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Est-il possible de fabriquer une cellule cancéreuse qui ne code aucun néo-antigène ?

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La cellule a toujours des mutations, mais ces mutations ne se produisent que dans les séquences non codantes, telles que les promoteurs, ce qui entraîne une surexpression des proto-oncogènes et une régulation négative des gènes suppresseurs de tumeurs. Ainsi, la cellule va proliférer de manière incontrôlable, mais n'exprimera aucun néoantigène. Une telle cellule sera-t-elle invisible pour notre système immunitaire ?


L'immunosurveillance des cellules cancéreuses repose sur de multiples « signaux » dérivés des cellules cancéreuses et de leur microenvironnement.

Je devrais souligner la charge mutationnelle de la tumeur (Figure 1). Une sorte de point à retenir ici est que certaines indications ont moins de mutations et donc moins de néo-antigènes que d'autres. Cependant, vous devez également prendre en considération le stade de la tumeur. Les tumeurs de stade IV ont accumulé plus de mutations que les tumeurs de stade I/II.

Figure 1. Prévalence mutationnelle par indication. Une prévalence plus élevée prédit une fréquence de néoantigènes ou une charge mutationnelle plus élevée pour cette histologie du cancer. (1, 2)

Il est intéressant de souligner la partie inférieure de la figure 1 où les auteurs d'une note de synthèse distincte pour nous, où l'on pense qu'il existe une déconnexion entre l'immunothérapie traditionnelle par blocage des points de contrôle et l'immunothérapie CAR-T. Juste pour renseigner un peu sur le sujet, le blocus des points de contrôle cible les cellules T, les moteurs de la destruction des cellules dépendantes de l'antigène. Les cellules T infiltrent naturellement la tumeur au fur et à mesure qu'elle se développe et tentent de monter une attaque. L'une des méthodes utilisées par les tumeurs pour échapper à la destruction des cellules T consiste à utiliser un antigène persistant, l'expression de récepteurs inhibiteurs et la sécrétion de molécules inhibitrices. L'immunothérapie par blocage des points de contrôle utilise des anticorps contre l'inhibiteur récepteurs tels que PD-1 (Opdivo, Keytruda), c'est le ligand PD-L1, CTLA-4 (Yervoy), Tim3, Lag3, etc. Cela tente de lever l'effet d'amortissement que ces récepteurs ont sur les cellules T afin qu'elles puissent recommencer à tuer. Le paradigme dépendant de l'antigène T est également soutenu par de telles publications qui examinent le blocage des points de contrôle dans le cadre de la diversité clonale des cellules T et confirment que (1) un répertoire diversifié de clones de cellules T entraîne un blocage réussi des points de contrôle, et (2) l'enrichissement de certains clonotypes dans le répertoire, vraisemblablement les clonotypes spécifiques de l'antigène, indique en outre une réponse (3).

En dessous se trouvent donc les indications entourées en rouge, notamment les histologies à faible fréquence de néoantigène. L'idée derrière les cellules CAR T est que je peux tirer parti de la biologie des cellules T, notamment que les cellules T reconnaissent l'antigène avec un récepteur et tuent la cellule cible. Donc, en revenant très rapidement à l'immunothérapie par blocage du point de contrôle, disons qu'un patient a un mélanome qui peut consister en des milliers de mutations et des centaines de néo-antigènes. Il y a une plus grande chance qu'une cellule T infiltrée ait une spécificité pour un antigène particulier. Alors, qu'en est-il d'un patient atteint de glioblastome ? Ils peuvent avoir 10 à 20 néo-antigènes, ou comme vous l'avez dit, ils peuvent n'avoir aucun néo-antigène, du moins aucun contre lequel leurs cellules T sont spécifiques. Le blocus des points de contrôle n'est donc peut-être pas aussi efficace. CAR signifie récepteur d'antigène chimérique. Il s'agit essentiellement d'un anticorps monoclonal dirigé contre une cible connectée à un lieur connecté au domaine intracellulaire d'un récepteur de cellule T. Les hémopathies malignes telles que le LNH comme le lymphome diffus à grandes cellules B sont généralement ciblées pour un récepteur des cellules B connu sous le nom de CD19. Donc, tout ce que vous avez à faire est de rendre votre CAR CD19 spécifique et de transfecter les cellules T avec à la place de leur propre récepteur de cellules T ou TCR. Donc, le processus de base derrière CAR est d'isoler vos cellules T comme pour la leucophérèse, de transfecter de manière lentivirale avec mon CAR anti-CD19, de développer et d'infuser. Il existe sur le marché deux produits CD19 CAR T avec de bons taux de réponse (Kymriah, YESCARTA). La raison pour laquelle ils sont bons est que nous pouvons les diriger vers n'importe quel antigène que nous voulons (bien sûr, faites attention aux auto-antigènes, voir auto-immunité).

Figure 2. Schéma de la thérapie cellulaire CAR T. (4)

L'approche CAR T est en fait parce que la charge en néoantigènes est faible ou inexistante, ce qui est problématique pour les cellules T non modifiées, et donc problématique pour les traitements standard comme le blocage des points de contrôle.

En tant que tel, il existe d'autres moyens et d'autres cellules qui peuvent gérer certaines des anomalies présentées par les tumeurs dans leur ensemble. Cela inclut la présence de motifs moléculaires associés au danger/dommages (DAMP) et la régulation des récepteurs de surface, par exemple, les ligands des récepteurs NK tels que MIC.

Le fonctionnement des DAMP est qu'un milieu de molécules est sécrété par des cellules endommagées ou transformées, signalant les cellules du système immunitaire inné. L'un des problèmes est que les DAMP favorisent un environnement inflammatoire. Cela signifie que oui, vous obtenez des cellules immunitaires qui vérifient la situation, mais que certaines d'entre elles sont de bonnes cellules immunitaires et d'autres sont « mauvaises » (cellules suppressives dérivées des myéloïdes (MDSC), macrophages M2 associés aux tumeurs (TAM) ou T -cellules régulatrices (Treg)). Ceux-ci atténuent la réponse immunitaire à la fois par la libération de cytokines inhibitrices comme l'IL-10 et l'expression de récepteurs inhibiteurs comme le PD-L1.

Figure 5. Les molécules sécrétées par le microenvironnement tumoral inflammatoire aident et nuisent à la réponse immunitaire. (5).

Et puis l'idée derrière les ligands NKR est assez simple : les cellules tueuses naturelles (NK) patrouillent régulièrement dans votre corps à la recherche d'anomalies et sont autorisées à tuer les cellules anormales. Par exemple, toutes les cellules nucléées expriment le complexe majeur d'histocompatibilité de classe I (MHC-I) à leur surface. Certains récepteurs comme MIC sont également présents à la surface cellulaire qui engagent des récepteurs sur les cellules NK comme NKG2D en détresse. Alors que font les cancers ? Ils expriment parfois des CMI tronquées et donc inactives, n'expriment pas de CMH mais expriment également des récepteurs inhibiteurs des cellules NK, etc.

Tout est bien résumé dans la figure suivante sur l'immunoédition du cancer (figure 7). Notez que pendant que les choses fonctionnent normalement, le système immunitaire peut gérer la charge tumorale. Au fur et à mesure que la balance bascule, et cela pourrait être par exemple, votre réponse des lymphocytes T supprime un immunoantigène mais ne prend pas soin de l'ensemble de la tumeur, ce qui entraîne une croissance à laquelle ces lymphocytes T ne répondent plus. Au fur et à mesure que cela se produit, le cancer devient de plus en plus invasif.

Figure 7. Immuno-édition du cancer. (7).

Donc juste pour clarifier à la fin, il n'y a probablement pas de cas où le système immunitaire ne répond pas du tout sauf si vous avez subi une chimiothérapie qui a détruit votre système immunitaire. Les environnements inflammatoires à eux seuls sont suffisants pour que vos cellules immunitaires vérifient au moins la tumeur. En fait, et je ne peux pas trouver l'article maintenant, mais je vais essayer, les enquêteurs ont même trouvé des cellules T naïves dans le microenvironnement tumoral simplement à cause de l'inflammation. Nous pourrions également entrer dans les tumeurs "chaudes" et "froides", mais c'est hors de portée ici (point à retenir, les tumeurs froides ne sont pas enflammées et sont connues pour contenir moins d'infiltrats immunitaires). J'ai utilisé l'immunothérapie comme véhicule pour faire passer mon message, notez que cette réponse ne concerne pas l'immunothérapie mais plutôt la théorie de l'évasion immunitaire et de la charge mutationnelle.


Non, vraiment, les vaccins à ARNm ne vont pas affecter votre ADN

La version courte : Il n'y a aucun moyen plausible que les vaccins à ARNm altèrent votre ADN. Cela violerait essentiellement tout ce que nous savons sur la biologie cellulaire.

Lodish H, Berk A, Kaiser C, Krieger M, Bretscher A, Ploegh H, Amon A, Martin K. Biologie cellulaire moléculaire. 8e éd. New York : W.H. Freeman 2016. Figure 5-1

Ce chiffre est utile car vous pouvez clairement voir les deux compartiments qui nous intéressent : le noyau, qui abrite la quasi-totalité de l'ADN (exception discutée), et le cytosol, où se produit la traduction.

Récemment, j'ai reçu un afflux de questions sur la façon dont nous pouvons vraiment être sûrs que les vaccins à ARNm n'affecteront pas notre ADN. Dans mon post précédent sur le sujet, j'ai écrit :

Lodish H, Berk A, Kaiser C, Krieger M, Bretscher A, Ploegh H, Amon A, Martin K. Biologie cellulaire moléculaire. 8e éd. New York : W.H. Freeman 2016. Figure 13-37B qui démontre l'exportation de l'ARNm du noyau.

Une autre préoccupation soulevée a été l'idée que l'ARNm peut en quelque sorte modifier le génome de l'hôte. Ce serait en fait super cool et énorme pour la thérapie génique (et je pourrais enfin me donner les ailes de chauve-souris géantes que j'ai toujours voulues) mais ce n'est pas le cas. Ceci est généralement impossible, sauf s'il existe également une enzyme transcriptase inverse qui produit de l'ADN à partir de la matrice d'ARN, ce qui explique le fonctionnement des rétrovirus. Il n'y a pas de tel risque avec un candidat vaccin à ARNm. Les vaccins à ARNm agissent entièrement dans le cytosol de la cellule - ils ne s'approchent pas du noyau où se trouve tout l'ADN. C'est en fait un avantage majeur des vaccins à base d'ARN par rapport à ceux à ADN.

Flint S, Racaniello V, Rall G, Skalka A, Enquist L. Principes de virologie. Washington, DC : ASM Press 2015. Figure 5.23C qui montre le cycle d'importation nucléaire avec les ribonucléoprotéines de la grippe comme exemple. Les signaux de localisation nucléaire sont reconnus par l'importine-α qui recrute alors l'importine-β qui recrute une petite GTPase appelée Ran. Lors de la liaison du GDP, Ran est capable de transporter le RNP à travers le complexe de pores nucléaires. Le complexe d'importines et de Ran se dissociera alors, et un facteur d'échange de nucléotides de guanine échangera GDP contre GTP, ce qui permet à Ran-GTP d'être exporté hors du noyau. RanGAP-1 ou RanBPI, 2 peut ensuite catalyser l'hydrolyse du GTP en GDP, ce qui permet à Ran de se lier à une autre importine-β pour relancer le cycle d'importation.

J'ai donné cette réponse en grande partie parce que je pensais que la discussion détaillée sur la transcription inverse, le trafic nucléaire, la voie endocytique et les 11 autres sujets de biologie cellulaire avancés que je devrais invoquer pour donner une réponse rigoureuse était trop complexe. être utile à la personne moyenne qui veut simplement savoir si cela est possible ou non. Cependant, j'ai eu une rafale de questions sur les « et si » concernant les rétrovirus ou les hépadnavirus (hépatite B), et je peux admettre que cette réponse ne traite pas de cela, alors je vais essayer d'y répondre de manière explicite et avec une complexité minimale. comme je suis capable.

