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6.6 : Introduction à la surface cellulaire - Biologie

6.6 : Introduction à la surface cellulaire - Biologie


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Démontrer une familiarité avec diverses spécialisations en surface cellulaire

Dans ce résultat, nous en apprendrons davantage sur la surface cellulaire, y compris la membrane cellulaire, les jonctions cellulaires et la paroi cellulaire.

Ce que vous apprendrez à faire

  • Expliquer la structure et la fonction des membranes cellulaires
  • Décrire les jonctions cellulaires trouvées dans les cellules végétales (plasmodesmes) et les cellules animales (jonctions serrées, desmosomes, jonctions lacunaires)
  • Décrire la structure et la fonction de la paroi cellulaire

Activités d'apprentissage

Les activités d'apprentissage de cette section sont les suivantes :

  • Membranes cellulaires
  • Jonctions cellulaires
  • La paroi cellulaire
  • Autocontrôle : Surface de la cellule

Récepteur de surface cellulaire

Récepteurs de surface cellulaire (récepteurs membranaires, récepteurs transmembranaires) sont des récepteurs intégrés dans la membrane plasmique des cellules. Ils agissent dans la signalisation cellulaire en recevant (se liant à) des molécules extracellulaires. Ce sont des protéines membranaires intégrales spécialisées qui permettent la communication entre la cellule et l'espace extracellulaire. Les molécules extracellulaires peuvent être des hormones, des neurotransmetteurs, des cytokines, des facteurs de croissance, des molécules d'adhésion cellulaire ou des nutriments qui réagissent avec le récepteur pour induire des changements dans le métabolisme et l'activité d'une cellule. Dans le processus de transduction du signal, la liaison du ligand affecte un changement chimique en cascade à travers la membrane cellulaire.


Vecteurs viraux et non viraux pour les thérapies géniques in vivo et ex vivo

2.2.1 Nanoparticules magnétiques

L'un des pionniers utilisant la magnétofection pour des applications in vitro était Lin et al. 91 Il existe différents types de nanoparticules magnétiques cationiques qui ont la capacité de lier du matériel nucléotidique à leur surface. Avec cette méthode, les nanoparticules magnétiques sont concentrées dans les cellules cibles par l'influence d'un champ magnétique externe (CEM). Normalement, l'internalisation est accomplie par endocytose ou pinocytose, de sorte que l'architecture membranaire reste intacte. Ceci est un avantage par rapport aux autres méthodes de transfection physique. D'autres avantages sont la faible dose de vecteur nécessaire pour atteindre le rendement de saturation et le temps d'incubation court nécessaire pour atteindre une efficacité de transfection élevée. De plus, avec l'application d'un CEM, les cellules transfectées avec des nanoparticules magnétiques peuvent être utilisées pour cibler la région d'intérêt in vivo.

2.2.1.1 Nanoparticules d'oxyde de fer

Les nanoparticules magnétiques les plus utilisées en magnétofection sont les nanoparticules d'oxyde de fer (IONP). Les IONP sont biodégradables et non cytotoxiques et peuvent être facilement fonctionnalisés avec PEI, PEG ou PLL. Les nanoparticules d'oxyde de fer modifiées par la poly-l-lysine (IONP-PLL) sont de bons candidats comme vecteurs d'ADN et de microARN (miARN) car elles se lient et protègent les acides nucléiques et ont montré une efficacité de transfection élevée in vitro. De plus, ils sont hautement biocompatibles in vivo.

Chen et al. 92 ont utilisé l'ARNsi du facteur de croissance endothélial vasculaire humain lié à des nanoparticules d'oxyde de fer superparamagnétiques (SPION) et il était capable d'inhiber la croissance du carcinome hépatocellulaire chez la souris nude. De plus, Li et al. 93 ont démontré que l'injection intraveineuse d'IONP-PLL portant l'ADN plasmidique NM23-H1 (un gène suppresseur de tumeur) prolongeait de manière significative le temps de survie d'un modèle expérimental de souris présentant des métastases pulmonaires.

Un autre avantage de ce type de nanoparticules est qu'elles peuvent être utilisées comme agents IRM. Chen et al. 94 ARNsi lié aux SPION PEG-PEI ensemble à un fragment variable à chaîne unique CD44v6 associé au cancer gastrique. Cette liaison a permis à la fois la transfection des cellules cancéreuses et leur visualisation par IRM.

Mais ces complexes pourraient également être utilisés pour les thérapies cellulaires. Schade et al. 95 ont utilisé des nanoparticules magnétiques d'oxyde de fer (MNP) pour lier des miARN et transfecter des cellules souches mésenchymateuses humaines. Comme la liaison entre les MNP et le PEI a eu lieu via la conjugaison biotine-streptavidine, ces particules ne peuvent pas passer la barrière nucléaire, elles sont donc de bons candidats pour délivrer le miARN, car il exerce sa fonction dans le cytosol. Ils ont fonctionnalisé les nanoparticules de surface avec du PEI et ont pu obtenir une meilleure transfection que le PEI 72 h après la transfection. De plus, ils ont démontré que les polyplexes magnétiques fournissaient un meilleur effet à long terme, également lorsqu'ils étaient inclus à l'intérieur des cellules souches.


La neuropiline fonctionne comme un récepteur essentiel de la surface cellulaire

Les neuropilines (Nrps) sont une famille de récepteurs de surface cellulaire essentiels impliqués dans de multiples cascades de signalisation cellulaire fondamentales. Les membres de la famille Nrp ont des fonctions clés dans l'angiogenèse dépendante du VEGF et le guidage axonal dépendant de la sémaphorine, contrôlant la signalisation et l'interaction entre ces processus physiologiques fondamentaux. Plus récemment, la fonction Nrp a été trouvée dans diverses fonctions de signalisation et d'adhésion, soulignant leur rôle en tant que co-récepteurs pléiotropes. La fonction Nrp pathologique s'est avérée importante dans l'activation aberrante des voies canoniques et alternatives. Ici, nous passons en revue les principales informations récentes sur la fonction Nrp dans la santé et la maladie humaines.

