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Conférence 23 : Mutants et Mutations 2018 - Biologie

Conférence 23 : Mutants et Mutations 2018 - Biologie


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Conférence 23 : Mutants et Mutations 2018

Développement et validation d'un vecteur CRISPR/Cas9 efficace pour isoler efficacement les transformants positifs et les mutants sans transgène dans une large gamme d'espèces végétales

La technique CRISPR/Cas9 est un outil très précieux dans la création de nouveaux matériaux pour la recherche fondamentale et appliquée. Auparavant, nous avons réussi à générer efficacement des mutations dans Brassica napus en utilisant un vecteur CRISPR/Cas9 disponible pKSE401, tandis que l'isolement des mutants sans Cas9 est laborieux et inefficace. Ici, nous avons inséré une étiquette de fluorescence (sGFP) pilotée par le constitutif 35S promoteur en pKSE401 pour faciliter un écran visuel de mutants. Ce vecteur modifié a été nommé pKSE401G et testé sur plusieurs espèces de plantes dicotylédones, dont Arabidopsis, B. napus, Fragaria vesca (fraise), et Glycine max (soja). Par conséquent, les plantes positives pour la GFP ont été facilement identifiées par criblage par fluorescence dans toutes ces espèces. Parmi ces plantes GFP-positives, la fréquence moyenne de mutation variait de 20,4 à 52,5% dans Arabidopsis et B. napus avec une transformation stable, et était de 90,0% dans la fraise et de 75,0% dans le soja avec une transformation transitoire, indiquant que l'efficacité d'édition ressemble à celle du vecteur d'origine. De plus, des mutants sans transgène ont été suffisamment identifiés dans Arabidopsis dans la génération T2 et B. napus dans la génération T1 sur la base de l'absence de fluorescence GFP, et ces mutants étaient transmissibles de manière stable à la génération suivante sans mutations nouvellement induites. Collectivement, pKSE401G nous fournit un outil efficace pour identifier facilement les transformants primaires positifs et les mutants sans transgène dans les générations ultérieures dans un large éventail d'espèces de plantes dicotylédones.

Mots clés: Arabidopsis B. napus CRISPR/Cas9 édition du génome dépistage visuel de fraise de soja.

Les figures

Conception du vecteur pKSE401G…

Conception du vecteur pKSE401G . (UNE) Représentation schématique du pKSE401G vecteur…

Génération d CR-rpk1 mutants dans…

Génération d CR-rpk1 mutants dans Arabidopsis . (UNE) Les sites cibles de sgRNA1…

Écran visuel et caractérisation de…

Écran visuel et caractérisation de Cas9-free CR-rpk1 usines de la génération T2. (UNE)…

Génération d CR-bnaarf2 mutants dans…

Génération d CR-bnaarf2 mutants dans B. napus . (UNE) Alignement partiel de séquences codantes…

Écran visuel et caractérisation de…

Écran visuel et caractérisation de Cas9-free CR-bnaarf2 mutants de la génération T1. (UNE)…

Phénotype et génotype du fraisier…

Phénotype et génotype de fraise transformé de façon transitoire avec CR-FveMYB10. (UNE) La cible…

Phénotype et génotype du soja…

Phénotype et génotype de racines de soja transformées de façon transitoire avec CR-GmNFR1a . (UNE) Les…


