Pas affecté Pas affecté
DraI Pas affecté Pas affecté Bloqué par méthylation chevauchante
HpaI Pas affecté Pas affecté Bloqué par méthylation chevauchante
MboI Bloqué par méthylation chevauchante Pas affecté Pas affecté
MscI Pas affecté Bloqué par méthylation chevauchante Pas affecté
PmeI Pas affecté Pas affecté Bloqué par méthylation chevauchante
XbaI Bloqué par méthylation chevauchante Pas affecté Pas affecté
DpnI Nécessite une méthylation pour l'activité Pas affecté Pas affecté

Si votre enzyme est affectée par la méthylation, connaître la séquence de l'ADN entourant votre ou vos sites de restriction peut vous aider à prédire rapidement lequel (le cas échéant) de ces sites sera méthylé. En utilisant le même exemple de plasmide que ci-dessus (dont le site XbaI est bloqué par méthylation), la figure ci-dessous illustre comment le logiciel de visualisation de séquence (nous avons utilisé Snapgene ici) peut vous aider à évaluer si votre site de restriction sera bloqué par méthylation et comment cela peut changer vos résultats de condensé attendus. Si la méthylation de Dam n'est pas prise en compte, le modèle de digestion décrit dans la piste 1 serait attendu pour une digestion XbaI/NotI. Le programme, cependant, vous permet de choisir de rechercher les sites de méthylation Dam, Dcm et/ou EcoKI et vous avertit lorsqu'un site enzymatique choisi est bloqué. De plus, le programme en tient compte lors de la simulation d'un condensé comme illustré dans la piste 2.


Les enzymes de restriction sont des outils puissants de la génétique moléculaire utilisés pour :
&bull Cartographier les molécules d'ADN
&bull Analyser les polymorphismes de la population
&bull Réorganiser les molécules d'ADN
&bull Préparer des sondes moléculaires
&taureau Créer des mutants

Température: La plupart des digestions sont effectuées à 37°C. Cependant, il y a quelques exceptions, par exemple, la digestion avec Sma I est effectuée à des températures plus basses (

25°C), tandis qu'avec Taq I à une température plus élevée, c'est-à-dire 65°C.

Systèmes tampons: Le Tris-HCl est l'agent tampon le plus couramment utilisé dans les mélanges d'incubation, qui dépend de la température. La plupart des enzymes de restriction sont actives dans la plage de pH 7,0-8,0.

Conditions ioniques: Mg2+ est une exigence absolue pour toutes les endonucléases de restriction, mais l'exigence d'autres ions (Na+/K+) varie avec différentes enzymes.

Méthylation de l'ADN: La méthylation de résidus adénine ou cytidine spécifiques dans la séquence de reconnaissance de l'enzyme de restriction affecte la digestion de l'ADN.


Digestion enzymatique de restriction

Découvrez les enzymes de restriction de type II et les propriétés distinctives des quatre principaux sous-types.

Les méthodes de séquençage à haut débit ont révolutionné l'analyse génomique en produisant des millions de lectures de séquences à partir de l'ADN d'un organisme à un coût toujours plus bas.

Brochures

Outils de sélection

Guides de dépannage

Consignes d'utilisation

Ce produit est couvert par un ou plusieurs brevets, marques déposées et/ou droits d'auteur détenus ou contrôlés par New England Biolabs, Inc (NEB).

Bien que NEB développe et valide ses produits pour diverses applications, l'utilisation de ce produit peut exiger que l'acheteur obtienne des droits de propriété intellectuelle supplémentaires de tiers pour certaines applications.

Pour plus d'informations sur les droits commerciaux, veuillez contacter l'équipe de développement commercial mondial de NEB à l'adresse [email protected]

Ce produit est destiné à des fins de recherche uniquement. Ce produit n'est pas destiné à être utilisé à des fins thérapeutiques ou diagnostiques chez les humains ou les animaux.

Vidéos

Qu'est-ce qu'une enzyme de restriction de type II ?

Les enzymes de restriction de type II sont les plus couramment utilisées pour les applications de biologie moléculaire, car elles reconnaissent les séquences stéréotypées et produisent un modèle de clivage prévisible. En savoir plus sur le fonctionnement des ER de type II.