Pour simplifier la discussion afin d'éviter d'avoir à expliquer les phases des bicouches phospholipidiques et la composition moléculaire de la nanoparticule lipidique en ce qui concerne la stabilité (discutée dans 1, 2, 3, 4), je demanderai aux lecteurs de tenir pour acquis que l'ARNm les vaccins sont endocytosés et libérés (et ce) dans le cytoplasme de la cellule.

Premièrement, pour que l'ARNm affecte votre ADN, nous devons au minimum établir qu'il aurait besoin d'accéder à l'ADN en question. Il y a deux compartiments subcellulaires où cela peut être accompli. Le premier est le noyau, commençons donc par une discussion sur le trafic de fret dans le noyau. Le noyau de la cellule est un compartiment isolé avec des complexes de pores (NPC) qui imposent des limites à la taille des particules pouvant entrer librement. L'ARN est facilement transporté lorsque la transcription se produit dans le noyau, mais les ribosomes nécessaires à la production de protéines se trouvent dans le cytosol ou sur le réticulum endoplasmique rugueux. Ce processus est médié par plusieurs protéines accessoires que vous pouvez voir à votre droite. Notez cependant qu'il n'y a aucune circonstance physiologique dans laquelle on pourrait avoir besoin d'ARN du cytosol pour être transporté vers le noyau. L'ARN est synthétisé dans le noyau. Les virus qui ont une phase nucléaire dans leur cycle de réplication doivent avoir diverses astuces pour pouvoir permettre à leur charge utile d'ARN d'entrer. Bien que l'ARN ne soit pas facilement transporté dans les cellules, les protéines peuvent l'être. Cela se produit via un réseau de protéines appelées importines (voir figure 5-23C à droite). Les protéines contenant une séquence d'acides aminés appelée séquence de localisation nucléaire (NLS, il y en a 2 communes) sont capables de se lier aux importines, qui peuvent ensuite les transporter à travers le complexe de pores nucléaires, comme indiqué à droite. Les virus à ARN ont souvent des cycles de réplication qui ne nécessitent pas d'accès au noyau, mais il existe quelques exceptions. Les virus de la grippe par exemple sont des virus à ARN dont le génome est associé à des ribonucléoprotéines, et ces ribonucléoprotéines expriment des signaux de localisation nucléaire qui facilitent l'entrée de leur ARN génomique dans le noyau. Les vaccins à ARNm, en revanche, ne sont associés à aucune protéine. Une fois à l'intérieur du cytosol, l'ARNm est nu et exposé à l'environnement hostile des ribosomes et des exonucléases qui détruisent l'ARNm en quelques heures (au plus). Il n'y a pas de mécanisme concevable par lequel l'ARNm peut être spontanément introduit dans le noyau. Étant constitué de nucléotides, il ne peut pas contenir de séquence de localisation nucléaire.

L'autre compartiment pertinent serait la mitochondrie. Les mitochondries sont en fait des bactéries vestigiales avec leurs propres génomes, et on pense qu'il y a des milliards d'années, une ancienne cellule (probablement un archéen - les cousins ​​​​des bactéries) a essayé de consommer l'ancêtre des mitochondries mais n'avait pas la machinerie pour faire la digestion et le deux ont établi une relation symbiotique. Depuis cette instance, les mitochondries ont été une caractéristique essentielle de la biologie de nos cellules. Cela a permis aux mitochondries de développer un génome extrêmement réduit contenant seulement 37 gènes (la plupart des gènes pertinents pour la fonction mitochondriale sont encore dans le noyau). Les mitochondries ont leurs propres ribosomes et même leur propre code génétique (en quelque sorte). Il existe également un processus spécialisé pour l'élimination des mitochondries malades appelé mitophagie, qui fait l'objet de nombreuses excellentes critiques, par ex. ceci, ceci et cela.

La conclusion collective de notre compréhension de ces processus biologiques est qu'un ARNm nu dans le cytosol n'a aucun potentiel pour se retrouver dans un compartiment cellulaire qui contient notre propre ADN signifie que, indépendamment de la présence ou de l'absence d'autres facteurs, il n'y a aucune chance de dommages à l'ADN du vaccin à ARNm. Mais les gens voulaient toujours me poser des questions sur les transcriptases inverses, alors discutons-en.

Le processus de passage de l'ARN à l'ADN (l'exact opposé de ce que dicte le dogme central de la biologie moléculaire) est connu sous le nom de transcription inversée, et elle est réalisée avec une enzyme appelée un transcriptase inverse (qui sont un groupe d'enzymes vraiment intéressant). En général, la transcription inverse est effectuée par quelques entités génétiques différentes : rétrovirus, hépadnavirus, télomères, et rétrotransposons. Ceux-ci méritent d'être définis.

Les rétrovirus sont des virus qui ont un génome à ARN, à partir duquel ils créent une copie d'ADN par transcription inverse qui s'intègre ensuite dans la cellule de l'hôte (c'est-à-dire, s'insère littéralement dans le génome de la cellule hôte et en devient une partie permanente, sous la forme d'une séquence appelée provirus). La séquence provirale elle-même peut ensuite être transcrite dans la cellule hôte pour produire des protéines virales et des particules qui peuvent se propager à la cellule suivante. Le rétrovirus le plus connu est le VIH-1.

Les hépadnavirus sont des virus à ADN qui ont des génomes vides (il y a un brin d'ADN complet et un autre brin d'ADN partiel qui est lié à un ARN prégénomique), et contrairement aux rétrovirus, ne s'intègrent pas dans le génome de la cellule hôte qu'ils infectent. L'exemple le plus connu est le virus de l'hépatite B, pour lequel de multiples vaccins efficaces existent.

Les télomères sont des structures présentes aux extrémités des chromosomes humains qui sont maintenues par un complexe protéique appelé télomérase qui utilise une transcriptase inverse appelée TERT pour les maintenir. Les raisons pour lesquelles cela est nécessaire sont discutées ci-dessous. Ils ont normalement une longueur d'environ 5 à 15 kilobases, et le raccourcissement entraîne l'arrêt de la croissance et de la réplication cellulaires (sénescence), ou peut même déclencher la mort cellulaire par apoptose.


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L'arbre généalogique de Rebecca, tel qu'illustré à la figure (PageIndex<1>), montre une incidence élevée de cancer parmi les proches parents. Mais les gènes sont-ils la cause du cancer dans cette famille ? Seuls les tests génétiques, qui sont le séquençage de gènes spécifiques chez un individu, peuvent révéler si un gène cancérigène est hérité dans cette famille.

Figure (PageIndex<1>) : Pedigree de la famille de Rebecca, tel que décrit au début de ce chapitre, montrant les personnes atteintes de cancer (rouge) et celles qui n'en ont pas (bleu). Les cercles représentent les femmes, les carrés représentent les hommes.

Heureusement pour Rebecca, les résultats de ses tests génétiques montrent qu'elle n'a pas les mutations du BRCA1 et BRCA2 gènes qui augmentent le plus souvent le risque de cancer chez une personne. Cependant, cela ne signifie pas qu'elle n'a pas d'autres mutations dans ces gènes qui pourraient augmenter son risque de développer un cancer. Il existe de nombreuses autres mutations dans les gènes BRCA dont l'effet sur le risque de cancer n'est pas connu, et il y en a peut-être encore bien d'autres à découvrir. Il est important de continuer à étudier les variations de gènes tels que BRCA chez différentes personnes afin de mieux évaluer leur contribution possible au développement de la maladie. Comme vous le savez maintenant grâce à ce chapitre, de nombreuses mutations sont inoffensives, tandis que d'autres peuvent avoir des effets importants sur la santé, selon la mutation spécifique et le gène impliqué.

Les mutations des gènes BRCA sont particulièrement susceptibles de provoquer le cancer, car ces gènes codent pour des protéines suppresseurs de tumeurs qui réparent normalement l'ADN endommagé et contrôlent la division cellulaire. Si ces gènes sont mutés d'une manière qui empêche les protéines de fonctionner correctement, d'autres mutations peuvent s'accumuler et la division cellulaire peut devenir incontrôlable, ce qui peut provoquer le cancer.

BRCA1 et BRCA2 se trouvent respectivement sur les chromosomes 17 et 13, qui sont des autosomes. Comme l'a mentionné la conseillère en génétique Rebecca, les mutations de ces gènes ont un modèle héréditaire dominant. Maintenant que vous connaissez le modèle de transmission des gènes autosomiques dominants si la grand-mère de Rebecca fait avez une copie d'un gène BRCA muté, quelles sont les chances que la mère de Rebecca ait également cette mutation ? Parce qu'il est dominant, une seule copie du gène est nécessaire pour augmenter le risque de cancer, et parce qu'il se trouve sur les autosomes au lieu des chromosomes sexuels, le sexe du parent ou de la progéniture n'a pas d'importance dans le schéma héréditaire. Dans cette situation, les œufs de la grand-mère de Rebecca auraient eu 50% de chances d'avoir une mutation du gène BRCA, en raison de la loi de ségrégation de Mendel. Par conséquent, la mère de Rebecca aurait eu 50% de chance d'hériter de ce gène. Même si Rebecca n'a pas les mutations BRCA les plus courantes qui augmentent le risque de cancer, cela ne signifie pas que sa mère n'en a pas non plus, car il n'y aurait également que 50% de chances qu'elle le transmette à Rebecca. Par conséquent, la mère de Rebecca devrait également envisager de se faire tester pour les mutations des gènes BRCA.Idéalement, les personnes atteintes de cancer dans une famille devraient d'abord être testées lorsqu'une cause génétique est suspectée afin que s'il y a une mutation spécifique héritée, elle puisse être identifiée et les autres membres de la famille puissent être testés pour cette même mutation.

Des mutations dans BRCA1 et BRCA2 sont souvent trouvées dans les familles juives ashkénazes. Cependant, ces gènes ne sont pas liés au sens chromosomique, car ils sont sur des chromosomes différents et sont donc hérités de manière indépendante, conformément à la loi de Mendel de l'assortiment indépendant. Pourquoi certaines mutations génétiques seraient-elles répandues dans des groupes ethniques particuliers ? Si les membres d'un groupe ethnique ont tendance à produire des descendants les uns avec les autres, leurs gènes resteront répandus au sein du groupe. Il peut s'agir de gènes de variations inoffensives telles que la couleur de la peau, des cheveux ou des yeux, ou de variations nocives telles que les mutations des gènes BRCA. D'autres maladies et troubles d'origine génétique sont parfois plus fréquents dans des groupes ethniques particuliers, comme la mucoviscidose chez les personnes d'origine européenne et l'anémie falciforme chez les personnes d'origine africaine. Vous en apprendrez plus sur la prévalence de certains gènes et traits dans des groupes ethniques et des populations particuliers dans le chapitre sur Variante humaine.

Comme vous l'avez appris dans ce chapitre, la génétique n'est pas le seul déterminant du phénotype. L'environnement peut également influencer de nombreux traits, tels que la taille adulte et la couleur de la peau. L'environnement joue également un rôle majeur dans le développement du cancer. 90 à 95 % de tous les cancers n'ont pas de cause génétique identifiée et sont souvent causés par des agents mutagènes présents dans l'environnement, tels que les rayons UV du soleil ou des produits chimiques toxiques dans la fumée de cigarette. Mais pour les familles comme Rebecca, connaître leurs antécédents familiaux et leur constitution génétique peut les aider à mieux prévenir ou traiter les maladies causées par leur héritage génétique. Si une personne sait qu'elle a un gène qui peut augmenter son risque de cancer, elle peut modifier son mode de vie, subir des dépistages précoces et plus fréquents du cancer, et peut même choisir de subir des chirurgies préventives qui peuvent aider à réduire son risque de cancer et à augmenter son chances de survie à long terme en cas de cancer. La prochaine fois que vous irez chez le médecin et qu'il vous demandera si des membres de votre famille ont eu un cancer, vous comprendrez mieux pourquoi cette information est si importante pour votre santé.