Mots clés: VEGFR angiogenèse protéine de liaison à l'héparine neuropiline interaction protéine-protéine récepteur structure-fonction sémaphorine facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF).

© 2015 par la Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire, Inc.


Résultats

Conception et développement d'un système de ligand générique

Notre objectif était de concevoir un système nécessitant une manipulation minimale du récepteur, afin de préserver sa structure et ses interactions. De plus, nous avons cherché à créer un ligand exprimé en surface cellulaire qui engagerait des récepteurs avec une affinité comparable aux interactions physiologiques NTR-ligand et qui, lorsqu'il est lié au récepteur, préserverait la distance intermembranaire cellule-cellule.

Nous avons développé un ligand générique basé sur l'interaction entre le peptide Twin-Strep-tag (séquence WSHPQFEK GGGSGGGSGGSA WSHPQFEK ), qui possède deux motifs Strep-tag II, et Strep-Tactin, une variante de la streptavidine (décrit dans la figure 1) [26 –28].

(1) Chaque récepteur est construit avec une étiquette Twin-Strep à l'extrémité extracellulaire et exprimé dans des lignées cellulaires. (2) Le ligand générique est constitué de deux composants : une ancre de ligand exprimée en surface cellulaire avec SpyTag N-terminal et une protéine trivalente soluble Strep-Tactin-SpyCatcher. Le Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent est ajouté aux cellules exprimant l'ancre de ligand générique. Lorsque SpyCatcher et SpyTag interagissent, une liaison isopeptidique covalente spontanée se forme entre eux, créant le ligand générique complet. (3) Les trois sites de liaison de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent sont disponibles pour la ligature par le récepteur marqué Twin-Strep. Deux sites de liaison sont nécessaires pour l'engagement complet de Twin-Strep-tag.

Le NTR d'intérêt, exprimé sur une cellule « réceptrice », est génétiquement modifié pour ajouter le peptide Twin-Strep-tag à l'extrémité N extracellulaire, où il est accessible pour l'engagement par le ligand générique présenté sur une autre cellule « ligand » (Fig. 1). Ce ligand est composé de deux composants : une ancre de ligand de surface cellulaire et une protéine de fusion soluble qui forme spontanément une liaison covalente avec l'ancre. L'ancre de ligand comprend les parties transmembranaires et cytoplasmiques du CD80 de souris fusionnées à un peptide SpyTag N-terminal, formant la moitié de la paire de protéines fractionnées formant une liaison covalente SpyTag/SpyCatcher [11, 29, 30]. La protéine de fusion soluble comprend Strep-Tactin trivalent, qui a trois sites de liaison pour les motifs Strep-tag II, fusionnés à SpyCatcher (trivalent Strep-Tactin-SpyCatcher) [26, 27]. Lorsque Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent soluble est incubé avec des cellules exprimant l'ancre du ligand, SpyTag et SpyCatcher forment spontanément une liaison covalente. Cela donne un ligand de surface cellulaire capable de se lier à un récepteur marqué Twin-Strep (Fig 1).

Sur la base des structures disponibles de Strep-Tactin et SpyTag/SpyCatcher et des estimations des longueurs de linker, nous prédisons que le ligand générique complet aura une longueur extracellulaire similaire à 2-3 domaines de type immunoglobuline lorsqu'il est étendu (numéros d'accession de la banque de données de protéines [PDB] : 1KL3, 4MLI) [12, 31]. Ceci est comparable aux ligands NTR physiologiques (discutés par Dushek et ses collègues [1]).

Préparation de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent

Pour préparer les tétramères trivalents Strep-Tactin-SpyCatcher, nous avons utilisé une méthode précédemment utilisée pour générer des tétramères de streptavidine de valence définie [9, 32]. Cela utilise une sous-unité de streptavidine mutée qui a une activité de liaison à la biotine négligeable, appelée streptavidine «morte». La biotine et le Strep-tag II occupent la même poche superficielle de streptavidine, et nous avons donc supposé que la sous-unité morte de streptavidine est également incapable de se lier au Strep-tag II [33]. Les sous-unités Strep-Tactin ont été repliées à partir de corps d'inclusion bactériens avec des sous-unités de streptavidine morte fusionnées à son extrémité C à SpyCatcher (streptavidine morte-SpyCatcher) dans un rapport molaire de 3: 1 (Fig. S1).

La streptavidine morte-SpyCatcher contient une insertion polyaspartate permettant la purification du tétramère trivalent Strep-Tactin-SpyCatcher à partir d'autres configurations possibles en utilisant la chromatographie d'échange d'anions (S1 Fig).

Nous avons analysé un échantillon du premier pic élué, supposé être celui de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent, en utilisant SDS-PAGE. Lors de l'ébullition, le tétramère est réduit en monomères individuels de Strep-Tactin et de streptavidine morte-SpyCatcher, permettant la visualisation de la proportion relative des sous-unités (S1 Fig). À titre de comparaison, nous avons analysé un échantillon d'un pic ultérieur, que nous prévoyons contenir du Strep-Tactin monovalent (1 × Strep-Tactin, 3 × streptavidine mort-SpyCatcher) en fonction de l'ordre d'élution. Le rapport de Strep-Tactin aux sous-unités mortes de streptavidine-SpyCatcher était plus élevé que prévu (4,7:1 pour Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent) mais était cohérent avec un rapport de 3:1 par rapport au rapport de sous-unités de la protéine monovalente (S1 Fig ).