Qu'est-ce qu'une enzyme de restriction de type I ?

Les enzymes de restriction de type I sont un groupe d'endonucléases qui reconnaissent une séquence bipartite, mais ne produisent pas de schéma de clivage prévisible. En savoir plus sur le fonctionnement des ER de type I.

Qu'est-ce qu'une enzyme de restriction de type III ?

Les enzymes de restriction de type III sont un groupe d'endonucléases qui reconnaissent une séquence non pallindromique, comprenant deux sites orientés inversement. Apprenez-en plus sur ces enzymes mal comprises.

Clonage avec des enzymes de restriction

Les enzymes de restriction font partie intégrante du processus de clonage, pour générer des extrémités compatibles sur des fragments et des vecteurs. Cette animation présente trois directives pour déterminer les enzymes de restriction à utiliser dans votre expérience de clonage.

Protocole standard pour les digestions enzymatiques de restriction

Laissez l'un des experts en enzymes de restriction de NEB vous aider à améliorer votre technique et à éviter les erreurs courantes dans la configuration de la digestion.

Pourquoi mon enzyme de restriction ne coupe-t-elle pas l'ADN ?

Vous n'obtenez pas le décolleté que vous attendiez ? Laissez un scientifique de l'ONE vous aider à dépanner votre réaction.

Problème de digestion enzymatique de restriction : trop de bandes d'ADN

Trouvez-vous des bandes inattendues dans votre réaction de digestion ? Voici quelques conseils pour vous aider à déterminer la cause.

Qu'est-ce que l'activité étoilée des enzymes de restriction ?

Découvrez ce qu'est l'activité des étoiles, pourquoi elle est préjudiciable à une digestion précise des enzymes de restriction et comment les enzymes HF de NEB sont conçues pour l'éviter.

Réduisez l'activité des étoiles avec des enzymes de restriction haute fidélité

NEB a conçu les enzymes HF® pour éliminer l'activité des étoiles. Apprenez comment et ce que cela signifie pour vos résumés.

NEB ® Restriction Enzyme Double Digest Protocol

Les doubles digestions peuvent vous faire gagner du temps, et cette vidéo peut vous donner des conseils pour obtenir les meilleurs résultats, quelle que soit l'enzyme de restriction NEB que vous utilisez.

Protocole de digestion enzymatique de restriction : coupe près de l'extrémité de l'ADN

Lorsque vous coupez près de l'extrémité d'une molécule d'ADN, assurez-vous de savoir combien de bases ajouter aux extrémités de vos amorces PCR.

Problème de digestion des enzymes de restriction : frottis d'ADN sur gel d'agarose

Apprenez-en plus sur les causes de ce problème courant et sur la manière dont les enzymes de NEB sont contrôlées pour éviter les taches d'ADN.

Enzymes de restriction dans l'amplification isotherme

L'amplification isotherme génère de nombreuses copies d'une séquence cible dans un court laps de temps, à température constante. En savoir plus sur l'amplification isotherme.

Enzymes de restriction dans la cartographie optique

La cartographie optique est une méthode qui permet de produire des cartes de restriction de chromosomes ou de génomes entiers. En savoir plus sur la cartographie optique.


Endonucléases de restriction : clonage moléculaire et au-delà

L'activité de clivage de l'ADN spécifique à la séquence des endonucléases de restriction (REases), combinée à d'autres activités enzymatiques qui amplifient et ligaturent les acides nucléiques, ont permis la biologie moléculaire moderne. Après plus d'un demi-siècle de recherche et développement, les applications des REases ont évolué du clonage d'ADN exogène et de la cartographie du génome à des applications plus sophistiquées, telles que l'identification et la cartographie des modifications épigénétiques et l'assemblage à haut débit de bibliothèques combinatoires. De plus, la découverte et l'ingénierie des endonucléases de coupure (NEases) ont ouvert la porte à des techniques telles que l'amplification isotherme de l'ADN, entre autres. Dans cette revue, nous examinerons les avancées majeures de la recherche REase, les applications des REases et des NEases dans divers domaines de la recherche biologique et les nouvelles technologies pour l'assemblage de grandes molécules d'ADN.