Activation atypique de la protéine G Gα q par la mutation oncogène Q209P

Le rôle causal des mutations de la voie des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) dans le mélanome de l'uvée (UM) a été bien établi. Presque tous les UM portent une mutation activatrice dans une voie GPCR médiée par les protéines G de la Gq/11 famille, entraînant l'initiation de la tumeur et éventuellement la progression métastatique. Ainsi, le ciblage de cette voie est prometteur thérapeutiquement pour la gestion de l'UM. Cependant, le ciblage direct de Gα oncogèneq/11 mutants, présents dans ∼90% des UMs, est compliquée par la croyance que ces mutants ressemblent structurellement à Gα actifq/11 WT. Cette notion est solidement fondée sur des études antérieures caractérisant des mutants Gα dans lesquels une glutamine catalytique conservée (Gln-209 dans Gαq) est remplacée par la leucine, ce qui entraîne un déficit de la fonction GTPase et une activation constitutive. Alors que Q209L représente environ la moitié des mutations GNAQ dans l'UM, Q209P est aussi fréquent que Q209L et favorise également l'oncogenèse, mais n'a pas été caractérisé au niveau moléculaire. Ici, nous avons caractérisé les propriétés biochimiques et de signalisation de Gαq Q209P et a constaté qu'il est également déficient en GTPase et active la signalisation en aval aussi efficacement que Gαq Q209L. Cependant, Gαq Q209P avait des caractéristiques moléculaires et fonctionnelles distinctes, y compris dans la région switch II de Gαq Q209P, qui a adopté une conformation différente de celle de Gαq Q209L ou WT Gα actifq, entraînant une modification de la liaison aux effecteurs, Gβγ et aux régulateurs des protéines de signalisation des protéines G (RGS). Nos résultats révèlent que les propriétés moléculaires de Gαq Q209P sont fondamentalement différents de ceux des autres Gα actifsq protéines et pourrait être exploitée comme une vulnérabilité spécifique pour les ∼20% des UM portant cette mutation.

Mots clés: Récepteur couplé aux protéines G (RCPG) GNAQ GTPase biologie du cancer signalisation cellulaire hétérotrimérique protéine G mélanome oncogenèse signal transduction mélanome uvéal.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts avec le contenu de cet article


Les mutations de la leucémie humaine corrompent mais n'abrogent pas la fonction GATA-2

En induisant la génération et la fonction de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, le régulateur principal de l'hématopoïèse GATA-2 contrôle la production de tous les types de cellules sanguines. hétérozygote GATA2 les mutations provoquent une immunodéficience, un syndrome myélodysplasique et une leucémie myéloïde aiguë. GATA2 les mutations de la maladie perturbent généralement les résidus d'acides aminés qui interviennent dans la liaison à l'ADN ou cis-éléments au sein d'un vital GATA2 activateur intronique, suggérant un mécanisme d'haploinsuffisance de la pathogenèse. Des mutations se produisent également dans GATA2 des régions codantes distinctes du doigt de zinc carboxy-terminal de liaison à l'ADN (doigt C), y compris le doigt de zinc amino-terminal (doigt N), et la fonction du doigt N n'est pas établie. On ne sait pas si des mutations distinctes ont un impact différentiel sur les mécanismes de GATA-2. Ici, nous démontrons que les mutations du doigt N ont diminué l'occupation de la chromatine GATA-2 et atténué la régulation du gène cible. Nous avons développé un test de complémentation génétique pour quantifier la fonction GATA-2 dans les cellules progénitrices myéloïdes de Gata2 -77 souris mutantes amplificatrices. La complémentation GATA-2 a augmenté la différenciation érythroïde et myéloïde. Alors que les mutants de la maladie GATA-2 n'étaient pas compétents pour induire la différenciation érythroïde de Lin - Kit + progéniteurs myéloïdes, de manière inattendue, ils ont favorisé la différenciation et la prolifération myéloïdes. Comme l'activité de promotion de la myélopoïèse des mutants GATA-2 dépassait celle de GATA-2, GATA2 les mutations de la maladie ne sont pas strictement inhibitrices. Ainsi, nous proposons que le paradigme de l'haplo-insuffisance n'explique pas entièrement la pathogenèse liée à GATA-2, et un amalgame de défauts qualitatifs et quantitatifs provoqués par GATA2 mutations sous-tend les phénotypes complexes des pathologies dépendantes de GATA-2.

Mots clés: Leucémie hématopoïétique AML GATA-2 MDS.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.