Pour confirmer que la protéine purifiée était le tétramère souhaité, nous avons utilisé un test d'extinction de fluorescence de la biotine-4-fluorescéine précédemment utilisé pour estimer le nombre de sites de liaison à la biotine par tétramère de streptavidine (S1 Fig) [32]. Lorsqu'elle est liée à Strep-Tactin, la fluorescence de la biotine-4-fluorescéine est éteinte. À mesure que la concentration de biotine-4-fluorescéine ajoutée au Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent augmente au-dessus de la saturation du site de liaison, il y a une quantité croissante de biotine-4-fluorescéine libre (non éteinte) en solution. Ceci est visualisé comme une forte augmentation de la fluorescence, le point d'inflexion indiquant la saturation. Le titrage de la biotine-4-fluorescéine a donné un nombre estimé de 4,2 sites de liaison par Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent (S1 Fig). Bien que supérieur à la valeur attendue de 3, il est trois fois le nombre de sites de liaison estimé calculé pour le pic de Strep-Tactine monovalent prédit (1,4). Nous supposons qu'il y a le même nombre de sites de liaison Strep-tag II disponibles par tétramère.

Caractérisation du ligand générique

Affinité entre Twin-Strep-tag et Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent.

Nous avons utilisé la résonance plasmonique de surface et une protéine de fusion Twin-Strep-tag–mTFP pour analyser la liaison Twin-Strep-tag au Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent à 37°C. Le K a été mesurée à 6,8 M (figure 2A). Ceci est comparable aux affinités rapportées pour les interactions physiologiques NTR-ligand que nous souhaitons reproduire [34-36].

(A) La liaison à l'équilibre représentative mesurée par résonance plasmonique de surface de Twin-Strep-tag-mTFP injecté sur Strep-Tactin-Spycatcher trivalent immobilisé à 37 ° C est indiquée. Le K (SEM) pour les données collectées (m = 11) est de 6,8 M (0,62 M), et la pente moyenne de Hill (SEM) est de 0,46 (0,03) à 2 s.f. (B) Une indication relative du niveau de ligand générique par cellule en fonction de la concentration trivalente Strep-Tactin-SpyCatcher ajoutée aux cellules. Les valeurs médianes d'intensité de fluorescence extraites des analyses de cytométrie en flux de cellules incubées avec ATTO 647 biotine sont présentées. (C) Les cellules d'ancrage du ligand CHO préincubées avec du Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent ou du tampon seul ont été incubées avec un titrage de biotine-4-fluorescéine dans un test d'extinction de fluorescence. Le point d'inflexion est utilisé pour calculer le nombre absolu moyen de ligands génériques par cellule. (D) La concentration saturante de biotine-4-fluorescéine a été extraite de C et convertie en nombre de ligands génériques par cellule. Ceci a été substitué comme maximum dans la courbe ajustée en (B) pour interpoler le nombre moyen de ligands génériques par cellule en fonction de la concentration trivalente Strep-Tactin-SpyCatcher ajoutée aux cellules. Les données numériques récapitulatives sont fournies dans les données S1. CHO, mTFP d'ovaire de hamster chinois, protéine fluorescente de sarcelle monomère SEM, erreur standard de la moyenne s.f., chiffres significatifs.

Caractérisation des conditions optimales pour l'ancrage du ligand : liaison trivalente Strep-Tactin-SpyCatcher.

Une lignée cellulaire d'ancrage de ligand stable à haute expression a été établie et maintenue sous sélection (S2 Fig). Les cellules CHO ont été utilisées pour éviter toute interaction confusionnelle récepteur-ligand qui pourrait se produire si les cellules récepteur et ligand étaient toutes deux humaines.

Nous avons exploré les conditions optimales pour le couplage covalent entre l'ancre de ligand présentée à la surface cellulaire et le Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent soluble. Conformément aux découvertes de Zakeri et de ses collègues, nous avons constaté que le couplage entre les cellules d'ancrage du ligand CHO et le Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent était le plus efficace dans le tampon à pH 5–6 (S2 Fig) [11]. La plus large gamme de densités de surface a été obtenue avec une incubation de 5 à 10 minutes de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent à une large gamme de concentrations (S2 Fig).

En utilisant le western blot sur des lysats cellulaires bouillis séparés par SDS-PAGE, nous avons visualisé l'ancre du ligand en sondant l'étiquette HA N-terminale (S2 Fig). L'ajout de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent aux cellules a conduit à une augmentation substantielle du poids moléculaire d'une proportion significative d'ancre de ligand compatible avec le couplage covalent à la protéine de fusion soluble. Le sondage avec un anticorps anti-streptavidine a confirmé cela (S2 Fig).

Une évolution dans le temps a montré qu'une proportion significative de ligand générique reste à la surface cellulaire pendant plusieurs heures après la reconstitution (S2 Fig). Les dosages de stimulation des récepteurs sont généralement conduits sur cette période afin que le ligand soit capable de fournir un stimulus puissant pendant cette durée.

Mesurer le nombre de ligands génériques par cellule

Une force majeure du système de ligand générique est que la dose de ligand peut être facilement modifiée en titrant la concentration de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent soluble ajouté aux cellules. Pour nous permettre de déterminer la densité de surface de ligand requise pour l'activation, nous avons développé une méthode pour mesurer le nombre de ligands génériques par cellule. Cette méthode utilise deux dosages. Le premier, dans lequel les cellules de ligand générique CHO sont incubées avec de la biotine ATTO 647, donne une indication de la façon dont le nombre relatif de sites de ligand générique varie avec la concentration de Strep-Tactin-SpyCatcher (figure 2B).

Le deuxième test mesure le nombre maximum moyen de ligands génériques par cellule dans une population de cellules saturées de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent. Cela utilise le même test d'extinction de fluorescence de la biotine-4-fluorescéine illustré dans la figure S1. En supposant une liaison complète, la concentration de biotine-4-fluorescéine qui sature les cellules est indiquée par le point d'inflexion du graphique (figure 2C). Cette concentration saturante pour un nombre connu de cellules dans un volume défini peut ensuite être convertie en un nombre moyen de ligands génériques par cellule (voir la section Mesurer le nombre de ligands génériques par cellule). En combinant le nombre absolu de ligands génériques par cellule à saturation (figure 2C) et les niveaux relatifs de ligands sur une plage de concentrations de Strep-Tactin-SpyCatcher trivalents solubles (figure 2B), le nombre moyen de ligands génériques par cellule pour un produit soluble donné la concentration trivalente Strep-Tactin-SpyCatcher peut être estimée (Fig 2D). Un maximum de 3 millions de ligands génériques par cellule peut être atteint de manière cohérente, et la dose de ligand peut donc facilement être modifiée sur plusieurs ordres de grandeur.