Siu-Hong Chan, Ph.D., New England Biolabs, Inc.

INTRODUCTION

Dans les années 1950, un phénomène connu sous le nom de "variation contrôlée/induite par l'hôte des virus bactériens" a été signalé, dans lequel des bactériophages isolés d'un E. coli souche a montré une diminution de leur capacité à se reproduire dans une souche différente, mais a retrouvé la capacité dans les cycles d'infection suivants (1,2). En 1965, l'article fondateur de Werner Arber a établi le cadre théorique du système de restriction-modification, fonctionnant comme une défense bactérienne contre les bactériophages envahissants (3). Les premières REases ont découvert des séquences d'ADN spécifiques reconnues, mais coupées à des distances variables de leur séquence de reconnaissance (Type I) et étaient donc peu utiles dans la manipulation de l'ADN. Peu de temps après, la découverte et la purification de REases qui ont reconnu et coupé à des sites spécifiques (REases de type II) ont permis aux scientifiques d'effectuer des manipulations précises de l'ADN in vitro, comme le clonage de gènes exogènes et la création de vecteurs de clonage efficaces. Aujourd'hui, plus de 4 000 REases sont connues, reconnaissant plus de 300 séquences distinctes (pour une liste complète, visitez REBASE® sur rebase.neb.com). Avec l'avènement des méthodologies de réaction en chaîne par polymérase (PCR), de RT-PCR et de mutagenèse basée sur la PCR, le flux de travail de clonage traditionnel a transformé la recherche biologique dans les décennies qui ont suivi.


DÉVELOPPEMENT D'ENZYMES DE RESTRICTION ET DE TECHNIQUES D'ÉDITION DE GÈNES

INGÉNIERIE DES ENZYMES DE RESTRICTION

Traditionnellement, les REases étaient purifiées à partir de l'organisme natif. Le développement de vecteurs de clonage de gènes et de méthodologies de sélection a permis le clonage de REases. Le clonage a non seulement permis la production de grandes quantités d'enzymes hautement purifiées, mais a également rendu possible l'ingénierie des REases. Actuellement, > 250 des enzymes de restriction fournies par New England Biolabs (NEB) sont des protéines recombinantes.

Ingénierie Amélioration des performances

L'activité de clivage sur des sites non apparentés (c'est-à-dire l'activité en étoile) avait été observée et bien documentée pour certaines REases. Parmi ceux-ci, certains présentent une activité en étoile dans des conditions de réaction sous-optimales, tandis que d'autres ont une gamme très étroite d'unités enzymatiques qui digèrent complètement une quantité donnée de substrat sans présenter d'activité en étoile (4). Grâce à des recherches intensives, les scientifiques de l'ONE ont commencé à concevoir des enzymes de restriction qui présentent une activité d'étoile minimale, voire inexistante, avec des temps de réaction prolongés et à des concentrations d'enzymes élevées. Cette recherche a permis l'introduction de REases haute fidélité (HF&trade) qui ont amélioré les performances dans une plus large gamme de conditions de réaction (pour plus d'informations, visitez www.neb.com/HF).

Ingénierie des spécificités des nouvelles séquences

Les tentatives pour modifier les spécificités de séquence des REases de type IIP ont été largement infructueuses, probablement parce que le déterminant de spécificité de séquence est structurellement intégré aux sites actifs des REases de type IIP. MmeI, une REase de Type IIG avec à la fois des activités de méthyltransférase (MTase) et de REase dans le même polypeptide, reconnaît la séquence cible TCCRAC en utilisant le domaine de reconnaissance cible (TRD) dans son composant MTase. Cela représentait une excellente opportunité d'intégrer une spécificité de séquence modifiée dans le REase. Comme avantage supplémentaire, le partage du TRD entre les activités REase et MTase a entraîné un changement équivalent de l'activité MTase pour tout changement de spécificité de clivage de la séquence cible, protégeant le nouveau site cible du clivage dans les cellules hôtes recombinantes. Grâce à l'analyse bioinformatique de séquences protéiques homologues, les scientifiques du NEB ont identifié les résidus d'acides aminés qui reconnaissaient des bases spécifiques dans les séquences cibles et ont créé des mutants MmeI avec des spécificités de séquence modifiées (5). La conception rationnelle des mutants et homologues de MmeI a déverrouillé le potentiel de création de REases avec des centaines de nouvelles spécificités de séquence.