Les figures

Les mutations de la leucémie GATA-2 N-finger atténuent…

Les mutations de la leucémie GATA-2 N-finger atténuent l'occupation de la chromatine et l'activation du gène cible. ( UNE…

Déterminants structurels de la fonction GATA-2.…

Déterminants structurels de la fonction GATA-2. ( UNE , Supérieur ) Représentation schématique de…

Les mutants de la leucémie GATA-2 augmentent la myéloïde…

Les mutants de la leucémie GATA-2 augmentent l'activité des cellules progénitrices myéloïdes dans une cellule génétique primaire…

Les mutants de leucémie GATA-2 stimulent la myélopoïèse…

Les mutants de leucémie GATA-2 stimulent la myélopoïèse ex vivo. ( UNE ) Représentation schématique de…

Le mutant de la leucémie GATA-2 augmente les cellules…

Le mutant de leucémie GATA-2 augmente la progression du cycle cellulaire dans un essai de complémentation génétique. (…

Mutations de la leucémie GATA-2 : gain de fonction et…

Mutations de la leucémie GATA-2 : conséquences du gain de fonction et de la perte de fonction. ( UNE ) Activités moléculaires de…


Discussion

La fonction de répression de la croissance de l'ABA a été considérée comme un compromis pour améliorer l'adaptation au stress (3, 33, 34). Étant donné que les processus de croissance des plantes et d'adaptation au stress sont opposés à bien des égards, il est important d'établir entre eux un équilibre approprié pour l'environnement. Par conséquent, les niveaux et la signalisation d'ABA devraient avoir des effets significatifs sur la croissance et l'adaptation. L'ajustement génétique de l'équilibre en manipulant les niveaux d'ABA et/ou la signalisation peut générer des variétés de cultures utiles pour améliorer la productivité dans des environnements spécifiques.

Les PYL constituent actuellement la plus grande famille connue de récepteurs d'hormones végétales (35). Dans Arabidopsis, 14 PYL des membres ont été identifiés et des fonctions redondantes ainsi que différentielles des gènes ont été documentées (11, 26 ⇓ –28, 35, 36). Dans le riz, 13 PYL membres ont été prédits (29, 30). Nos résultats indiquent également des fonctions différentielles et redondantes pour différents membres. La différenciation fonctionnelle et la redondance offrent la possibilité d'ajuster l'équilibre entre la croissance et la résistance au stress pour améliorer la productivité des cultures en éditant certains PYLs. Dans le riz, nous avons trouvé que parmi les pyl mutants, pyl1/4/6 ont montré la meilleure croissance, tout en maintenant une dormance des graines presque normale. Pendant la canicule de l'été 2016 dans la rizière de Shanghai, bien que la croissance de quintuple à septuple pyl mutants était de plus en plus retardée, la pyl1/4/6 les mutants poussaient toujours mieux que le type sauvage. Ceci suggère que le pyl1/4/6 lignées peuvent être plus tolérantes au temps chaud que les mutants du groupe I quintuple, sextuple et septuple. Ces résultats indiquent que l'équilibre entre la croissance et l'adaptation au stress est altéré dans le groupe I d'ordre élevé. pyl mutants, et que le nouvel équilibre dans pyl1/4/6 les plantes favorisent plus de croissance, tandis que l'adaptation au stress est moins compromise que dans le groupe d'ordre supérieur I pyl mutants.

Des études antérieures ont montré que Arabidopsis d'ordre élevé pyl les mutants présentaient une croissance retardée, et que ce défaut de croissance peut être amélioré en augmentant l'humidité de l'environnement de croissance (25, 37). Pourtant, une croissance améliorée (par rapport au type sauvage) n'a pas été observée dans Arabidopsis pyl mutants (25). Bien que, dans l'ensemble, le riz PYL ont des fonctions similaires à PYL d'Arabidopsis en favorisant la dormance des graines et la fermeture des stomates, ils semblent différer dans leurs impacts sur la croissance des plantes. Il est probable que dans les conditions de croissance des rizières, une partie du riz PYL ont été sélectionnés pour avoir un rôle particulièrement important dans la limitation de la croissance des plantes. À l'avenir, il sera intéressant de déterminer comment PYL1, PYL4 et PYL6 (en particulier PYL6) sont liés à la régulation de la croissance du riz. Dans la rizière, où l'eau n'est pas limitative, la transpiration plus élevée des pyl1/4/6 peut contribuer à une croissance plus rapide et à un rendement plus élevé en facilitant un CO rapide2 absorption, tout en évitant les effets négatifs d'une perte d'eau excessive. Les phytogénéticiens suggèrent depuis longtemps que l'amélioration des performances des cultures dans certains climats peut être obtenue en réduisant les réponses à l'ABA ou au niveau d'ABA endogène (34). Les pyl1/4/6 les mutants de riz peuvent représenter une approche efficace pour atteindre ce résultat historiquement convoité.