Les NTR activatrices représentatives peuvent être stimulées par un ligand générique

Des NTR humains activants représentatifs de diverses familles de récepteurs ont été génétiquement modifiés pour avoir une étiquette Twin-Strep N-terminale (figure 3A).

(A) Des représentations de dessins animés de quatre NTR représentatifs avec des balises Twin-Strep et des protéines adaptatrices sont présentées. Dans le cas du TCR 1G4, la chaîne a une étiquette Twin-Strep N-terminale. La région extracellulaire de chaque récepteur contient un ou plusieurs domaines de type immunoglobuline (voir la légende de la figure 1). Réponse des cellules SIRPβI (B), Siglec-14 (C) ou NKp30 (D) étiquetées Twin-Strep au ligand générique présenté sur des cellules CHO. La réponse des récepteurs est mesurée par la sécrétion d'IL-8. (E) Réponse des cellules Jurkat NFκB eGFP 1G4 TCRα/β-Twin-Strep-tag au ligand générique présenté sur des cellules CHO. Réponse du récepteur, indiquée par l'expression de l'eGFP sous le contrôle de la NF??Le promoteur B est indiqué en pourcentage de cellules positives pour l'eGFP au-dessus du bruit de fond. Les barres d'erreur indiquent la plage (m = 2), et les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. Au sein de chaque stimulation, un échantillon de cellules CHO a été prélevé et utilisé pour mesurer le nombre de ligands génériques par cellule comme dans (Fig 2). La densité de ligand a été calculée à partir de ces nombres en utilisant une surface cellulaire CHO estimée à 700 m 2 (voir la section Mesure du nombre de ligands génériques par cellule) [22, 23]. (F) CE50 les valeurs d'expériences individuelles de cellules THP-1 SIRPβI DAP12, THP-1 Siglec-14 DAP12, THP-1 NKp30 FcRγ ou Jurkat NFκB eGFP 1G4 TCRα/β répondant au ligand générique sont tracées. Les barres indiquent la moyenne et l'écart type (m = 3). Les données numériques récapitulatives sont fournies dans les données S1. CHO, ovaire de hamster chinois DAP12, protéine activatrice de DNAX de 12 kDa eGFP, protéine fluorescente verte améliorée IL-8, interleukine 8 NFκB, facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer des cellules B activées NK, tueur naturel NTR, non catalytique récepteur tyrosine-phosphorylé Siglec-14, lectine de type immunoglobuline liant l'acide sialique 14 SIRPβI, protéine régulatrice du signal βI TCR, récepteur des cellules T.

SIRPβI (CD172b) et Siglec-14 sont exprimés dans un certain nombre de leucocytes, dont les monocytes et les macrophages [37, 38]. Siglec-14 se lie à l'acide sialique présenté par de nombreuses bactéries pour induire des réponses incluant la sécrétion de cytokines [38]. Il existe des preuves que SIRPβI contribue à la migration transépithéliale des neutrophiles et à la phagocytose des macrophages, mais un ligand n'a pas encore été identifié [37]. Un ligand générique est donc très utile pour l'étude de SIRPβI. En tant que membre de la famille de cytotoxicité des cellules NK, NKp30 (CD337) est exprimé dans les cellules NK et se lie aux ligands pathogènes et cellulaires pour médier la cytotoxicité des cellules NK [39].

Les récepteurs SIRPβI, Siglec-14 et NKp30 s'associent chacun à des protéines adaptatrices qui contiennent des résidus de tyrosine phosphorylables cytoplasmiques qui médient la signalisation immunitaire [37-39]. Par conséquent, pour établir des lignées cellulaires stables, les cellules THP-1 ont été cotransduites avec des lentivirus codant pour le récepteur marqué et l'adaptateur approprié (S3 Fig).

Le complexe αβ TCR est constitué de chaînes et β de TCR associées à un homodimère de TCRζ et à des hétérodimères CD3δε et CD3γε. La chaîne α du TCR 1G4 et la chaîne marquée par Twin-Strep ont été transduites dans une lignée cellulaire rapporteur du facteur nucléaire Jurkat kappa-light-chain-enhancer de cellules B activées (NFκB) dans laquelle la production d'eGFP est sous le contrôle de la NFκB promoteur (S3 Fig) [14, 15]. Toutes les chaînes α et du TCR 1G4 exprimées à la surface cellulaire sont présumées être associées à des sous-unités de signalisation TCR/CD3 endogènes.

Les quatre récepteurs marqués ont été activés par des cellules ligands génériques avec une réponse dose-dépendante claire, qui augmentait avec le nombre de ligands génériques par cellule (Fig. 3B-3E). Cette réponse était spécifique, comme le montre l'absence de sécrétion d'IL-8 ou d'expression d'eGFP induite par NFκB dans les échantillons contenant des cellules réceptrices témoins négatives (Fig. 3B-3E). Le CE50 les valeurs des réponses des récepteurs de trois expériences indépendantes sont présentées sur la figure 3F. Ainsi, le ligand générique peut se lier à et déclencher plusieurs récepteurs différents portant une étiquette Twin-Strep N-terminale.

Le TCR marqué par Twin-Strep répond au ligand générique et au ligand natif avec une sensibilité similaire

Afin de valider cette approche, nous avons comparé la réponse du TCR au ligand générique avec sa réponse au ligand natif, pMHC.