Figure 1. Ingénierie des enzymes de nicking
Les REases de type IIS, telles que FokI (brun clair et foncé) et BstNBI (isoschizomère de BspD6I, violet clair et foncé), et l'endonucléase à tête chercheuse I-AniI (cyan), ont été conçues pour posséder des activités enzymatiques de coupure.

Ingénierie des endonucléases de nicking

La recherche fondamentale impliquant des REases a conduit à des découvertes surprenantes sur le mécanisme apparemment simple du clivage. Les REases prototypes de type IIP agissent normalement comme des homodimères, chacun des monomères coupant la moitié du site palindromique. Les REases de type IIS, d'autre part, présentent une large gamme de mécanismes de clivage double brin, à savoir l'hétérodimérisation, comme par BtsI et BbvCI, et le clivage séquentiel de l'ADNdb en tant que monomère, comme par FokI. Ces propriétés ont été exploitées pour créer des enzymes de coupure spécifiques au brin (NEases) (pour plus d'informations sur les enzymes de coupure, voir la revue dans (6)).

APPLICATIONS UTILISANT DES ENZYMES DE RESTRICTION

Clonage traditionnel

En combinaison avec les ADN ligases, les REases ont facilité un flux de travail &ldquocut and paste&rdquo robuste où un fragment d'ADN défini pouvait être déplacé d'un organisme à un autre (Fig. 2). En utilisant cette méthodologie, Stanley Cohen et ses collègues ont incorporé de l'ADN exogène dans des plasmides naturels pour créer le véhicule pour le clonage de vecteurs plasmidiques qui s'auto-propagent dans E. coli (7). Ceux-ci sont devenus l'épine dorsale de nombreux vecteurs actuels et ont permis le clonage d'ADN pour l'étude et la production de protéines recombinantes. Les enzymes de restriction sont également utiles comme outils de confirmation post-clonage, pour s'assurer que les insertions ont eu lieu correctement. Le flux de travail de clonage traditionnel, ainsi que les technologies d'amplification de l'ADN, telles que la PCR et la RT-PCR, sont devenus une application courante pour les REases et ont facilité l'étude de nombreux mécanismes moléculaires.

Figure 2. Flux de travail de clonage traditionnel
En utilisant la PCR, des sites de restriction sont ajoutés aux deux extrémités d'un ADNdb, qui est ensuite digéré par les REases correspondantes. L'ADN clivé peut ensuite être ligaturé à un vecteur plasmidique clivé par des REases identiques ou compatibles avec l'ADN ligase T4. Des fragments d'ADN peuvent également être déplacés d'un vecteur à un autre en les digérant avec des REases et en les ligaturant aux extrémités compatibles du vecteur cible.

Cartographie de l'ADN

Armé de seulement une poignée de REases au début des années 1970, Daniel Nathans a cartographié les unités fonctionnelles de l'ADN SV40 (8) et a commencé l'ère de la &ldquorestriction mapping&rdquo et de la comparaison de génomes complexes. Il a depuis évolué vers des méthodologies sophistiquées qui permettent la détection de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) et d'insertions/suppressions (Indels) (9), conduisant des applications qui incluent l'identification des loci de troubles génétiques, l'évaluation de la diversité génétique des populations et les tests parentaux.