Mentir avec la science

Jetons donc un coup d'œil au communiqué de presse et à l'article scientifique dont il faisait la promotion. Le communiqué de presse est intitulé “In a Twist, Scientists Find Cancer Drivers Hiding in RNA, Not DNA“, et l'article a été publié dans Nature par Christine Mayr, biologiste moléculaire et cellulaire au MSKCC qui étudie l'ARNm. L'étude s'intitule « La polyadénylation intronique généralisée inactive les gènes suppresseurs de tumeur dans la leucémie », ce qui n'est bien sûr pas le genre de titre que la plupart des gens comprendraient. Ne vous inquiétez pas. Je vais vous expliquer.

Mais d'abord, je dois expliquer un peu de contexte. Lors de la discussion des vaccins COVID-19 à base d'ARNm et de la façon dont ils ne "reprogramment pas votre ADN" et ne sont pas une "thérapie génique", j'ai expliqué comment l'ADN code l'ARN qui code finalement la protéine. Avant de discuter de ce que l'article montre réellement et pourquoi Wells applique mal ses conclusions, je pense qu'il est utile de revoir les bases de cet aspect de la biologie moléculaire. Voici un schéma très basique du processus :

Le “dogme central de la biologie moléculaire”. L'information circule de l'ADN à l'ARN et est ensuite utilisée pour fabriquer des protéines.

Fondamentalement, l'ADN se réplique à partir d'une matrice d'ADN et donne une molécule double brin très stable, car elle possède des séquences complémentaires qui se lient étroitement les unes aux autres de manière spécifique à la séquence. Cette matrice d'ADN est déroulée par des enzymes qui utilisent la matrice pour fabriquer des brins d'ARN, qui sont simple brin, qui sont ensuite utilisés par un ribosome pour fabriquer des protéines à partir d'acides aminés. Encore une fois, pour le dire simplement, chaque nucléotide équivaut à une lettre du code, chaque séquence de trois nucléotides (codon) équivaut à un "mot" qui se traduit par un acide aminé. Étant donné qu'il y a quatre nucléotides, il y a 64 codons possibles. Puisqu'il n'y a que 20 acides aminés, cela signifie que la plupart des acides aminés sont codés par plus d'une combinaison de nucléotides ou plus d'un codon, c'est-à-dire que le code génétique est redondant. Bien sûr, c'est plus compliqué que cela, comme le montre ce schéma :

Après que le code génétique a été craqué il y a 60 ans, il est vite devenu évident que les ARN codant pour les protéines ne sont souvent pas complètement formés juste après leur transcription. Souvent, l'ARN commence comme un ARN précurseur plus long (un pré-ARNm) qui est épissé à la séquence d'ARNm finale avant d'être transporté hors du noyau dans le cytoplasme pour être utilisé pour conduire la production de protéines dans le cytoplasme. En bref, l'ARN précurseur qui est initialement transcrit contient des séquences appelées “exons” et “introns”. Dans les gènes, les exons contiennent les séquences nucléotidiques qui codent pour la protéine réelle, tandis que les introns contiennent des séquences nucléotidiques qui ne codent pour rien mais peuvent avoir des séquences importantes qui régulent la production et l'activité des gènes. Voici une illustration du processus d'épissage de Wikipédia :

Ce schéma est en fait assez simple, avec deux exons et un intron. Certains gènes ont de nombreux exons et introns, nécessitant des épissures multiples, comme dans ce schéma :

Ai-je oublié de mentionner que les ARNm sont également traités pour avoir un “cap” à une extrémité et un tronçon d'As (une queue poly-A) à l'autre extrémité ? La queue poly-A est très importante dans la régulation de la stabilité de l'ARNm et donc de sa demi-vie dans le cytoplasme. Dans tous les cas, comme pour tout processus biologique, les choses peuvent mal tourner avec ces événements d'épissage. Les mutations du site d'épissage, par exemple, peuvent entraîner des ARNm mal épissés et des protéines dépourvues d'exons :

Je pourrais continuer encore et encore. Il existe des gènes normaux qui peuvent produire plus d'une protéine par épissage alternatif :

Parfois, lorsque l'épissage tourne mal, il peut en résulter une protéine tronquée dépourvue d'une extrémité. Par exemple, si un intron reste attaché à deux exons, il y a de fortes chances que le ribosome (le complexe enzymatique qui traduit l'ARNm en protéine) atteigne un codon "stop" (trois nucléotides qui indiquent à la transcription de s'arrêter) bien avant atteint l'autre extrémité de l'intron, moment auquel la transcription s'arrêtera tout simplement. Tout cela ne compte même pas les autres modifications moléculaires que l'ARN peut subir au cours de son parcours, de la transcription au pré-ARNm en passant par l'épissage jusqu'à l'ARNm «mature» final.

Sans surprise, si ces types d'erreurs se produisent dans des gènes importants pour les processus de régulation de la croissance et de l'invasion cellulaire, le cancer peut résulter, soit d'un mauvais épissage en supprimant une région régulatrice dans la protéine qui la contrôle, soit en produisant une protéine qui ne le fait pas. fonctionner comme il se doit. Les exemples de cancers causés ou accélérés par une mutation du site d'épissage s'accumulent. C'est cette dernière possibilité, une protéine tronquée qui ne fonctionne pas, que l'article mal appliqué par Wells examine. Les protéines compromises par la troncature sont des protéines suppresseurs de tumeurs, dont la fonction est d'arrêter la croissance ou d'autres processus pouvant entraîner un cancer lorsqu'elles sont trop actives.

Alors, que montrait le papier ? Ce qui était intéressant à propos de l'article, c'est qu'il montrait l'existence d'erreurs d'épissage dans les gènes suppresseurs de tumeurs dans un cancer spécifique, la leucémie lymphoïde chronique, sans mutations dans les sites d'épissage pour expliquer comment ces protéines ont été tronquées en raison d'erreurs d'épissage, ou, comme les auteurs mettez-le dans le manuscrit :

Nous avons découvert une régulation à la hausse généralisée des ARNm tronqués et des protéines dans les cellules CLL primaires qui n'étaient pas générées par des altérations génétiques mais se produisaient plutôt par polyadénylation intronique.

Les protéines tronquées générées par polyadénylation intronique manquent souvent des fonctions suppressives de tumeur des protéines de pleine longueur correspondantes (telles que DICER et FOXN3), et plusieurs ont même agi de manière oncogène (telles que CARD11, MGA et CHST11). Dans la LLC, l'inactivation des gènes suppresseurs de tumeurs par le traitement aberrant de l'ARNm est sensiblement plus fréquente que la perte fonctionnelle de ces gènes par des événements génétiques.

Alors qu'est-ce que tout cela veut dire? Premièrement, pour réitérer et simplifier, les auteurs ont détecté des ARNm et des protéines tronqués pour un certain nombre de gènes suppresseurs de tumeurs dans la LLC qui ne pouvaient pas être expliqués par des mutations de l'ADN dans les gènes eux-mêmes, telles que des mutations au site d'épissage. Ils ont fait beaucoup d'autres contrôles, comme s'assurer que l'explication des protéines tronquées n'était pas le clivage par des protéases, des enzymes qui coupent les protéines à des séquences d'acides aminés spécifiques. Après avoir écarté d'autres possibilités, les auteurs ont démontré que ces ARNm et protéines étaient tronqués en raison d'un processus appelé polyadénylation intronique. Mais qu'est-ce que c'est ?

La polyadénylation est le processus consistant à ajouter un groupe d'adénosines (As) à l'extrémité 3 & 8242 d'une molécule d'ARN. C'est ainsi que la queue poly-A est ajoutée à l'extrémité d'un ARNm, mais il s'avère que c'est un processus courant pour que la polyadénylation se produise dans les introns. Ce procédé est très répandu et était apprécié il y a bien plus d'une décennie. Il s'agit de diversifier les produits des ARNm des cellules immunitaires, le processus s'explique ainsi :

Dans la littérature sur l'épissage, les isoformes générées par la reconnaissance d'un signal IpA sont souvent décrites comme des événements alternatifs du dernier exon. On pense que les gènes qui génèrent des isoformes IpA hébergent des signaux d'épissage et de polyadénylation concurrents, produisant un ARN messager de pleine longueur (ARNm) lorsque l'épissage surpasse la polyadénylation et produit autrement un ARNm tronqué. Comme l'événement déterminant est la reconnaissance d'un signal IpA, nous appelons ces transcrits des isoformes IpA. Il est maintenant possible de reconnaître l'expression répandue des isoformes IpA grâce à l'analyse des données de séquençage de l'extrémité 3'.

Ou, pour le dire plus simplement, qu'il y ait une protéine tronquée ou une protéine complète dépend de l'équilibre entre l'épissage et la poly-adénylation au niveau du site dans l'intron. S'il y a plus d'activité d'épissage, vous obtenez beaucoup plus de protéines entières. S'il y a plus de polyadénylation, vous obtenez beaucoup plus de protéine tronquée. Ce que le laboratoire de Mayr a découvert, c'est qu'une trop grande polyadénylation peut entraîner des protéines suppressives de tumeur tronquées dans la LLC, contribuant au développement du cancer, c'est pourquoi, selon le communiqué de presse du MSKCC qui explique assez bien les résultats :

Ces résultats aident à expliquer une énigme de longue date, à savoir que les cellules LLC ont relativement peu de mutations de l'ADN connues. Certaines cellules LLC n'ont même pas de mutations connues. En effet, les modifications de l'ARNm découvertes par l'équipe du Dr Mayr pourraient expliquer les mutations manquantes de l'ADN.

Étant donné que la LLC est un cancer à croissance si lente et que les personnes atteintes de LLC vivent souvent de nombreuses années, il est trop tôt pour dire si ces modifications de l'ARNm sont associées à un pronostic plus sombre.

Il existe des différences importantes entre les modifications de l'ARNm et une véritable mutation de l'ADN. Plus important encore, l'inactivation des suppresseurs de tumeurs par l'ARNm n'est généralement que partielle, seulement environ la moitié des molécules protéiques pertinentes dans les cellules tumorales sont tronquées. Mais dans de nombreux cas, cela suffit pour remplacer complètement la fonction des versions normales présentes. Et parce que cette troncature pourrait s'appliquer à 100 gènes différents à la fois, les changements peuvent s'additionner.

Alors pourquoi tout cela n'a-t-il rien à voir avec les vaccins à base d'ARNm causant le cancer ? Je suis content que vous ayez posé la question et j'espère que cela ne vous dérange pas que j'aie profité de cette opportunité pour faire un peu de folie, au sens de la biologie moléculaire. La biologie dont maltraite Wells est en fait assez complexe et fascinante, et je ne parle plus très souvent de biologie moléculaire pure. J'espère que je n'ai pas perdu trop de lecteurs avec l'explication, mais je parie également que plus d'un d'entre vous ont déjà compris pourquoi ce que Wells colporte est un non-sens total. Sinon, on y va.


Le rôle complexe de la NMD dans le cancer

Les tumeurs ont trouvé des moyens de tirer parti de leur croissance sans contrainte et de la progression du cancer en tirant parti des deux fonctions de la NMD. D'une part, les cellules cancéreuses utilisent l'activité NMD pour réguler à la baisse sélectivement les gènes suppresseurs de tumeurs par acquisition PTC, mais d'autre part, ces cellules affinent l'amplitude NMD pour permettre la régulation à la hausse des gènes correcteurs de stress responsables de leur adaptation au microenvironnement tumoral [21, 26]. Bien qu'apparemment simple, le rôle de la NMD dans le développement et la progression du cancer peut, en fait, être assez complexe [2, 26, 148, 149]. Alors que dans certains contextes, la NMD peut fonctionner comme une voie de suppression tumorale, dans d'autres scénarios, son activité pourrait aggraver la maladie, en fonction de l'histoire évolutive génétique de la tumeur [2, 151].