1G4 TCR et son ligand apparenté NY-ESO-1157−165 Le variant peptidique 9V (SLLMWITQV) présenté en complexe avec HLA-A*02 est une paire récepteur-ligand bien caractérisée [40–42]. La constante de dissociation de la liaison du TCR 1G4 à 9V-HLA-A*02 (K = 6–7 M) est comparable au K nous avons mesuré Twin-Strep-tag et trivalent Strep-Tactin-SpyCatcher (Fig 2A) [41, 42].

Pour comparer la réponse du TCR à un ligand générique ou natif, la lignée cellulaire rapporteur Jurkat NFκB eGFP transduite avec 1G4 TCR α et des chaînes marquées par Twin-Strep (S3 Fig) a été présentée à des cellules CHO qui expriment à la fois HLA-A*02 dans la forme d'un SCD et l'ancre de ligand générique (Fig 4A, S3 Fig). Ces cellules CHO ont été soit préincubées avec du Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent, soit chargées avec le peptide 9V. Pour permettre une comparaison directe entre le ligand générique et pMHC, les cellules Jurkat NFκB eGFP n'ont pas été transduites avec le corécepteur CD8, car il se lie au CMH mais pas au ligand générique.

(A) Un dessin illustrant le TCR 1G4 avec une étiquette Twin-Strep N-terminale à chaîne présentée à 9V-HLA-A*02 ou à un ligand générique sur des cellules CHO. (B) Le nombre moyen de 9V-HLA-A*02 par cellule en fonction de la concentration de peptides ajoutés a été mesuré à l'aide de TCR fluorescent 1G4 haute affinité soluble et de billes de quantification de fluorescence. Les nombres interpolés de 9V-HLA-A*02 sont affichés. (C) Réponse de Jurkat NF??Cellules B eGFP 1G4 TCRα/β à un ligand générique ou 9V-HLA-A*02 présenté sur des cellules CHO. La réponse du récepteur, telle qu'indiquée par l'expression de l'eGFP sous le contrôle du promoteur NFκB, est montrée normalisée par rapport à la réponse maximale du récepteur à 9V-HLA-A*02 ou à un ligand générique. Les barres d'erreur indiquent la plage (m = 2), et les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. (DÉC50 les valeurs d'expériences individuelles de cellules Jurkat NFκB eGFP 1G4 TCRα/β répondant à 9V-HLA-A*02 ou à un ligand générique sont tracées. Les barres indiquent la moyenne et l'écart type (m = 3). Les données numériques récapitulatives sont fournies dans les données S1. AU, unités arbitraires CHO, eGFP d'ovaire de hamster chinois, protéine fluorescente verte améliorée NFκB, facteur nucléaire kappa-light-chain-enhancer des lymphocytes B activés TCR, récepteur des lymphocytes T.

Afin de comparer quantitativement la réponse du TCR au ligand générique ou au 9V-HLA-A*02, nous avons mesuré le nombre de molécules 9V-HLA-A*02 sur les cellules du ligand CHO. Pour cela, nous avons utilisé une forme soluble à affinité améliorée (c58/c61) du TCR 1G4 qui se lie à 9V-HLA-A*02 avec une affinité beaucoup plus élevée que le TCR de type sauvage (K = 71 pM) [25, 43]. Ce TCR de haute affinité 1G4 soluble a été marqué avec Alexa Fluor 647 (1G4hi TCR AF647) et utilisé en combinaison avec des billes de quantification de fluorescence pour interpoler le nombre moyen de 9V-HLA-A*02 par cellule (Fig 4B, S4 Fig). L'incubation de cellules HLA-A*02 d'ancrage de ligand CHO avec des concentrations variables de peptide 9V a donné une large plage dynamique de nombre de ligands par cellule (figure 4B). Par conséquent, nous avons pu présenter des cellules Jurkat NFκB eGFP 1G4 TCRα/β-Twin-Strep-tag avec des cellules HLA-A*02 d'ancrage de ligand CHO présentant soit 9V-HLA-A*02 soit un ligand générique à des densités similaires.

Jurkat NF??Les cellules B eGFP 1G4 TCRα/β-Twin-Strep-tag ont répondu à la fois au 9V-HLA-A*02 et au ligand générique d'une manière spécifique dépendante de la dose, visualisée à l'aide du rapporteur NFκB (Fig 4C). Le CE50 les valeurs de trois expériences indépendantes sont présentées sur la figure 4D. Il existe une différence de 2 fois dans la sensibilité moyenne entre la réponse du récepteur au 9V-HLA-A*02 par rapport au ligand générique.

Sur la base de la structure du 1G4 TCRα/β soluble lié au pMHC apparenté, nous prédisons que la présence de Twin-Strep-tag ne devrait pas interférer avec la liaison TCR-pMHC (numéro d'accession PDB : 2BNR) [41]. Nous avons utilisé une coloration tétramère pMHC classe I soluble pour le confirmer. Étant donné que la coloration tétramère des cellules Jurkat NFκB eGFP 1G4 TCRα/β en l'absence d'expression du corécepteur CD8 était très faible, nous avons utilisé des cellules qui expriment CD8. Les cellules Jurkat NFκB eGFP exprimant les TCRα/β et CD8α/β non marqués, Strep-tag II ou Twin-Strep-tagged 1G4 TCRα/β et CD8α/β ont été appariées pour l'expression de la chaîne TCRβ et CD8α (S4 Fig). Ces cellules ont montré une coloration du tétramère de pMHC apparenté (figure S4), suggérant que la présence de Strep-tag II n'interfère pas de manière significative avec la liaison de pMHC.

En résumé, nous avons démontré que le ligand générique peut provoquer une réponse du récepteur comparable au ligand physiologique, renforçant son utilité pour étudier l'activation du récepteur.