Comprendre les modifications épigénétiques

La sensibilité à l'état de méthylation des bases cibles a été exploitée pour cartographier les bases modifiées au sein des génomes. Restriction Landmark Genome Scanning (RLGS) est une technique de cartographie basée sur l'électrophorèse sur gel bidimensionnelle qui utilise NotI (GC^GGCCGC), AscI (GG^CGCGCC), EagI (C^GGCCG) ou BssHII (G^CGCGC) pour interroger les changements dans les schémas de méthylation du génome au cours du développement des cellules normales et cancéreuses. Le polymorphisme d'amplification sensible à la méthylation (MSAP) tire parti de la sensibilité différentielle de MspI et HpaII envers l'état de méthylation du deuxième C du quadruplet CCGG pour identifier la 5-méthylcytosine (5-mC) ou la 5-hydroxyméthylcytosine (5-hmC) (10 ,11). Les scientifiques de NEB ont encore exploité la propriété de MspI et HpaII sur la 5-glucosyl hydroxyméthylcytosine (5-ghmC) dans le kit d'analyse EpiMark® 5-hmC et 5-mC (NEB #E3317S)(12), qui différencie 5-hmC de 5- mC pour une identification et une quantification des marqueurs épigénétiques plus raffinées (pour plus d'informations, visitez EpiMark.com). De plus, les REases récemment découvertes qui reconnaissent et clivent l'ADN aux sites 5-mC et 5-hmC (par exemple, MspJI, FspEI et LpnPI), ainsi que celles qui clivent préférentiellement 5-hmC ou 5-ghmC sur 5-mC ou C (par exemple, PvuRts1I, AbaSI) (13), sont des outils potentiels pour la cartographie à haut débit des marqueurs épigénétiques à base de cytosine dans les génomes méthylés par la cytosine (14,15).

In vitro Technologies d'assemblage d'ADN

La biologie synthétique est un domaine en croissance rapide, dans lequel des composants définis sont utilisés pour créer des systèmes biologiques pour l'étude des processus biologiques et la création de dispositifs biologiques utiles (16). De nouvelles technologies telles que BioBrick&trade ont émergé à l'origine pour faciliter la construction de tels systèmes biologiques. Récemment, des approches plus robustes, telles que Golden Gate Assembly et Gibson Assembly&trade, ont été largement adoptées par la communauté de la biologie synthétique. Les deux approches permettent l'assemblage parallèle et homogène de plusieurs fragments d'ADN sans recourir à des bases non standard.

BioBrick : La communauté BioBricks a cherché à créer des milliers de &ldquoparties standardisées&rdquo d'ADN pour un assemblage rapide de gènes. Avec le concours annuel International Genetically Engineered Machines (iGEM) (igem.org), la communauté BioBricks s'est développée et a suscité un large intérêt de la part de nombreux étudiants universitaires pour la biologie synthétique. Basé sur la méthodologie traditionnelle de REase-ligation, BioBrick et ses méthodologies dérivées (BioBrick Assembly Kit, NEB #E0546, et son dérivé, BglBricks (17)) sont faciles à utiliser, mais ils introduisent des séquences de cicatrices aux jonctions. Ils nécessitent également plusieurs cycles de clonage pour créer un système biologique fonctionnel.

Assemblée du Golden Gate : Golden Gate Assembly et ses méthodes dérivées (19,20) exploitent la capacité des REases de type IIS à cliver l'ADN en dehors de la séquence de reconnaissance. Les inserts et les vecteurs de clonage sont conçus pour placer le site de reconnaissance de type IIS distal par rapport au site de clivage, de sorte que la REase de type IIS puisse retirer la séquence de reconnaissance de l'assemblage (figure 3). Les avantages d'un tel agencement sont triples : 1. la séquence en surplomb créée n'est pas dictée par la REase, et donc aucune séquence de cicatrice n'est introduite 2. la séquence spécifique aux fragments des surplombs permet un assemblage ordonné de plusieurs fragments simultanément et 3 le site de restriction est éliminé du produit ligaturé, ainsi la digestion et la ligature peuvent être réalisées simultanément. Le résultat net est l'assemblage ordonné et homogène de fragments d'ADN en une seule réaction. La précision de l'assemblage dépend de la longueur des séquences en porte-à-faux. Par conséquent, les REases de type IIS qui créent des surplombs à 4 bases (comme BsaI/BsaI-HF, BbsI, BsmBI et Esp3I) sont préférées. L'inconvénient de ces méthodes basées sur le type IIS REase est que le petit nombre de bases en surplomb peut conduire à une mauvaise ligature de fragments avec des séquences en surplomb similaires (21). Il est également nécessaire de vérifier que les sites REase de Type IIS utilisés ne sont pas présents dans les fragments pour l'assemblage du produit attendu. Néanmoins, Golden Gate Assembly est une technologie robuste qui génère plusieurs mutations dirigées vers un site (22) et assemble plusieurs fragments d'ADN (23,24). Alors que les méthodes et les réactifs open source sont devenus de plus en plus disponibles (voir www.addgene.org), Golden Gate Assembly a été largement utilisé dans la construction de TALEN personnalisés pour l'édition de gènes in vivo (25), entre autres applications.