La plupart des mutations qui causent l'ataxie spinocérébelleuse autosomique récessive de type 16 (SCAR16) déstabilisent la protéine de contrôle de qualité E3 ligase CHIP

L'accumulation de protéines mal repliées favorise l'agrégation des protéines et la mort neuronale dans de nombreuses maladies neurodégénératives. Pour contrer l'accumulation de protéines mal repliées, les neurones ont des voies qui reconnaissent et replient ou dégradent les protéines sujettes à l'agrégation. Une ligase E3 contenant une boîte en U, l'extrémité C de la protéine interagissant avec Hsc70 (CHIP), joue un rôle clé dans ce processus, en ciblant les protéines mal repliées pour la dégradation du protéasome. CHIP joue un rôle protecteur dans les modèles murins de maladies neurodégénératives, et chez l'homme, des mutations dans CHIP provoquent une ataxie spinocérébelleuse autosomique récessive de type 16 (SCAR16), une maladie neurodégénérative mortelle caractérisée par une ataxie du tronc et des membres qui entraîne une instabilité de la marche. Ici, nous avons systématiquement analysé les mutations CHIP qui causent SCAR16 et constaté que la plupart des mutations SCAR16 déstabilisent CHIP. Cette déstabilisation a provoqué des défauts spécifiques à la mutation de l'activité CHIP, notamment une formation accrue d'oligomères solubles, une diminution des interactions avec les chaperons, une diminution de l'ubiquitination du substrat et une réduction des niveaux à l'état d'équilibre dans les cellules. Conformément à la diminution de la stabilité de CHIP favorisant son dysfonctionnement dans SCAR16, la plupart des protéines mutantes ont récupéré leur activité lorsque les tests ont été effectués en dessous de la température de fusion des mutants. Ensemble, nos résultats ont découvert la base moléculaire des défauts génétiques de la fonction CHIP qui causent SCAR16. Nos connaissances suggèrent que les composés qui améliorent la thermostabilité des variantes génétiques CHIP peuvent être bénéfiques pour le traitement des patients atteints de SCAR16.

Mots clés: chaperon moléculaire maladie neurodégénérative protéine mal repliée protéostase ubiquitine ligase.

© 2018 par la Société américaine de biochimie et de biologie moléculaire, Inc.

Déclaration de conflit d'intérêts

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts avec le contenu de cet article


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La protéine LZTR1 est mutée dans les cancers humains et les maladies du développement. Les travaux de deux groupes convergent maintenant pour impliquer la protéine dans la régulation de la signalisation par la petite guanosine triphosphatase RAS. Steklov et al. ont montré que des souris haploinsuffisantes pour LZTR1 ont récapitulé des aspects de la maladie humaine syndrome de Noonan. Leurs études biochimiques ont montré que LZTR1 associé à RAS. LZTR1 semble fonctionner comme un adaptateur qui favorise l'ubiquitination du SRA, inhibant ainsi ses fonctions de signalisation. Bigenzahn et al. ont trouvé LZTR1 dans un criblage de protéines dont l'absence a conduit à une résistance aux inhibiteurs de la tyrosine kinase utilisés pour traiter les cancers causés par le produit oncogène BCR-ABL. Leurs études biochimiques et génétiques chez les mouches des fruits ont également montré que la perte de LZTR1 entraînait une augmentation de l'activité du RAS et de la signalisation via la voie de la protéine kinase activée par les mitogènes.