Activité NMD contre la tumorigenèse

Des mutations invalidantes dans les gènes codant pour les facteurs NMD ont été trouvées dans plusieurs types de cancers, ce qui a soulevé la possibilité que la NMD ait un certain type de rôle protecteur contre la tumorigenèse. Par exemple, dans les tumeurs du carcinome adénosquameux pancréatique (ASC) et dans les tumeurs myofibroblastiques inflammatoires pulmonaires (IMT), le gène UPF1 présente des mutations modifiant l'épissage qui compromettent l'activité NMD [27, 28]. Cela peut conduire à la régulation à la hausse des gènes généralement contrôlés par la NMD qui, par conséquent, contribuent au phénotype de la maladie. Par exemple, la cible NMD codant pour la protéine kinase kinase kinase 14 activée par un mitogène (MAP 3 K14 ou NIK), un puissant activateur de la voie de signalisation du facteur nucléaire pro-inflammatoire kappa B (NF-κB), est régulée à la hausse dans les IMT mutés par UPF1. , favorisant la production de chimiokines et les infiltrations immunitaires qui caractérisent ce type de tumeurs [28]. De même, les adénocarcinomes pulmonaires (ADC) et les carcinomes hépatocellulaires (CHC) affichent une expression inférieure de l'UPF1 par rapport aux tissus normaux en raison de l'hyperméthylation du promoteur, une constatation qui est corrélée à un mauvais pronostic chez les patients atteints de CHC [147, 152]. L'altération résultante de la voie NMD conduit à la régulation à la hausse des facteurs de la voie de signalisation du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β), qui entraînent la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et, par conséquent, la tumorigenèse et la métastase néoplasmique [147]. Conformément à ces résultats cliniques, il existe des données expérimentales montrant que la surexpression d'UPF1 réduit le nombre et la taille des colonies de cellules tumorales en culture par rapport aux cellules témoins de plusieurs lignées cellulaires cancéreuses [26]. De plus, les cellules de cancer de la prostate (PC3) surexprimant UPF1 injectées comme explants tumoraux chez des souris nudes ne présentent aucune croissance tumorale significative [26]. Fait intéressant, une analyse du réseau d'expression réalisée dans des cellules d'ostéosarcome osseux humain (U2OS) soumises à l'inhibition de la NMD a révélé que la NMD contrôle l'expression d'une grande variété de transcrits qui codent pour des facteurs importants impliqués dans les processus liés à la tumorigenèse, notamment la croissance cellulaire, le cycle cellulaire, la croissance signalisation des facteurs, apoptose et migration cellulaire [26]. Dans l'ensemble, il semble que le NMD fonctionne généralement comme une voie de suppression de tumeur en régulant l'expression des gènes impliqués dans la prolifération, la différenciation et la survie cellulaire, et que les tumeurs avec NMD altérée, comme celles avec UPF1 muté, ont des conditions favorables à la prolifération tumorale (Fig. .3a). À l'appui de cette idée, une étude rapporte que l'UPF3A, un paralogue de l'UPF3B qui inhibe la NMD en séquestrant l'UPF2 [47], est fortement exprimé dans les tissus métastatiques du cancer colorectal (CCR) par rapport aux tissus primaires [153]. Cette expression plus élevée est associée à des métastases hépatiques, des récidives et un mauvais pronostic chez les patients atteints de CCR [153]. Cette découverte a également été rapportée dans une étude précédente dans laquelle l'interaction des facteurs de transcription oncogènes, du transducteur de signal et de l'activateur de la transcription 3 (STAT3), de l'homologue de l'oncogène du gliome 1 (GLI1) et du GLI1 tronqué (tGLI1), a été vue pour promouvoir UPF3A régulation à la hausse [154]. Cette expression plus élevée d'UPF3A augmente l'agressivité des cancers du sein triple-négatifs et enrichis en récepteurs du facteur de croissance épidermique humain 2 (HER2) et aggrave la survie sans métastase, selon le profil d'expression génique des tumeurs du sein extrait de la base de données GEO [154]. Ainsi, il est possible que certaines tumeurs avec des facteurs NMD entièrement fonctionnels aient trouvé un autre moyen de contrôler l'activité NMD en augmentant l'expression de modulateurs, comme UPF3A, pour tirer parti de la tumorigenèse et/ou conduire la maladie (Fig. 3a).

Rôles de la désintégration de l'ARNm non-sens (NMD) dans le cancer. une Des mutations invalidantes ou des changements dans le niveau d'expression génique des principaux facteurs NMD (UPF1 par exemple) se produisent dans différents types de cancer [par exemple, tumeur myofibroblastique inflammatoire pulmonaire (IMT), carcinome adénosquameux pancréatique (ASC), adénocarcinome pulmonaire (ADC), et le carcinome hépatocellulaire (CHC)]. Le cas de gauche représente l'UPF1 muté (Mut) qui entraîne une diminution de l'activité NMD entraînant la régulation à la hausse d'une cible NMD codant pour la protéine kinase kinase kinase 14 activée par un mitogène (MAP 3 K14) et stimulant le NF-κB (facteur nucléaire kappa - amplificateur de chaîne légère des cellules B activées), induisant ainsi la production de chimiokines et les infiltrations immunitaires. L'exemple du milieu illustre une activité NMD plus faible en raison de la régulation négative de l'UPF1, qui provoque la régulation positive de plusieurs facteurs de la voie du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β). Cela favorise la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) et par conséquent, le nombre d'événements métastatiques. L'exemple de droite montre l'interaction entre trois oncoprotéines, STAT3, GLI1 et tGL1, pour induire des niveaux de protéines plus élevés d'UPF3A, qui inhibent l'activité NMD, augmentant la progression maligne de la tumeur. b Les gènes suppresseurs de tumeurs peuvent perdre complètement leur fonction par acquisition PTC et dégradation subséquente de la NMD, combinées soit à la délétion de l'allèle de type sauvage, soit à l'haploinsuffisance de l'allèle restant. D'autre part, un gène suppresseur de tumeur peut subir une mutation résistante à la NMD, conduisant à une protéine dominante négative qui entrave la fonction de type sauvage. c Le microenvironnement tumoral module la NMD afin de surmonter différents types de stress cellulaires associés à la croissance sans contrainte de la tumeur. Des stress tels que l'hypoxie, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) ou la privation de nutriments favorisent la phosphorylation d'eIF2α, qui inhibe la NMD et, par conséquent, plusieurs ARNm codant pour des facteurs sensibles au stress sont stabilisés, permettant la progression et l'adaptation de la tumeur. WT : type sauvage PTC : codon de terminaison prématurée aa : acide aminé

En plus de son rôle dans la régulation de l'expression génique, la capacité de la NMD à dégrader les transcrits hébergeant la PTC peut également être impliquée dans la protection du développement du cancer. Il a été montré que les gènes suppresseurs de tumeurs ont une propension plus élevée à acquérir des mutations non-sens que les oncogènes, qui présentent principalement des mutations faux-sens [19]. De plus, beaucoup de ces mutations non-sens devraient induire la NMD [19].En effet, plusieurs gènes suppresseurs de tumeurs présentaient des mutations introduisant le PTC dans une pléthore de cancers, comme p53 dans le lymphome à cellules du manteau [23] et les cancers du sein [20], le gène E-cadhérine (CDH1) dans les cancers gastriques diffus héréditaires ( HDGC) [155], le gène du rétinoblastome 1 (RB1) dans le lymphome à cellules du manteau [23], le gène de la protéine de susceptibilité au cancer du sein de type 1 (BRCA1) dans les cancers du sein et de l'ovaire [22] et la protéine de susceptibilité au cancer du sein de type 2 (BRCA2) gène dans les cancers du sein [25]. Fait intéressant, les transcrits anormaux résultant de ces gènes suppresseurs de tumeurs mutés sont stabilisés dans des conditions de NMD inhibée, suggérant que cette voie est généralement responsable de leur dégradation [20, 22, 23, 25, 155]. Par conséquent, dans ces contextes, la fonction de contrôle de qualité de la NMD peut protéger la cellule de la production de protéines potentielles dominantes-négatives qui, sinon, conduiraient à la tumorigenèse, comme cela a été décrit dans différents modèles, comme BRCA1 chez la souris nude [156] , p53 dans des échantillons humains [27], ou le gène de la protéine tumorale 1 (WT1) de Wilms dans des études in vitro [24].

Activité NMD dans le développement et la progression du cancer

Malgré la notion claire que la NMD peut agir contre le cancer, dans certains contextes, son activité peut avoir l'effet inverse. Par exemple, il a été récemment rapporté que l'inhibition de la NMD dans les CRC avec instabilité des microsatellites (MSI) entraîne une diminution de la croissance tumorale dans les modèles de xénogreffe, suggérant que la NMD joue généralement un rôle pro-tumorigène dans ces tumeurs [157]. En effet, les CRC avec MSI présentent une expression plus élevée de UPF1, UPF2, SMG1, SMG6 et SMG7, par rapport aux homologues CRC avec stabilité microsatellite. On pense que la surexpression des facteurs NMD potentialise la dégradation du nombre accru de transcrits porteurs de PTC potentiellement toxiques que les CRC MSI produisent de manière caractéristique, favorisant leur survie [157]. Dans un contexte différent, si un gène suppresseur de tumeur hébergeant PTC code pour une protéine tronquée qui préserve totalement ou partiellement sa fonction d'origine, plutôt qu'une protéine dominante-négative comme décrit ci-dessus, la dégradation ciblée de son ARNm par NMD pourrait favoriser le cancer. développement. En conséquence, les patients porteurs de mutations NMD-sensibles dans CDH1 présentent un risque plus élevé de développer une HDGC que les patients porteurs de mutations NMD-résistantes, probablement parce que ces derniers produisent des formes tronquées mais toujours fonctionnelles de la E-cadhérine [155]. Fait intéressant, dans une étude faisant correspondre les données de l'exome et du transcriptome de tumeurs humaines, il a été rapporté que les mutations non-sens sont enrichies dans les régions des gènes suppresseurs de tumeurs susceptibles d'induire la NMD [21]. Comme ces mutations surviennent généralement dans l'hétérozygotie [19], cela soulève la question de savoir comment la NMD potentialise le développement du cancer lorsqu'au moins un allèle d'un suppresseur de tumeur est fonctionnel [158]. À ce sujet, Lindeboom et al. ont révélé que les cellules cancéreuses tirent parti de l'activité NMD pour accomplir une inactivation complète du suppresseur de tumeur, qui peut se produire par trois mécanismes : un processus « à deux coups » ii) sélection des mutations induisant la NMD dans les versions haplo-insuffisantes de l'allèle de type sauvage, pour éliminer la fonction résiduelle et moins fréquemment, iii) sélection des mutations résistantes à la NMD dans les allèles qui produisent des protéines dominantes négatives [ 21] (Fig. 3b).

En plus de participer au processus de développement du cancer, l'activité NMD semble également avoir un impact sur l'évolution tumorale. Au cours de la progression du cancer, les cellules tumorales acquièrent plusieurs mutations somatiques qui peuvent, ou non, favoriser le processus tumorigène. Ceci s'accompagne d'une sélection positive et négative qui permet la prolifération de sous-clones avec des mutations favorables, comme les PTC dans les gènes suppresseurs de tumeurs ou les mutations NMD-résistantes/faux-sens dans les oncogènes, tout en éliminant ceux portant des mutations néfastes. Par ce moyen, les cellules cancéreuses profitent de l'activité NMD et des règles qui régissent son induction pour favoriser la prolifération de cellules transformées surproduisant des oncoprotéines et autres protéines pro-tumorigènes, aggravant et aggravant ainsi la maladie [19, 21].