Figure 3. Flux de travail d'assemblage Golden Gate
Dans sa forme la plus simple, le Golden Gate Assembly nécessite un site de reconnaissance BsaI (GGTCTC) ajouté aux deux extrémités d'un fragment d'ADNdb distal par rapport au site de clivage, de sorte que le site BsaI soit éliminé par digestion avec BsaI ou BsaI-HF (GGTCTC 1/5 ). Lors du clivage, les séquences en surplomb des fragments adjacents s'hybrident les unes aux autres. L'ADN ligase scelle ensuite les entailles pour créer une nouvelle molécule d'ADN liée de manière covalente. Plusieurs morceaux d'ADN peuvent être clivés et ligaturés simultanément. Assemblage Gibson : Daniel G. Gibson, du J. Craig Venter Institute, a décrit une méthode robuste basée sur l'exonucléase pour assembler l'ADN de manière transparente et dans le bon ordre. La réaction est réalisée dans des conditions isothermes en utilisant trois activités enzymatiques : une exonucléase 5&rsquo génère de longs surplombs, une polymérase comble les lacunes des régions ss recuites et une ADN ligase scelle les entailles des lacunes recuites et comblées (26) (Fig. 4). En appliquant cette méthodologie, le génome mitochondrial de souris de 16,3 kb a été assemblé à partir de 600 60-mers chevauchants (26). En combinaison avec in vivo assemblage dans la levure, Gibson Assembly a été utilisé pour synthétiser le 1,1 Mbp Mycoplasme mycoïde génome. Le génome synthétisé a été transplanté dans un M. capricolum recipient cell creating new self-replicating M. mycoides cells (27).

Gibson Assembly can also be used for cloning the assembly of a DNA insert with a restriction-digested vector, followed by transformation, can be completed in a little less than two hours with the Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510S, for more information, visit NEBGibson.com). Other applications of Gibson Assembly include the introduction of multiple mutations, assembly of plasmid vectors from chemically synthesized oligonucleotides, and creating combinatorial libraries of genes and pathways.

Figure 4. Gibson Assembly Workflow
Gibson Assembly employs three enzymatic activities in a single-tube reaction: 5´ exonuclease, the 3´ extension activity of a DNA polymerase and DNA ligase activity. The 5´ exonuclease activity chews back the 5´ end sequences and exposes the complementary sequence for annealing. The polymerase activity then fills in the gaps on the annealed regions. A DNA ligase then seals the nick and covalently links the DNA fragments together. The overlapping sequence of adjoining fragments is much longer than those used in Golden Gate Assembly, and therefore results in a higher percentage of correct assemblies. The NEB Gibson Assembly Master Mix (NEB #E2611) and Gibson Assembly Cloning Kit (NEB #E5510S) enable rapid assembly at 50˚C.

Construction of DNA Libraries

SAGE (Serial Analysis of Gene Expression) has allowed the identification and quantification of a large number of mRNA transcripts. It has been widely used in cancer research to identify mutations and study gene expression. REases are key to the SAGE workflow. NlaIII is instrumental as an anchoring enzyme, because of its unique property of recognizing a 4-bp sequence CATG and creating a 4 nucleotide overhang of the same sequence. The use of Type IIS enzymes as tagging enzymes that cleave further and further away from the recognition sequence allows for the higher information content of SAGE analyses (e.g., FokI and BsmFI in SAGE (28), MmeI in LongSAGE (29) and EcoP15I in SuperSAGE (30) and DeepSAGE (31)).