Manipulation du système de ligand générique

Notre système de ligand générique pourrait être adapté pour permettre la manipulation de propriétés de ligand autres que la densité de surface, telles que la longueur, l'affinité et la valence, comme illustré dans (Fig. 5A-5C). Par exemple, le récepteur peut être marqué avec un Strep-tag II N-terminal et présenté à Strep-Tactin-SpyCatcherΔ monovalent sur les cellules, produisant une paire récepteur-ligand avec une constante de dissociation 6 fois plus élevée que le Twin-Strep-tag -paire Strep-Tactine trivalente, (K = 43 M) (figure 5B, figure S5). La préparation de Strep-Tactin-SpyCatcherΔ monovalent et la quantification des nombres de ligands monovalents Strep-Tactin-SpyCatcherΔ par cellule sont effectuées de la même manière que pour le système à affinité plus élevée (S5 Fig, S6 Fig). Siglec-14 avec Strep-tag II N-terminal et exprimé avec son adaptateur dans des cellules THP-1 était capable de répondre au Strep-Tactin-SpyCatcherΔ monovalent présenté sur des cellules CHO (Fig 5D). Le CE50 de cette réponse (valeur moyenne et écart type de 1 000 000 et 330 000 ligands génériques par cellule) à une interaction de plus faible affinité était plus élevée, d'environ 5 fois, par rapport à celle mesurée pour Siglec-14 avec Twin-Strep-tag et trivalent Strep -Tactin-SpyCatcher (moyenne CE50 valeur et écart type de 190 000 et 170 000 ligands génériques par cellule) (Fig 3F, Fig 5E). Bien que cette différence de CE50 est en corrélation avec la différence de K, les niveaux d'expression des récepteurs Strep-tag II et Twin-Strep-tag n'étaient pas appariés dans ces expériences préliminaires.

(A) La région extracellulaire du ligand générique peut être allongée par insertion de domaines espaceurs inertes. (B) Les formes mutées de Strep-Tactin/streptavidine peuvent être substituées dans l'interaction récepteur-ligand générique pour étudier comment la modification de l'affinité de liaison affecte l'activation et la signalisation du récepteur. Les variantes de Strep-Tactin sont présentées dans différentes couleurs. (C) Les tétramères Strep-Tactin-SpyCatcher avec un nombre variable de sites de liaison Strep-tag II peuvent être couplés à des cellules d'ancrage du ligand CHO pour examiner l'effet de la variation de la valence du ligand générique sur le déclenchement de la NTR. Par exemple, les récepteurs marqués par Strep-tag II peuvent être présentés à un ligand générique monovalent ou trivalent. (D) Réponse des cellules THP-1 Siglec-14–Strep-tag II DAP12 au ligand générique Strep-Tactin monovalent ou trivalent Strep-Tactin présenté sur des cellules CHO. La réponse des récepteurs est mesurée par la sécrétion d'IL-8. Les données sont représentatives de trois expériences indépendantes. Au sein de chaque stimulation, un échantillon de cellules CHO a été prélevé et utilisé pour mesurer le nombre de sites de liaison Strep-tag II par cellule comme dans la figure 2. La densité de ligand a été calculée à partir de ces nombres (voir la section Mesure du nombre de ligands génériques par cellule) . CE50 (E) et les valeurs de réponse maximale (F) d'expériences individuelles de cellules THP-1 Siglec-14–Strep-tag II DAP12 répondant au ligand générique Strep-Tactin monovalent ou trivalent Strep-Tactin sont tracées. Les barres indiquent la moyenne et l'écart type (m = 3). Les données numériques récapitulatives sont fournies dans les données S1. CHO, ovaire de hamster chinois DAP12, protéine activatrice de DNAX de 12 kDa IL-8, interleukine 8 NTR, récepteur non catalytique tyrosine phosphorylé Siglec-14, lectine de type immunoglobuline liant l'acide sialique 14.

En plus du Strep-Tactin monovalent, nous avons présenté les cellules THP-1 Siglec-14 Strep-tag II au Strep-Tactin-SpyCatcher trivalent sur des cellules CHO (Fig 5D). Cette augmentation de la valence de l'interaction récepteur-ligand générique de monovalent à trivalent a entraîné une CE 5 fois inférieure50 de la réponse de sécrétion d'IL-8 par les cellules THP-1 (CE moyenne50 valeurs de 200 000 contre 1 000 000 de sites de liaison Strep-tag II par cellule pour les ligands trivalents et monovalents, respectivement). Bien que cela montre qu'une valence accrue améliore l'activation du récepteur Siglec-14, d'autres expériences sont nécessaires pour déterminer dans quelle mesure cela est le résultat d'un engagement accru du récepteur ou d'une signalisation améliorée.

Les principes du système peuvent également être exploités pour étudier des caractéristiques mal comprises des RAC, telles que les exigences relatives à leur signalisation optimale. Il existe un intérêt croissant pour les CAR avec des domaines de liaison aux antigènes basés sur des nanocorps ciblant les antigènes tumoraux (examinés dans [44]) [45, 46].

Ici, nous utilisons des CAR standard de première génération avec des nanocorps LaG17 ou LaM8 pour la liaison du ligand et la région intracellulaire de la chaîne TCRζ pour la signalisation (LaG17-ζ et LaM8-ζ, Fig 6A et 6B). LaG17 et LaM8 se lient à GFP et mCherry, respectivement, avec K valeurs de 50 nM et 63 nM (à 25°C) [13]. Pour former les ligands CAR, les cellules d'ancrage du ligand CHO ont été incubées avec des concentrations variables de GFP soluble ou de mCherry fusionnées à SpyCatcher® (Fig. 6A–6D). GFP ou mCherry sont ainsi présentés sur les surfaces cellulaires CHO à une large gamme de concentrations (Fig 6C et 6D) pour l'engagement par le CAR approprié.