Un rôle pour l'AS-NMD dans le cancer

Comme expliqué précédemment, l'activité NMD est intimement liée à la SA, formant ensemble un mécanisme post-transcriptionnel clé de la régulation de l'expression génique. Au cours de la dernière décennie, de nombreux événements de SA dérégulée ont été observés dans plusieurs types de cancer, impliquant généralement des facteurs d'épissage mutés qui conduisent à des modèles modifiés d'expression génique à l'échelle du génome. Cela peut entraîner la production d'isoformes d'oncogènes sensibles à la NMD et de gènes suppresseurs de tumeurs qui contribueront donc au développement du cancer. Un exemple bien documenté est la protéine SR, SRSF2, fréquemment mutée chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LAM) [159, 160]. Une étude récente a rapporté que la mutation du point chaud Pro95 dans SRSF2 améliore la stabilisation des EJC en aval du PTC, favorisant ainsi l'association de facteurs clés de la NMD pour déclencher la NMD [159]. Une cible robuste de SRSF2Mut est EZH2, qui code pour une protéine qui catalyse la méthylation des histones et agit comme suppresseur de tumeur dans les malignités myéloïdes [161]. SRSF2Mut entraîne l'inclusion d'un exon toxique dans le pré-ARNm EZH2 qui déclenche la NMD et arrête par conséquent son expression protéique [159]. En accord avec ce résultat, il existe des études rapportant des mutations de perte de fonction d'EZH2 dans le même spectre de troubles myéloïdes présentant un SRSF2 muté [162, 163]. Ces données suggèrent que la mutation Pro95 transforme SRSF2 en une oncoprotéine qui utilise AS-NMD pour arrêter l'expression d'un gène suppresseur de tumeur.

La cadhérine épithéliale (E-cadhérine) est un facteur crucial pour maintenir l'intégrité des tissus et la polarisation des couches de cellules épithéliales et il est bien connu que la perte d'E-cadhérine est un événement clé au cours de la progression du cancer qui contribue à la transition épithéliale-mésenchymateuse [164] . Fait intéressant, Matos et al. ont découvert que l'une des causes conduisant à la diminution de la E-cadhérine est un variant d'ARNm produit par AS qui est impliqué dans la NMD [165]. Cette nouvelle isoforme résulte de l'utilisation d'un site d'épissage 3' alternatif qui se termine par l'épuisement de 34 nucléotides dans l'exon 14, introduisant un PTC. De plus, les cellules MCF7 stables du cancer du sein exprimant cette nouvelle variante ont entraîné une diminution concomitante des niveaux d'ARNm de la E-cadhérine de type sauvage et une migration cellulaire et un pouvoir invasif plus élevés [165]. Cependant, il reste à élucider le mécanisme par lequel AS favorise cette isoforme alternative. Un autre exemple d'événement AS-NMD impactant EMT est celui orchestré par SRSF1. Ce facteur d'épissage favorise une isoforme constitutivement active du proto-oncogène MST1R ((Macrophage Stimulating 1 Receptor), en induisant le saut de l'exon 11 [166]. Par conséquent, l'isoforme active de MST1R induit l'EMT, ainsi qu'augmente la résistance à l'apoptose [ 167,168,169]. L'AS-NMD opère en amont dans cette voie, induisant la rétention d'intron 3'UTR dans SRSF1 dans des conditions physiologiques, ce qui crée un contexte prématuré de codon stop induisant la NMD. Cependant, dans un contexte tumorigène, un autre facteur d'épissage, KHDRBS1 (KH RNA Binding Domain Containing, Signal Transduction Associated 1), stabilise l'ARNm de SRSF1, qui se transforme en une régulation positive du MST1R actif constitutif.

L'hypoxie est une caractéristique majeure des tumeurs solides, étant donné la masse proliférante élevée de cellules cancéreuses rencontrant un environnement avasculaire qui limite l'apport d'oxygène [170]. Fait intéressant, l'hypoxie semble avoir un impact sur l'AS-NMD, comme observé pour l'inducteur angiogénique riche en cystéine 61 (CYR61), une protéine matricellulaire qui favorise la prolifération cellulaire, la migration et l'angiogenèse dans de nombreuses tumeurs solides [171,172,173]. Dans des conditions normales, CYR61 subit une rétention de l'intron 3, qui se traduit par une PTC en aval, conduisant à une isoforme sensible à la NMD [174]. Néanmoins, des conditions hypoxiques modifient cette régulation du gène AS-NMD, induisant un saut de l'intron 3, ce qui rend le transcrit résistant à la dégradation par NMD.

N 6 -Méthyladénosine (m 6 A) La méthylation de l'ARNm est une modification courante de l'ARNm régulée dynamiquement dans les cellules de mammifères [175] qui contrôle plusieurs étapes du métabolisme de l'ARNm, depuis le traitement et le transport de l'ARNm jusqu'à la traduction ou la désintégration [176,177,178,179]. METTL3, la sous-unité catalytique du complexe m 6 A méthyltransférase, joue un rôle essentiel dans la tumorigenèse, favorisant la prolifération cellulaire, la survie et l'invasion des cellules cancéreuses [180,181,182]. Fait intéressant, Li et al. ont récemment découvert que METTL3 module l'épissage alternatif des facteurs d'épissage affectant le pool d'isoformes porteuses de PTC dans les cellules de glioblastome [183]. Des études de transcriptome ont montré qu'une méthylation altérée de METTL3 entraîne la génération de PTC dans les ARNm de plusieurs SRSF, contrairement au scénario existant dans les gliomes malins, qui sont associés à une expression élevée de METTL3 et à des niveaux d'expression plus faibles des formes épissées NMD des SRSF [183]. De plus, les auteurs ont démontré que l'oncogénicité dérivée de l'activité METTL3 est due à des changements dans les événements d'épissage alternatif des gènes avec des implications pertinentes dans la mort et la migration des cellules cancéreuses, comme BCL-X et NCOR2. Dans l'ensemble, cela indique clairement que les événements AS dérégulés dans les cellules cancéreuses contribuent à l'implication de la NMD dans le développement et/ou la progression du cancer.

Modulation NMD dans le microenvironnement tumoral

En contraste frappant avec les exemples précédents dans lesquels le NMD favorise le cancer, il y a la découverte que le microenvironnement tumoral induit une atténuation du NMD pour potentialiser la progression et l'adaptation du cancer, soulignant l'idée que l'activité du NMD a des résultats paradoxaux. Comme mentionné ci-dessus, lors de la croissance sans contrainte de la tumeur, l'apport sanguin aux cellules cancéreuses devient insuffisant, créant un environnement cellulaire d'hypoxie, de privation de nutriments, de production de ROS et de stress du RE, autant de stimuli qui favorisent la phosphorylation d'eIF2α et inhibent la NMD [26 , 105, 107, 109, 148] (Fig. 3c). En conséquence, il a été rapporté que les cellules cancéreuses cultivées sous forme d'explants tumoraux tridimensionnels présentent une activité NMD réduite par rapport aux cellules cancéreuses cultivées en monocouches, affichant des niveaux significatifs d'eIF2α-P [26]. En fait, plusieurs études ont montré des niveaux accrus d'eIF2α-P dans une pléthore de cancers, y compris les carcinomes bronchioloalvéolaires, gastro-intestinaux et thyroïdiens, le lymphome de Hodgkin, les néoplasmes épithéliaux mélanocytaires et coliques et le cancer du sein [184,185,186,187,188,189]. L'effet négatif de cette inhibition du NMD induite par le stress dans les tumeurs est la stabilisation et la régulation à la hausse de plusieurs transcrits codant pour des facteurs sensibles au stress, ce qui aidera les cellules cancéreuses à proliférer dans l'environnement défavorable de la tumeur [26] (Fig. 3c). Par exemple, il a été rapporté que l'inhibition de la NMD par le stress stabilise l'ARNm de l'antiporteur cystine/glutamate xCT [Solute Carrier Family 7 Member 11 (SLC7A11)], une sous-unité du système de transport d'acides aminés xCT. Ce canal limitant la vitesse est responsable de l'absorption de la cystine pour la production de l'antioxydant cellulaire, le glutathion (GSH), un tripeptide qui neutralise les radicaux libres et les composés réactifs de l'oxygène. Curieusement, il a été montré que les cellules appauvries en UPF1 peuvent survivre à des doses plus élevées de H2O2 d'une manière dépendante de SLC7A11, suggérant que l'altération de la NMD pendant le stress, et la régulation à la hausse de SLC7A11 qui en résulte, protège les cellules cancéreuses contre les dommages oxydatifs qui peuvent en résulter. de la surproduction de ROS [106]. L'ARNm de l'ATF4 est une autre cible NMD fréquemment régulée à la hausse dans plusieurs types de tumeurs solides, ce qui correspond à l'inhibition de la NMD dans ces conditions [190, 191]. La privation de nutriments et le stress oxydatif favorisent l'expression de l'ATF4 pour induire la transcription des gènes impliqués dans la synthèse et le transport des acides aminés, le repliement des protéines, la différenciation cellulaire et l'autophagie, afin de contrebalancer le stress. Fait intéressant, il a été rapporté que l'inhibition moléculaire/pharmacologique simultanée de l'autophagie et de la NMD entraîne une mort cellulaire synergique dans les lignées cellulaires CRC, suggérant que l'autophagie est une réponse adaptative à l'inhibition de la NMD qui permet aux cellules cancéreuses de dépasser le stress métabolique [192]. De plus, l'activité ATF4 a été impliquée dans la chimio-résistance des cellules CRC [190], soulignant en outre que la NMD arrêtée par le microenvironnement tumoral peut favoriser les cascades de signalisation qui potentialisent la prolifération tumorale et la malignité. Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que l'altération de la NMD est une conséquence et fait partie des mécanismes d'adaptation utilisés par les cellules cancéreuses pour se développer dans le microenvironnement nocif de la tumeur.


La découverte de la surface cellulaire pourrait conduire à une percée majeure dans le traitement du cancer

Université de Virginie Ecole de Médecine les chercheurs ont découvert une nouvelle stratégie pour attaquer les cellules cancéreuses qui pourrait fondamentalement modifier la façon dont les médecins traitent et préviennent la maladie mortelle. En ciblant plus sélectivement les cellules cancéreuses, cette méthode offre une stratégie pour réduire la durée et le bilan physique associés aux traitements actuels.

"Nous pensons que nous avons un moyen non seulement de cibler plus spécifiquement les cellules cancéreuses, mais un moyen qui pourrait devenir un traitement de première ligne pour les femmes atteintes de cancers de nombreux types et qui souhaitent préserver la fertilité", a déclaré le chercheur en reproduction John Herr de U.Va. 's Département de biologie cellulaire.

Une connexion inattendue contre le cancer

Herr et son partenaire de recherche, Département d'obstétrique et de gynécologie Le biologiste Eusebio Pires, tous deux spécialisés dans les cellules germinales, les cellules reproductrices qui composent le sperme et les ovules. En recherchant de nouvelles méthodes de contraception, Pires et Herr ont découvert un lien surprenant entre le développement d'ovules et de tumeurs. Ce lien peut permettre aux médecins d'utiliser des anticorps pour administrer des médicaments directement aux tumeurs tout en épargnant les tissus sains.

À l'époque, Herr et Pires étudiaient une protéine appelée SAS1B qui se trouve généralement uniquement à la surface des ovules en développement et matures.