Chromosome conformation capture (3C) and derivative methods allow the mapping of the spatial organizations of genomes in unprecedentedly high resolution and throughput (32). REases plays an indispensible role in creating the compatible ends of the DNA cross-linked to its interacting proteins, such that spatially associated sequences can be ligated and, hence, identified through high-throughput sequencing.

Although REases do not allow for the random fragmentation of DNA that most next-generation DNA sequencing technologies require, they are being used in novel target enrichment methodologies (hairpin adaptor ligation (33) and HaloPlex&trade enrichment (Agilent)). The long-reach REase, AcuI, and USER&trade Enzyme are also used to insert tags into sample DNA, which is then amplified by rolling circle amplification (RCA) to form long, single-stranded DNA &ldquonanoballs&rdquo that serve as template in the high density, chip-based sequencing-by-ligation methodology, developed by Complete Genomics (34). ApeKI was also used to generate the DNA library for a genotyping-by-sequencing technology for the study of sequence diversity of maize (35).

Creation of Nicks in DNA

Before NEases were available, non-hydrolyzable phosphorothioate groups were incorporated into a specific strand of the target DNA such that REases can introduce sequence- and strand-specific nicks into the DNA for applications such as strand displacement amplification (SDA), where a strand-displacing DNA polymerase (e.g., Bst 2.0 DNA Polymerase, NEB #M0537) extends from the newly created 3&rsquo-hydroxyl end, and essentially replicates the complementary sequence (36). Because the nicking site is regenerated, repeated nicking-extension cycles result in amplification of specific single-stranded segments of the sample DNA without the need for thermocycling. NEases greatly streamline the workflow of such applications and open the door to applications that cannot be achieved by REases. Nicking enzyme-based isothermal DNA amplification technologies, such as RCA, NESA, EXPAR and related amplification schemes, have been shown to be capable of detecting very low levels of DNA (37,38). Nicking-based DNA amplification had also been incorporated into molecular beacon technologies to amplify signal (39). The implementation of these sample and/or signal amplification schemes can lead to simple, but sensitive and specific, methods for the detection of target DNA molecules in the field (NEAR, EnviroLogix&trade). By ligating adaptors containing nicking sites to the ends of blunt-ended DNA, the simultaneous actions of the NEase(s) and strand-displacing DNA polymerase can quickly amplify a specific fragment of dsDNA (40). Amplification by nicking-extension cycling is amenable to multiplexing and can potentially achieve a higher fidelity than PCR. The combined activity of NEases and Bst DNA polymerase have also been used to introduce site-specific fluorescent labels into long/chromosomal DNA in vitro for visualization (nanocoding) (41). Innovative applications of nicking enzymes include the generation of reporter plasmids with modified bases or structures (42) and the creation of a DNA motor that transports a DNA cargo without added energy (43). A review of NEases and their applications has been published elsewhere (6).

In vivo Gene Editing

The ability to &ldquocut and paste&rdquo DNA using REases in vitro has naturally led to the quest for performing the art in vivo to correct mutations that cause genetic diseases. Direct use of REases and homing endonucleases in Restriction Enzyme Mediated Integration (REMI) facilitated the generation of transgenic embryos of higher organisms (44,45). There is, however, no control over the integration site. The concept of editing genes through site-specific cleavage has been realized using Zinc Finger Nucleases (ZFNs) and Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALENs), due to their ability to create customizable double stranded breaks in complex genomes. With the great success of gene editing in model organisms and livestock (46-50), the therapeutic potential of these gene editing reagents is being put to the first test in the Phase I/II clinical trials of a regime that uses a ZFN to improve CD4+ T-cell counts by knocking out the expression of the CCR5 gene in autologous T-cells from HIV patients (ClinicalTrials.gov indentifier NCT00842634) (51). Recent research on CRISPR, the adaptive defense system of bacteria and archaea, has shown the potential of the Cas9-crRNA complex as programmable RNA-guided DNA endonucleases and strand-specific nicking endonucleases for in vivo gene editing (52,53).