(A-B) Les CARs LaG17 anti-GFP et LaM8 anti-mCherry sont exprimés dans les cellules Jurkat. Les ligands CAR comprennent l'ancre de ligand exprimée en surface cellulaire avec SpyTag N-terminal et GFP-SpyCatcher® soluble ou mCherry-SpyCatcher® couplés de manière covalente à l'ancre. Pour plus de simplicité, les CAR sont représentés liés à un seul ligand. (C-D) Quantité de ligand CAR par cellule CHO en fonction de la concentration de GFP-SpyCatcherΔ (C) ou mCherry-SpyCatcherΔ (D) ajoutée aux cellules. Les valeurs médianes d'intensité de fluorescence extraites des analyses de cytométrie en flux des cellules sont présentées. (E-F) Réponse des cellules Jurkat LaG17-ζ et Jurkat LaM8-ζ à GFP-SpyCatcherΔ ou mCherry-SpyCatcherΔ présentées sur des cellules CHO. L'expression à la surface des cellules Jurkat CD69 est tracée en fonction des niveaux relatifs du ligand CAR spécifique sur les cellules CHO. Ce sont les valeurs d'intensité de fluorescence médiane GFP ou mCherry interpolées à partir des données présentées sur les figures 6C et 6D. Les données sont représentatives de deux expériences indépendantes. (G) Pour étendre ce système afin d'étudier les exigences d'une signalisation optimale des récepteurs de costimulation et d'inhibition, des cellules exprimant le CAR LaG17-ζ et une protéine de fusion constituée de nanocorps LaM8 suivis des régions transmembranaires et intracellulaires d'un récepteur de costimulation ou d'inhibition peuvent être présentées aux cellules d'ancrage du ligand CHO présentant à la fois GFP-SpyCatcherΔ et mCherry-SpyCatcherΔ à des niveaux titrables. (H) Les cellules d'ancrage du ligand CHO ont d'abord été incubées avec une seule concentration inférieure à la saturation de GFP-SpyCatcherΔ, puis en titrant les concentrations de mCherry-SpyCatcherΔ. Les valeurs médianes d'intensité de fluorescence extraites des analyses de cytométrie en flux des cellules sont présentées. Les données numériques récapitulatives sont fournies dans les données S1. CAR, chimeric antigen receptor CHO, Chinese hamster ovary GFP, green fluorescent protein IgG4, immunoglobulin G4 mCherry, monomeric Cherry.

Jurkat cells transduced to stably express either LaG17- ζ or LaM8-ζ were activated in a clear dose-dependent manner by CHO cells presenting GFP or mCherry, respectively (Fig 6E and 6F). This Jurkat cell response, indicated by up-regulation of CD69 surface expression, was specific. CD69 up-regulation in Jurkat LaG17-ζ cells was not seen in response to CHO mCherry ligand cells nor in Jurkat LaM8-ζ cells in response to CHO GFP ligand cells.

The efficiency of coupling and the high number of SpyTag ligand anchors suggested that the system could be extended to couple with multiple SpyCatcher fusion proteins to create cells presenting multiple ligands (Fig 6G). Indeed, we show by flow cytometry that CHO ligand anchor cells preincubated to present one level of GFP-SpyCatcherΔ can be subsequently incubated with varying concentrations of mCherry-SpyCatcherΔ to titrate the surface-presented levels of this second ligand (Fig 6H). These cells could be used, for example, in combination with cells presenting both LaG17-ζ and a receptor comprising the LaM8 nanobody fused to transmembrane and cytoplasmic regions of costimulatory or inhibitory receptors. This would facilitate analysis of signal integration between multiple receptors, which remains poorly understood.


Chapter 1 - Introduction to the Biochemistry and Molecular Biology of Denitrification

This chapter provides an overview of the biochemistry and genetics of denitrification in such organisms. It considers the aspects of denitrification that occur in archaea and certain fungi. Denitrification has been mostly studied in Paracoccus denitrificans and Pseudomonas stutzeri and so it describes denitrification for each of these organisms in turn before considering to what extent general principles can be discerned. In recent years, high-resolution crystal structures have become available for these enzymes with the exception of the structure for NO-reductase. In general, the proteins required for denitrification are only produced under (close to) anaerobic conditions, and if anaerobically grown, cells are exposed to O2 and then the activities of the proteins are inhibited. Specialized denitrifiers, such as P. denitrificans and the denitrifying Pseudomonads, contain more than 40 genes, which encode the proteins that make up a full denitrification pathway. They include the structural genes for the enzymes and e − donors, their regulators as well as many accessory genes required for assembly, cofactor synthesis, and insertion into the enzymes. In contrast, some denitrifiers can only carry out the two central reactions of the pathway and use these activities to support growth, but the cost of maintaining this capability is a very small amount of genome space. It provides insights into the regulation of gene expression and the way in which some denitrification enzymes play different roles in bacteria.


Function of the Cell Membrane

The cell membrane gives the cell its structure and regulates the materials that enter and leave the cell. It is a selectively permeable barrier, meaning it allows some substances to cross, but not others. Like a drawbridge intended to protect a castle and keep out enemies, the cell membrane only allows certain molecules to enter or exit.

Crossing the Membrane

Small molecules, such as oxygen, which cells need in order to carry out metabolic functions such as cellular respiration, and carbon dioxide, a byproduct of these functions, can easily enter and exit through the membrane. Water can also freely cross the membrane, although it does so at a slower rate.

However, highly charged molecules, like ions, cannot directly pass through, nor can large macromolecules like carbohydrates or amino acids. Instead, these molecules must pass through proteins that are embedded in the membrane. In this way, the cell can control the rate of diffusion of these substances.

Another way the cell membrane can bring molecules into the cytoplasm is through endocytosis. The reverse process, where the cell delivers contents outside the membrane barrier, is called exocytosis.

Cells can also deliver substances across the cell membrane to the external environment through exocytosis, which is the opposite of endocytosis. During exocytosis, vesicles form in the cytoplasm and move to the surface of the cell membrane. Here, they merge with the membrane and release their contents to the outside of the cell. Exocytosis removes the cell’s waste products, which are the parts of molecules that are not used by the cell, including old organelles.