"À l'exception du petit groupe d'œufs en croissance dans l'ovaire, la protéine SAS1B est pratiquement absente dans les autres tissus du corps", a déclaré Pires. « Donc, SAS1B a les caractéristiques prometteuses d'une cible contraceptive candidate. »

La restriction de SAS1B aux œufs en croissance suggère des stratégies pour développer des contraceptifs féminins améliorés qui ciblent sélectivement uniquement le pool d'œufs en croissance, réduisant potentiellement les effets secondaires indésirables des contraceptifs stéroïdiens actuels.

Bien que l'équipe se soit initialement concentrée sur SAS1B en raison de son utilisation possible dans la contraception, une seule donnée dans la base de données GenBank des National Cancer Institutes, montrant l'expression de SAS1B dans un cancer de l'utérus, a conduit leur équipe à commencer une recherche à la surface. de divers types de cancer. Jusqu'à présent, ils ont trouvé SAS1B exprimé dans les cancers du sein, du mélanome, de l'utérus, du rein, de l'ovaire, de la tête et du cou et du pancréas. Il existe également des preuves suggérant qu'il apparaît dans les cancers de la vessie.

« La recherche ouvre un nouveau champ d'investigation, appelé néo-antigènes des ovocytes cancéreux, et révèle un aspect fondamental du cancer jusqu'alors peu connu : de nombreux types de cancer, lorsqu'ils dérèglent ou tournent mal, reviennent en arrière et prennent les caractéristiques de l'ovule, la cellule d'origine à partir de laquelle tous les tissus du corps dérivent », a déclaré Herr.

Lui et Pires ont trouvé un moyen d'exploiter cette idée fondamentale en développant une méthode d'administration de médicaments utilisant la protéine SAS1B comme cible.

De minuscules traqueurs de cancer : des anticorps armés de charges utiles de médicaments

Étant donné que la protéine SAS1B n'apparaît que sur les ovules et les cellules cancéreuses, la molécule peut servir de cible pour de minuscules sondes de suivi créées à l'aide d'anticorps monoclonaux. Les anticorps monoclonaux sont des anticorps hautement purs conçus pour se lier à une seule protéine cible avec une affinité uniforme. Les anticorps monoclonaux se fixent à toute cellule marquée avec les protéines SAS1B. Ensuite, les complexes anticorps monoclonaux-SAS1B peuvent fonctionner comme de minuscules injecteurs pour des médicaments ciblés.

"Vous ajoutez un anticorps ciblé SAS1B avec un médicament dessus, et dans les 15 minutes suivant le contact avec les cellules cancéreuses, l'anticorps se lie à la surface cellulaire et les complexes anticorps-SAS1B commencent le processus d'internalisation", a déclaré Herr.

Après environ une heure, les complexes anticorps-SAS1B atteignent les compartiments à l'intérieur de la cellule et libèrent leur charge utile de médicaments toxiques, déclenchant des changements conduisant à la mort cellulaire en quelques jours.

Ce type d'administration ciblée de médicaments pourrait signifier une réduction spectaculaire des effets secondaires difficiles du traitement traditionnel du cancer, tels que la perte de cheveux, les nausées, l'anémie et la neuropathie. Les femmes et les hommes peuvent utiliser le traitement, qui devrait limiter considérablement les effets secondaires indésirables sur les cellules normales saines. Pour les patientes atteintes de cancer en particulier, un médicament qui ne touche pas la réserve d'œufs au repos de leur corps pourrait être une énorme percée.

Préserver la fertilité

Alors que les anticorps monoclonaux devraient attaquer le pool d'ovules en croissance en plus des cellules cancéreuses SAS1B positives, l'approvisionnement des ovaires en ovules dormants resterait sain et non touché par le traitement. Cela signifie que l'ovulation normale pourrait recommencer une fois le traitement terminé et les ovocytes sont à nouveau recrutés pour développer et ovuler un processus qui devrait prendre environ 200 jours.

En plus de traiter le cancer, ces anticorps sélectifs pourraient également conduire à une nouvelle méthode de détection précoce et de prévention du cancer. Pires a expliqué que l'équipe de recherche développe un moyen de trouver de minuscules quantités de protéines SAS1B en libre circulation dans le corps.

"Cela pourrait être une découverte précieuse en termes de tests préalables pour identifier les patients qui ont des tumeurs produisant SAS1B", a-t-il déclaré.

Pires et Herr espèrent que les médecins pourront un jour utiliser les anticorps monoclonaux pour mesurer les niveaux de protéines SAS1B des patients dans le sang. Ceux qui ont des niveaux élevés de protéine seraient testés pour les premiers stades du cancer et recevraient un traitement plus tôt.

Alors qu'ils peaufinent cette méthode de détection précoce, Herr et Pires prévoient de commencer à tester leur traitement par anticorps qualifié dans des organismes modèles porteurs de tumeurs humaines dans les laboratoires d'U.Va. cet automne.

"Si tout se passe bien, dans moins d'un an, nous saurons si nous sommes prêts à proposer une étude à tester sur certaines populations humaines", a déclaré Pires.

Résultats publiés

Les résultats des chercheurs ont été publiés dans la revue scientifique Oncotarget dans un article écrit par Eusebio S. Pires, Ryan S. D'Souza, Marisa A. Needham, Austin K. Herr, Amir A. Jazaeri, Hui Li, Mark H. Stoler, Kiley L. Anderson-Knapp, Theodore Thomas, Arabinda Mandal, Alain Gougeon, Charles J. Flickinger, David E. Bruns, Brian A. Pollok et John C. Herr. L'article complet est intitulé « Membrane Associated Cancer-Oocyte Neoantigen SAS1B/Ovastacin est une cible immunothérapeutique candidate pour les tumeurs utérines ».

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH Fogarty International Center, du Grand Challenges Exploration Program de la Bill and Melinda Gates Foundation, de The Wallace H.Coulter Translational Research Partnership Endowment, The Paul Mellon Urologic Oncology Institute du Cancer Center de l'Université de Virginie, The Virginia Center for Innovative Technology avec le soutien de Neoantigenics, Inc., et The Virginia Biosciences Health Research Corporation.


Est-il possible de fabriquer une cellule cancéreuse qui ne code aucun néo-antigène ? - La biologie

La biologie synthétique jouera un rôle important dans l'avancement de la thérapie adoptive des cellules T.

Les récepteurs modifiés et les circuits génétiques peuvent rendre les thérapies cellulaires plus sûres et plus puissantes.

L'ingénierie cellulaire et l'édition du génome peuvent encore améliorer la cellule T en tant que châssis pour la thérapie.

Le transfert adoptif de cellules T génétiquement modifiées avec des récepteurs ciblant le cancer s'est révélé extrêmement prometteur pour l'éradication des tumeurs dans les essais cliniques. Cette forme d'immunothérapie cellulaire présente une opportunité unique d'incorporer des systèmes avancés et des approches de biologie synthétique pour créer des thérapies contre le cancer avec de nouvelles fonctions. Nous passons d'abord en revue le développement de récepteurs synthétiques, de commutateurs et de circuits pour contrôler l'emplacement, la durée et la force de l'activité des cellules T contre les tumeurs. En outre, nous discutons de l'ingénierie cellulaire et de l'édition du génome des cellules hôtes (ou du châssis) pour améliorer l'efficacité des thérapies contre le cancer à base de cellules et pour réduire le temps et le coût de fabrication.


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Technologies de base

Les mutations s'accumulent dans les cellules en raison d'agressions environnementales telles que la lumière UV et la fumée de cigarette et d'erreurs sporadiques de réplication de l'ADN qui se produisent pendant la prolifération cellulaire normale. Les mutations qui confèrent la capacité de proliférer sans être contrôlée par les systèmes de régulation normaux du corps sont souvent appelées mutations motrices. Les cellules avec de telles mutations motrices peuvent devenir abondantes dans la population tumorale. Chaque fois que ces cellules se divisent, il est possible que des mutations supplémentaires se produisent en raison d'erreurs de copie de l'ADN. Ainsi, en plus des mutations motrices, les cellules tumorales accumulent souvent des dommages aléatoires à de nombreuses autres parties du génome, y compris celles qui n'accélèrent pas la croissance du cancer.

Le paysage mutationnel d'une tumeur est composé à la fois de mutations du conducteur et du passager, qui peuvent être identifiées à l'aide d'un séquençage de nouvelle génération à haut débit. L'étude du nombre de chacun, de leur abondance dans la population et des mutations qui semblent avoir évolué ensemble peut révéler des informations clés sur la pression sélective sous laquelle la tumeur est soumise (en raison de la compétition pour des ressources limitées comme les nutriments et l'oxygène, la lutte pour maintenir les processus cellulaires essentiels malgré une croissance rapide, ou d'être attaqué par le système immunitaire) et peut nous aider à choisir des combinaisons de thérapies précises pour cibler les faiblesses génétiques et immunogènes de la tumeur.

Notre pipeline actuel d'appels de mutations implémente quatre appelants de mutations somatiques (MuTect, Strelka, Somatic Sniper et VarScan) pour augmenter la confiance des appels. Les mutations à faible confiance, telles que les variantes à faible couverture, les régions de faible cartographie (source : encodeproject.org/annotations/ENCSR636HFF/) et les loci de séquences d'ADN avec des répétitions et une faible complexité (source : www.repeatmasker.org) sont filtrés automatiquement et les mutations sélectionnées sont examinées manuellement pour l'assurance qualité.

Nous utilisons le séquençage de l'exome entier, le séquençage du génome entier et le séquençage ciblé des gènes pour identifier les facteurs génomiques affectant l'activité immunitaire antitumorale. En bref, notre pipeline affiné cartographie la séquence brute et lit le génome humain de référence (GRCh37/hg19), les positions des insertions, des suppressions et des variations de nucléotides sont annotées et les artefacts de la préparation de la bibliothèque sont supprimés.

Personnel: Nadeem Riaz, Nils Weinhold, Rajarsi Mandal, Jonathan Havel, Luc Morris

Clonalité

Nous sommes intéressés à comprendre la composition clonale des tumeurs. Un clone est défini comme un groupe de cellules partageant les mêmes mutations, probablement en raison d'une lignée partagée. Lorsqu'une tumeur contient de nombreuses lignées de ce type, elle est appelée «sous-clonale» et ces sous-clones distincts peuvent accumuler de nouvelles mutations qui offrent des avantages de croissance, leur permettant de devenir des sous-clones moins compétitifs. Au fil du temps, les sous-clones les plus compétitifs constituent une proportion globale plus élevée de la tumeur.

Tous les sous-clones d'une tumeur ne répondent pas nécessairement de la même manière à l'immunothérapie. Certains sous-clones peuvent porter des mutations qui provoquent une réponse immunitaire plus forte que d'autres. Par conséquent, il est important de comprendre la composition clonale des tumeurs afin de concevoir des stratégies qui ciblent suffisamment la tumeur pour perturber sa croissance à un niveau cliniquement mesurable.

Nous estimons la fréquence relative des cellules au sein d'une tumeur qui portent une mutation sur la base des données de séquençage du génome. Pour chaque mutation, nous calculons la fraction de cellules cancéreuses (CCF) en fonction de la fréquence des allèles variants de la mutation, de son nombre de copies, ainsi que de la pureté de l'échantillon. L'analyse du CCF peut nous aider à identifier des sous-clones de cellules qui se développent indépendamment au cours de la durée de vie d'une tumeur, et à déduire la relation entre l'aptitude de ces sous-clones par rapport aux autres, ainsi que leur sensibilité au ciblage immunitaire.