MOVING FORWARD

Restriction enzymes have been one of the major forces that enabled the cloning of genes and transformed molecular biology. Novel technologies, such as Golden Gate Assembly and Gibson Assembly, continue to emerge and expand our ability to create new DNA molecules. The potential to generate new recognition specificity in the MmeI family REases, the engineering of more NEases and the discovery of ever more modification-specific REases continues to create new tools for DNA manipulation and epigenome analysis. Innovative applications of these enzymes will take REases&rsquo role beyond molecular cloning by continuing to accelerate the development of biotechnology and presenting us with new opportunities and challenges.


How do restriction endonucleases cut DNA?

Read rest of the answer. Accordingly, where do restriction endonucleases cut DNA?

Restriction Enzyme Types Generally, Type I enzymes cut DNA at locations distant to the recognition sequence Type II cut DNA within or close to the recognition sequence Type III cut DNA near recognition sequences and Type IV cleave methylated ADN.

what is DNA restriction? DNA restriction enzymes break ADN strands at specific sites based on the nucleic acid sequence. Thus, digestion with a given restriction enzyme or combination of restriction enzymes will produce fragments of different lengths that are directly related to the ADN sequence.

Similarly, it is asked, why do restriction enzymes not cut their own DNA?

Bacteria have restriction enzymes, aussi appelé endonucléases de restriction, lequel couper double stranded ADN at specific points into fragments. De façon intéressante, restriction enzymes don't cleave their own DNA. Bacteria prevent their own DNA from chop down by Enzyme de restriction through methylation of the restriction des sites.

Which bonds do restriction enzymes cut?

Restriction enzymes cut ADN obligations between 3&prime OH of one nucleotide and 5&prime phosphate of the next one at the specific restriction placer. Adding methyl groups to certain bases at the recognition sites on the bacterial DNA blocks the Enzyme de restriction to bind and protects the bacterial DNA from being couper by themselves.


Traditional Cloning

Traditional Cloning usually refers to the use of restriction endonucleases to generate DNA fragments with specific complementary end sequences that can be joined together with a DNA ligase, prior to transformation. This typically involves preparing both a DNA fragment to be cloned (insert) and a self-replicating DNA plasmid (vector) by cutting with two unique restriction enzymes that flank the DNA sequence and are present at the preferred site of insertion of the vector, often called the multiple cloning site (MCS). By using two different REs, two non-compatible ends are generated, thus forcing the insert to be cloned directionally, and lowering the transformation background of re-ligated vector alone. Directional cloning is often useful to maintain an open reading frame or another positional requirement with cis-acting regulatory elements. Non-directional cloning can also be performed with compatible ends generated by a single restriction enzyme in this case, the clones will need to be screened to determine that the gene orientation is correct. Typically, the vector needs to be dephosphorylated to prevent self-ligation, which directly competes with the insert and lowers the efficiency of the cloning reaction.

In the early years of cloning, genomic DNA was often cloned into plasmid vectors using DNA adapters to add the required restriction sites to a gene of interest, prior to ligation. Additionally, genes, or other DNA elements, were swapped between vectors using compatible ends contained by both vectors. More recently, the Polymerase Chain Reaction (PCR) has been used as an upstream step in a cloning protocol to introduce the necessary restriction sites for directional cloning, prior to preparation of the vector and insert by restriction digests, followed by fragment purification, fragment ligation, and transformation into an E. coli cloning strain for plasmid amplification. Transformed colonies, now resistant to an antibiotic due to a resistance gene harbored by the plasmid, are screened by colony PCR or restriction digest of plasmid DNA for the correct insert. Direct sequencing of the recombinant plasmid is often performed to verify the sequence integrity of the cloned fragment.

  • Low cost
  • Polyvalent
  • Main different vector choices
  • Directional cloning can be easily done
  • Possible sequence constraints due to presence and/or translation of restriction site

Traditional Cloning Workflow

Note that times are based on estimates for moving a gene from one plasmid to another. If the source for gene transfer is gDNA, add 2 hours to calculation for the traditional cloning method. Total time does not include transformation, isolation or analysis.


Voir la vidéo: Anatomie bactérienne (Septembre 2022).