Signaling at the Cell Membrane

The cell membrane also plays an important role in cell signaling and communication. The membrane contains several embedded proteins that can bind molecules found outside of the cell and pass on messages to the inside of the cell.

Importantly, these receptor proteins on the cell membrane can bind to substances produced by other areas of the body, such as hormones. When a molecule binds to its target receptor on the membrane, it initiates a signal transduction pathway inside the cell that transmits the signal to the appropriate molecules.

As a result of these often complex signaling pathways, the cell can perform the action specified by the signaling molecule, such as making or stopping the production of a certain protein.

How does the structure of the cell membrane allow it to carry out these functions?


Brief Revision Guide to Immune System and Immune System Questions and Markschemes

Immunity and the Immune system is a topic that students do find hard.

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Remember that specific immunity requires clonal selection and clonal expansion - and that each B and T lymphocyte has one shape of receptor on the surface which is complementary to only one antigen.

Memory cells are produced in response to experiencing an antigen (either on a pathogen or a vaccine) - hence when you subsequently encounter the same antigen, the production of antibodies (specific only to that antigen) will be quicker and larger. If the pathogen mutates, then you will no longer possess a specific immunity as the antigens (proteins or glycoproteins) will be a different shape and no longer complementary to the receptors on the memory cells.

Learning the inflammatory response and being able to explain each part (rise in temperature, swelling, increased permeability. ) will help to reduce the number of pathogens is important.

You must know the structure and function of each part of the antibody.

There seems to be an obsession with opsonins.

You need to know phagocytosis in detail (phagolysosome, hydrolytic enzymes . )

You must be able to explain the differences between the primary and secondary responses of antibody production.

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What are Antigens?

Un antigène is a foreign or &ldquonon-self&rdquo macromolecule (typically a protein) that reacts with cells of the immune system. However, not all antigens will provoke a response . For example, each of us produce a large number of auto-antigènes. Each of us has a unique set of self-antigens that do not trigger an immune response within ourselves. The absence of this immune response very important and highly regulated, it prevents scenarios where the immune cells begin to attack host cells. In the presence of foreign atnigens, proteins called anticorps attach to the antigens on the plasma membrane of the cell containing the antigen.

Antigens and ABO Blood Types

Like other cells, our red blood cells may or may not have self-antigens present on their cell membrane. The ABO blood typing is a naming scheme that states the presence or absence of just two antigens: antigen A and antigen B. The antigens that are present on the surface of our red blood cells determine our blood type. If we looking at the table below, we&rsquoll see that:

      • &rarr Blood type A has A-antigens
      • &rarr Blood type B has B-antigens
      • &rarr Blood type AB has both A-antigens and B antigens
      • &rarr Blood type O has neither antigen.


      Molecular and Cell Biology

      The teaching and research activities of the Department of Molecular and Cell Biology (MCB) concern the molecular structures and processes of cellular life and their roles in the function, reproduction, and development of living organisms.

      This agenda covers a broad range of specialized disciplines, including biochemistry, biophysics, molecular biology, structural biology, genetics, genomics, bioinformatics, cell biology, developmental biology, tumor biology, microbiology, immunology, pathogenesis and neurobiology.

      The types of living organisms from which the departmental faculty draws its working materials are as diverse as its disciplinary specializations — ranging from viruses and microbes through plants, roundworms, annelids, arthropods, and mollusks, to fish, amphibia, and mammals.

      The faculty of the department is organized into five divisions: Biochemistry and Molecular Biology Cell and Developmental Biology Genetics, Genomics, and Development Neurobiology and Immunology and Pathogenesis.

      Research Facilities

      The Cancer Research Laboratory is a research institute on the Berkeley campus that carries on a research, teaching, and service program designed to foster interdepartmental participation in cancer research. Some of the Department of Molecular and Cell Biology faculty are also members of the Cancer Research Laboratory. The central research program represents a multidisciplinary approach to an understanding of the mechanism of neoplastic transformation using a variety of systems. Graduate student and postdoctoral research programs are supported in various areas of tumor biology, biochemistry, cell biology, endocrinology, genetics, immunology, molecular biology, and tumor virology. The Cancer Research Laboratory also operates three research facilities:

      Instrumentation in the facilities is operated by highly trained staff, and training is offered in methods and techniques associated with each facility. For more information, visit the CRL website.

      The Functional Genomics Laboratory at Berkeley enables researchers to conduct state-of-the-art research in functional genomics, with a focus on using Next Generation sequencing technologies. These technologies include the sequencing of entire genomes of selected model systems and the ability to survey genome-wide patterns of gene expression and now allow the dissection of biological processes at unprecedented levels of detail. In particular, this research facility provides the infrastructure, technologies, and computational resources for the performance of DNA microarray experiments, which allow the analysis of mRNA expression from tens of thousands of genes at a time. The Functional Genomics Laboratory currently possesses all the equipment necessary for conducting DNA microarray experiments, including thermal cyclers fluidics robots microarray printing robots laser-scanning microscopes for microarray scanning an Affymetrix workstation and scanner and dedicated computers for data analysis and storage of informatics databases. For more information, go to this website.

      The Robert D. Ogg Electron Microscope Laboratory is an instructional and research unit of the College of Letters and Science. It houses equipment for transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). The staff is skilled not only in the operation and maintenance of instruments but also in standard and most specialized techniques of sample preparation. Qualified undergraduates and graduate students, postdoctoral associates, faculty, and research staff in biological and physical sciences, once trained, may make arrangements for use of the instruments in research. Instruction is provided both in classes and in individual training. Registered students and faculty are not charged for training. Nominal charges are made for use of the laboratory for individual research work. With permission from the director, non-UC personnel can be accepted for training or laboratory use. Equipment can be used outside normal hours. The laboratory provides demonstrations of the electron microscope and preparative techniques for on-campus classes and can make special arrangements for tour groups. For more information, go to this website.


      Voir la vidéo: Biologie Cellulaire: Introduction générale sur la composition de la cellule (Janvier 2023).