Dans une population de cellules tumorales, des mutations particulières (cercles colorés) sont souvent trouvées dans des sous-ensembles de cellules. Toute cellule tumorale donnée contient certaines mais pas toutes les mutations observées dans la population dans son ensemble. L'efficacité d'une immunothérapie qui renforce la réponse des lymphocytes T à une protéine tumorale mutée particulière peut être fortement influencée par la proportion de la population de cellules tumorales qui exprime cette protéine mutante. (Sommet) L'immunothérapie #1 améliore la réponse des lymphocytes T à la protéine mutante A (rose), qui se produit dans 50 % des cellules tumorales. Ainsi, lorsque l'immunothérapie #1 permet à ces cellules T de s'activer et de tuer leurs cibles, la mutation A est éliminée de la tumeur, mais les 50 % restants des cellules tumorales restent. (Bas) L'immunothérapie n° 2 améliore la réponse des lymphocytes T à la protéine mutante B (violet), qui se produit dans 75 % des cellules tumorales, de sorte que le traitement entraîne la persistance de seulement 25 % des cellules tumorales (celles sans mutation B). En mesurant l'abondance des mutations dans une population de cellules tumorales au fil du temps, y compris pendant la thérapie, nous pouvons apprendre comment les mutations sont liées. Par exemple, lorsqu'une mutation disparaît ou devient plus courante, quelles autres mutations l'accompagnent ? Nous pouvons également déterminer comment les immunothérapies agissent sur la réponse immunitaire. Certaines thérapies ne font-elles que renforcer les réponses des lymphocytes T à un petit nombre d'antigènes, tandis que d'autres soutiennent une stimulation plus large des lymphocytes T ? Ensemble, ces informations sur la cible tumorale et la nature de la réponse immunitaire stimulée peuvent être utilisées pour concevoir plus précisément une thérapie pour chaque patient.

Prédiction néo-antigène

Un obstacle majeur au développement d'une réponse immunitaire forte et efficace à une tumeur en croissance est le fait que les cellules tumorales sont très similaires aux tissus sains. Les antigènes qui apparaissent dans les cellules tumorales en raison de mutations (néo-antigènes) permettent au système immunitaire de reconnaître ces cellules tumorales comme non-soi et peuvent ainsi déclencher une réponse immunitaire spécifique à la tumeur. On pense que le nombre de néo-antigènes présents dans une tumeur est un facteur crucial déterminant si une immunothérapie réussira à organiser une réponse immunitaire antitumorale efficace.

Nous développons activement de nouvelles approches informatiques pour identifier les néo-antigènes dans les cancers humains. Notre méthode actuelle utilise le même pipeline d'appel de mutation somatique que celui décrit ci-dessus (voir Séquençage génomique), suivi d'une analyse néo-épitopique.

Notre algorithme de prédiction des néo-épitopes traduit toutes les mutations faux-sens identifiées par le pipeline de mutations génomiques, génère tous les peptides à 9 acides aminés (la longueur de peptide la plus fréquemment présentée) qui contiendraient la mutation, et utilise l'outil netMHC pour comparer le taux prédit de présentation du peptide muté à celle du peptide à 9 acides aminés avec l'acide aminé non muté (de type sauvage) à la même position par les allèles HLA particuliers de ce patient. Les peptides pour lesquels la version mutée est plus fortement présentée que le type sauvage sont considérés comme des néo-antigènes potentiels.

Personnel: Nadeem Riaz, Vladimir Makarov, Diego Chowell

Pour mieux comprendre l'interaction spécifique entre les mutations d'un patient et le système immunitaire, les peptides mutants sont systématiquement testés pour l'immunogénicité - la capacité d'activer les cellules T prélevées sur le même patient. Les résultats de ce type de dépistage d'antigènes peuvent aider à la création d'immunothérapies plus personnalisées, telles que des vaccins spécifiques à une tumeur ou des thérapies adoptives par cellules T. En outre, IPOP cherche à comprendre les contributions relatives de différents types de mutations et d'antigènes aux réponses immunitaires efficaces dans le but de rendre les thérapies spécifiques au patient plus précises.

Afin de maximiser l'efficacité du criblage, des plasmides codant pour plusieurs minigènes en tandem (TMG) sont générés. Un seul minigène est constitué de l'ADN codant pour une mutation somatique flanquée des deux côtés par douze acides aminés de la protéine source de type sauvage. Jusqu'à dix minigènes sont enchaînés pour générer les TMG utilisés dans le criblage. L'ARNm transcrit in vitro est ensuite introduit dans des cellules dendritiques autologues (CD) par électroporation pour permettre le traitement et la présentation HLA des peptides contenant la mutation somatique. Les cellules T dérivées du patient sont co-cultivées avec des DC transfectées par TMG. L'activation des cellules T induite par le peptide néo-antigène est quantifiée via la détection de la production de cytokines (par exemple, l'interféron gamma) à l'aide du test ELISpot hautement sensible. Les résultats sont déconvolués en rétromutant (en type sauvage) chacune des dix mutations contenues dans un TMG réactif et en testant chacune pour la production de cytokines dans le test de co-culture décrit ci-dessus. La coloration intracellulaire des cytokines est utilisée pour la validation orthogonale de tout résultat positif à partir d'un criblage d'antigène minigène.

Personnel: Raghu Srivastava, Jonathan Havel, Wei Wu

Les cellules immunitaires adaptatives - lymphocytes T et lymphocytes B - nous aident à reconnaître des menaces spécifiques, telles que les agents pathogènes microbiens (par exemple, les bactéries, les virus, les champignons) et les tumeurs. Chaque cellule T ou cellule B exprime un récepteur à sa surface - le récepteur des cellules T (TCR) ou le récepteur des cellules B (BCR), respectivement - qui peut se lier à une cible moléculaire particulière et diffère d'une cellule immunitaire à l'autre. Lorsqu'un TCR ou BCR trouve sa molécule cible, appelée antigène, la cellule T ou B reçoit un signal pour se diviser et se multiplier. Chaque récepteur est unique, généré par recombinaison aléatoire et altération de l'ADN au cours du développement en une cellule T ou B mature, et le nombre de TCR différents pouvant être générés par une personne est énorme : entre 10 12 et 10 20 au cours d'une à vie, avec

10 9 présent dans le répertoire à un moment donné. C'est la grande diversité de ces récepteurs qui permet à toute personne de répondre à des antigènes que son système immunitaire n'a jamais rencontrés auparavant, et de lever une « armée » contre un antigène particulier s'il représente une menace.

Expansion des cellules T spécifiques de la tumeur. A. Lorsque le TCR d'une cellule T se lie fortement à un antigène cible, la cellule T s'active et prolifère. Ainsi, ce TCR est représenté à une fréquence élargie dans la population. B. Dans le contexte d'une tumeur, une cellule T dont le TCR reconnaît un antigène spécifique de la tumeur peut être représentée en plus grande abondance par le même mécanisme. Avec l'immunogénomique, nous pouvons en apprendre davantage sur les tumeurs et les cellules T qui les reconnaissent en parallèle : combien y a-t-il de TCR ? Qu'est-ce qu'ils ont en commun? Les patients atteints de la même tumeur partagent-ils les mêmes TCR étendus ? Comment les proportions de ces TCR reflètent-elles et prédisent-elles les changements dans l'abondance des cibles antigéniques tumorales ?

Beaucoup de ces cellules immunitaires ne circulent pas librement dans le sang, mais s'infiltrent et assurent une surveillance dans les tissus. Cette population de lymphocytes infiltrant les tissus (TIL) diffère de la population circulante en ce que la première ne représente qu'un petit échantillon du répertoire total. Les lymphocytes T surveillant un tissu particulier peuvent être sélectionnés - sur la base de leurs récepteurs ainsi que de facteurs de croissance et d'autres molécules de signalisation - pour résider dans cet organe ou tissu particulier.

Les bibliothèques TCRseq représentent un échantillon des répertoires cellulaires du sang périphérique et des lymphocytes infiltrant la tumeur (TIL). Alors que certains TCR se produisent au même taux dans les deux populations (rose), certains TCR sont relativement plus abondants dans les TIL que dans le sang périphérique (vert, violet), tandis que d'autres sont beaucoup plus abondants, au point qu'ils ne sont pas t détecté (cyan). Les TCR les plus enrichis dans le tissu tumoral peuvent y résider de manière disproportionnée car leurs TCR se lient à des antigènes présents uniquement dans le tissu tumoral, ce qui rend ces séquences intéressantes pour une étude plus approfondie, en tant que biomarqueurs possibles de la progression tumorale ou en tant que modèles ou cibles thérapeutiques ( voir ci-dessous).

Les progrès récents dans le séquençage à haut débit de nouvelle génération nous permettent de capturer les TCR d'un échantillon entier (TCRseq) - cellules sanguines circulantes ou tissu infiltré de cellules T - et de décrire la population en termes de distribution de ces TCR. À l'aide de statistiques, nous analysons la diversité de ces populations, les comparons les unes aux autres et recherchons des tendances parmi les groupes de patients traités pour un cancer. En quoi le répertoire du TCR à l'intérieur d'une tumeur diffère-t-il de celui du sang circulant ?

Nous définissons actuellement des propriétés qui indiquent une réactivité spécifique à la tumeur : à quoi ressemble la réponse des cellules T antitumorales lorsqu'elle fonctionne ? Quand c'est défaillant ? Quand il a été restauré par immunothérapie ? Ces propriétés peuvent être utiles en tant que biomarqueurs multidimensionnels pour surveiller la progression tumorale et la réponse thérapeutique. Nous utilisons également le séquençage du répertoire TCR pour identifier des récepteurs qui pourraient être adaptés pour une utilisation en tant que thérapie antitumorale.

Des séquences de TCR particulières associées à la progression ou à la régression d'une tumeur pourraient être utilisées directement pour développer des thérapeutiques. (Sommet) Les TCR des cellules T cytolytiques (CTL) dont l'expansion est concomitante à la régression du cancer pourraient être testés en tant que modèles pour les cellules T du récepteur d'antigène chimérique (CAR) modifiées, qui seraient capables de reconnaître et d'attaquer la tumeur à l'aide d'un récepteur basé sur ce TCR. (Bas) Les cellules T régulatrices (Tregs) qui inhibent l'activité des CTL antitumoraux actifs (protégeant ainsi la tumeur) pourraient être bloquées par des immunothérapies ciblant leurs TCR.

TCRseq @ MSK

Nous effectuons le séquençage TCR d'échantillons cliniques sur site en collaboration avec l'Opération de génomique intégrée, fournissons une analyse des données de séquençage brutes (le cas échéant), ainsi qu'une analyse prise en charge par l'utilisateur final (en cours de développement). IPOP prend actuellement en charge les plates-formes commerciales de génération de bibliothèques TCR suivantes :

  • Profil iR (TCRa et TCRb) — iRepertoire
  • SMARTer Human TCR a/b Profiling (TCRa et TCRb) — Clontech
  • ImmunoSEQ (TCRb uniquement) — Biotechnologies adaptatives

Nous testons et intégrons activement de nouveaux produits et plateformes, et développons des outils analytiques liés à l'immunothérapie en collaboration avec cBioPortal.

Personnel: Jennifer Sims, Jonathan Havel

L'un des objectifs de l'IPOP est d'extraire les informations immunogénomiques qui permettront aux médecins d'anticiper quels patients sont les plus susceptibles de répondre à l'immunothérapie. Nous étudions le phénotype tumoral, ou comportement cellulaire, qui est largement déterminé par les niveaux d'expression de chaque gène. En particulier, nous utilisons le séquençage à haut débit d'ARN à partir de biopsies tumorales pour étudier comment l'expression des gènes change à mesure que le cancer progresse, quand le traitement est administré et quand le traitement est efficace. La comparaison des tumeurs des patients qui répondent avec celles des patients qui ne le font pas nous permet d'identifier des ensembles distincts de caractéristiques tumorales qui peuvent être traduits en biomarqueurs diagnostiques, pronostiques et thérapeutiques à utiliser pour les futurs patients.

Les niveaux d'expression des gènes renseignent également sur l'environnement dans lequel évolue la tumeur, notamment sur la manière dont le système immunitaire du patient y réagit. En utilisant des techniques informatiques de pointe, nous pouvons intégrer ces informations pour comprendre quels types de cellules immunitaires réussissent dans ce processus.

Expression différentielle

Les tumeurs diffèrent les unes des autres, en partie parce que le système immunitaire de chaque patient réagit à une tumeur en utilisant un ensemble unique de cellules pour tenter de la détruire. Le comportement anormal des cellules tumorales, l'activité immunitaire antitumorale spécifique, l'activité immunitaire inflammatoire non spécifique et les lésions tissulaires façonnent les profils d'expression génique des cellules tumorales et non tumorales de manière unique.

L'ARN du tissu tumoral est soumis à un séquençage de nouvelle génération à haut débit, qui donne en sortie de courtes « lectures » de nucléotides. Ces lectures sont ordonnées et alignées sur le génome humain, donnant la quantité d'ARN de chaque gène. Pour chaque gène, nous pouvons ensuite tester statistiquement une expression différentiellement plus élevée ou plus faible entre deux groupes d'échantillons (par exemple, les tumeurs des patients sensibles au traitement et des patients non sensibles). Nous pouvons ensuite identifier des gènes exprimés de manière différentielle, ou des groupes de gènes fonctionnellement apparentés, qui reflètent différents programmes de gènes exprimés ou différentes compositions cellulaires entre les tumeurs.

Une application des analyses d'expression génique différentielle consiste à comparer les profils avant et après traitement des tumeurs qui ont répondu à l'immunothérapie avec celles qui n'y ont pas répondu. Nous pouvons également identifier des gènes marqueurs ou des groupes de gènes fonctionnellement apparentés qui, s'ils sont anormalement élevés ou faibles avant le traitement, correspondent à de meilleures réponses à des thérapies particulières. De telles signatures prédictives pourraient permettre une simple biopsie de pré-traitement pour aider à adapter le schéma thérapeutique d'un patient.

Chez IPOP, notre pipeline d'automatisation et de visualisation de ces analyses s'améliore constamment. Les outils de visualisation de données de grande dimension tels que les oncoprints et les cartes Visne nous permettent d'organiser et de restituer des dizaines de paramètres (par exemple, les données d'expression génique RNASeq en parallèle avec les paramètres cliniques) simultanément, sans sacrifier leur complexité, pour enrichir notre compréhension de l'environnement immunitaire du cancer .

Dans une étude récente, le regroupement hiérarchique de l'expression des gènes à travers les biopsies tumorales de patients qui étaient fortement réactifs (+++), faiblement réactifs (+) ou non réactifs (-) à la thérapie anti-PD-1 a identifié deux sous-ensembles de gènes, dont l'un était fortement exprimé chez les patients cliniquement sensibles, et l'un d'entre eux était fortement exprimé chez les patients non-répondants. L'enrichissement de gènes fonctionnellement liés dans ces groupes peut être utilisé pour déduire comment une telle signature génique est liée à ces niveaux de réponse immunitaire.

Composition cellulaire (déconvolution in silico)

De nombreux types de cellules immunitaires infiltrent les tissus, où elles jouent différents rôles dans la surveillance des tumeurs, des blessures ou des infections. Par exemple, certains types de cellules T sont capables de tuer directement les cellules dysfonctionnelles, tumorigènes ou infectées, tandis que les monocytes et les macrophages absorbent les débris cellulaires flottants et présentent ces antigènes potentiels aux cellules T.Cette interaction, qui nécessite à la fois des cellules T et des cellules présentatrices d'antigènes, peut aider à activer ou supprimer localement toutes les cellules T qui reconnaissent les mêmes antigènes. Pendant ce temps, les cellules B produisent des anticorps qui peuvent se propager rapidement dans tout le corps pour neutraliser une menace particulière. Ainsi, l'abondance relative des différents types cellulaires peut indiquer quels modes de reconnaissance tumorale sont actifs et lesquels peuvent être supprimés.

Le type et le degré d'infiltration immunitaire dans les tumeurs jouent un rôle important dans l'efficacité de l'immunothérapie. L'abondance de l'ARN messager (ARNm) de gènes particuliers dans une biopsie tissulaire nous permet non seulement d'identifier le gène d'expression différentielle entre les échantillons, mais nous permet également de calculer l'abondance relative de différents types de cellules immunitaires dans le microenvironnement local. En bref, à partir de l'ARNm de l'échantillon global, nous pouvons détecter une expression élevée de gènes de signature ou l'enrichissement d'un sous-ensemble de gènes spécifiques à un type cellulaire, et le comparer à l'expression de gènes spécifiques à d'autres types cellulaires. Nous utilisons des algorithmes de calcul tels que Supporter Vector Machines (SVM) ou Single-Sample Gene Set Enrichment (ssGSEA) pour traduire l'expression de ces signatures en abondances relatives des populations de cellules immunitaires correspondantes.

Parce que les immunothérapies remplissent différentes fonctions - telles que le maintien de l'activation des cellules immunitaires, le sauvetage des cellules immunitaires activées puis épuisées ou la stimulation de la réactivité antitumorale parmi les cellules immunitaires qui n'étaient auparavant pas exposées aux antigènes tumoraux - comprendre quels types de cellules immunitaires sont présents (ou non) dans le microenvironnement tumoral a des implications pour prédire la réponse à ces immunothérapies et choisir la bonne pour chaque patient.

À partir d'un échantillon de tumeur en vrac, les molécules d'ARNm sont extraites du mélange de cellules immunitaires (colorées et grises) et de cellules non immunitaires (brunes, telles que les tumeurs). L'exécution d'un séquençage de nouvelle génération à haut débit sur le mélange d'ARNm fournit le profil d'expression génique de l'échantillon de biopsie (à gauche). En utilisant des signatures d'expression génique connues, la proportion de molécules d'ARNm représentant chaque population immunitaire infiltrée peut être déconvoluée (en bas) et la composition (abondance relative) des types de cellules immunitaires dans la population peut être déduite (à droite).

Personnel: Fengshen Kuo, Alexis Desrichard

Les cellules T reconnaissent les menaces microbiennes et le cancer en se liant à des fragments dégradés de protéines étrangères (peptides) que leur présentent les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH). Ces molécules de présentation sont exprimées à la surface de la plupart des types cellulaires, mais surtout fortement sur certaines cellules immunitaires qui assurent la surveillance des tissus.

Les gènes qui codent les protéines du CMH de classe I (appelés gènes HLA de classe I chez l'homme) sont situés sur le chromosome 6, et il y en a trois : HLA-A, HLA-B et HLA-C. Chaque personne a deux copies (allèles) de chaque gène (une de chaque parent), et puisque ces gènes sont les plus polymorphes (variables dans la séquence d'ADN) dans l'ensemble du génome humain, les six allèles de chaque personne sont souvent tous différents, et ils correspondent rarement à ceux d'individus génétiquement non apparentés. Il existe des allèles spécifiques (par exemple HLA-A*02:01) qui sont plus répandus dans le monde. De plus, la fréquence des allèles HLA varie selon les régions géographiques et les populations.

Fréquence de certains allèles HLA-A dans différentes régions géographiques. Les fréquences normalisées de certains allèles HLA-A dans diverses régions géographiques sont indiquées. Pour chaque allèle HLA-A, chaque barre colorée représente la fréquence de l'allèle dans une région géographique particulière. Les données ont été obtenues à partir de http://www.allelefrequencies.net/.

Nous examinons comment les allèles HLA utilisés par un patient affectent la réactivité à l'immunothérapie. La présentation des peptides aux cellules T par les protéines du CMH joue un rôle essentiel dans la réponse immunitaire adaptative et influence fortement la façon dont les cellules T répondent à ce peptide. Par exemple, certaines molécules du CMH activent fortement les cellules T, ce qui est souhaitable si cet antigène représente une menace (comme une infection virale ou une protéine dysfonctionnelle ou mutée produite par une tumeur) mais peut être dangereux si l'antigène est normal et apparaît sur des sujets sains. cellules. Étant donné que la potentialisation de la reconnaissance correcte des peptides du soi par rapport au non-soi par les cellules T est une fonction majeure des CMH, et cette distinction devient confuse dans le cas du cancer, il est important d'utiliser les données de séquençage génomique pour identifier les six allèles HLA d'un patient. en essayant de déterminer comment son système immunitaire réagira à leurs peptides tumoraux mutés.

Actuellement, l'étalon-or pour identifier les allèles HLA d'un patient est le typage par PCR, dans lequel le locus HLA est spécifiquement amplifié puis séquencé. Le séquençage génomique ayant atteint une couverture de plus en plus élevée, le génotypage HLA in silico offre une alternative efficace et économique lorsque le génome d'un patient est déjà en cours de séquençage. Les outils logiciels actuels offrent une résolution précise jusqu'à 99 % pour la plupart des applications cliniques. Pour les applications cliniques qui nécessitent une plus grande précision, telles que la prédiction de la présentation de l'antigène tumoral par certains allèles HLA, qui diffèrent de leurs autres allèles les plus proches de quelques nucléotides seulement, nous affinons les pipelines de calcul pour l'identification HLA à l'aide d'approches d'ensemble, de pondération basée sur la population , et des assemblages alternatifs des génomes humains de référence.

Personnel: Diego Chowell, Vladimir Makarov, Fengshen Kuo

Comprendre la composition cellulaire des cellules tumorales et immunitaires au niveau des marqueurs protéiques phénotypiques est un élément essentiel de l'étude de l'immunologie tumorale. IPOP utilise plusieurs techniques expérimentales pour mieux quantifier l'expression de protéines d'intérêt dans les cellules tumorales et immunitaires individuelles. La cytométrie en flux basée sur les anticorps permet la quantification précise des protéines d'intérêt extracellulaires et intracellulaires. En utilisant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), les populations de cellules immunitaires ou tumorales individuelles peuvent être subdivisées pour une analyse en aval, y compris le séquençage de l'ADN et de l'ARN.

Parfois, les chercheurs peuvent souhaiter quantifier l'expression d'un grand nombre de protéines intracellulaires et extracellulaires simultanément à partir d'un seul échantillon. La cytométrie en flux conventionnelle limite le nombre de paramètres simultanés détectables en raison du chevauchement spectral généré par les fluorophores. Pour surmonter cette barrière, IPOP utilise la technologie de cytométrie de masse par temps de vol (CyTOF). CyTOF identifie les protéines intracellulaires et extracellulaires à l'aide d'anticorps conjugués à des métaux lourds de terres rares. Après coloration à base d'anticorps, l'échantillon est ionisé et la composition en anticorps des cellules individuelles est ensuite identifiée. Le principal avantage de CyTOF est sa capacité à analyser un panel robuste de cibles cellulaires défini par l'utilisateur simultanément à partir d'un seul échantillon en utilisant une approche basée sur les anticorps. Les données multiparamétriques peuvent ensuite être analysées à l'aide d'un logiciel de cytométrie en flux conventionnel ou de techniques plus sophistiquées, notamment les tracés SPADE ou ViSNE. Les projets IPOP CyTOF sont actuellement menés en collaboration avec le Mount Sinai Human Immune Monitoring CORE (HIMC) (212-824-9354, [email protected]).

Les lymphocytes infiltrant la tumeur et les cellules mononucléées du sang périphérique d'un patient atteint d'un carcinome épidermoïde de la tête et du cou ont été regroupés par leur coloration pour les marqueurs immunophénotypiques (les clusters représentent des cellules avec des phénotypes similaires, où la proximité sur le graphique indique une similitude), en utilisant le voisin stochastique distribué en t algorithme d'intégration (t-SNE). L'échelle de couleurs indique la protéine CD8 détectée, normalisée à travers les cellules, qui distingue les types cellulaires (clusters) exprimant ce marqueur de la lignée des lymphocytes T cytolytiques.