La protéine du régulateur transcriptionnel 1 de type leucine zipper-like (LZTR1), un adaptateur pour le complexe ubiquitine ligase cullin 3 (CUL3), est impliquée dans la maladie humaine, mais son mécanisme d'action reste inconnu. Nous avons constaté que l'haploinsuffisance de Lztr1 chez la souris récapitule les phénotypes du syndrome de Noonan, tandis que la perte de LZTR1 dans les cellules de Schwann entraîne la dédifférenciation et la prolifération. En piégeant les complexes LZTR1 à partir de cellules de mammifères intactes, nous avons identifié la guanosine triphosphatase RAS comme substrat pour le complexe LZTR1-CUL3. L'analyse de l'ubiquitome a montré que la perte de Lztr1 abroge l'ubiquitination de Ras à la lysine-170. L'ubiquitination médiée par LZTR1 a inhibé la signalisation RAS en atténuant son association avec la membrane. Associé à la maladie LZTR1 les mutations ont perturbé soit la formation du complexe LZTR1-CUL3 soit son interaction avec les protéines RAS. La régulation du RAS par l'ubiquitination médiée par LZTR1 fournit une explication du rôle de LZTR1 dans la maladie humaine.

Mutations concomitantes à une perte d'hétérozygotie au niveau du régulateur transcriptionnel de type glissière à leucine 1 (LZTR1) sont associés au glioblastome et à la schwannomatose (13). Les mutations LZTR1 prédisposent aux néoplasmes pédiatriques et sont augmentées par rapport au bruit de fond dans les cancers du foie et des testicules (4, 5). La mutation LZTR1 la plus récurrente dans le cancer est une mutation inactivante du site d'épissage au niveau du codon 217 (fig. S1) (4, 6). LZTR1 constitue un syndrome de Noonan causé par une dérégulation de la guanosine triphosphatase RAS (79). Cependant, la façon dont LZTR1 contribue à la maladie humaine n'est pas connue.

Pour découvrir les mécanismes de la maladie Lztr1, nous avons utilisé un modèle de souris de suppression Lztr1. Nous avons constaté que la perte de Lztr1 est mortelle entre le jour embryonnaire 17,5 (E17,5) et la naissance (fig. S2A). Lztr1 Les souris mâles +/- présentaient une perte de poids (fig. S2, B à D) et une dysmorphie faciale (Fig. 1A). Lztr1 Les souris +/-, mâles et femelles, présentaient des malformations cardiaques, notamment une diminution de la fonction systolique ventriculaire gauche, une augmentation des dimensions diastoliques, une hypertrophie excentrique, une augmentation de la surface des cardiomyocytes et une longévité réduite (Fig. 1, B et C, et fig. S2, E et F). Collectivement, nos résultats montrent que Lztr1 Les souris +/- récapitulent certains phénotypes de patients humains atteints du syndrome de Noonan, indiquant que la fonction LZTR1 est évolutivement conservée.

(UNE) Caractéristiques morphométriques des crânes de 12 mois Lztr1 +/+ et Lztr1 +/- souris mâles. (B) Coupes ventriculaires cardiaques colorées à l'hématoxyline et à l'éosine. Barre d'échelle, 0,5 mm. La surface cardiaque totale a été quantifiée par Fidji. Dans le graphique, les lignes horizontales représentent les moyennes ± SD. (C) Une surface moyenne de 200 cardiomyocytes mesurée dans des coupes cardiaques colorées à la laminine de Lztr1 +/+ et Lztr1 +/- souris. Les lignes horizontales représentent les moyennes ± SD. () Taux de croissance des MEF à passage précoce isolés de trois Lztr1 +/+ et trois Lztr1 −/− embryons. (E) Taux de croissance de Lztr1 −/− MEFs exprimant un vecteur vide (EV), wt-LZTR1 ou mutants LZTR1. m = 3. (F) Croissance IA de cellules de Schwann exprimant Cas9 ou Cas9/gLZTR1 (gLZTR1, ARN guide ciblant LZTR1). m = 3. (g) Croissance IA de cellules LZTR1-indel Schwann exprimant les constructions indiquées. m = 3. M202R, rencontré 202 →Arg. (H) Analyse quantitative de la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (qRT-PCR) de l'expression de l'ARNm dans les cellules primaires de Schwann humaines exprimant shGFP ou shLZTR1 regroupé. m = 3. Pour (D) à (H), les valeurs sont des moyennes ± SEM. Pour (A) à (C) et (F) à (H), P les valeurs proviennent d'un étudiant bilatéral t test. Pour (D) et (E), P les valeurs ont été détectées par une analyse de variance à deux voies (ANOVA).

Nous avons conçu plusieurs modèles cellulaires de perte de LZTR1 : des fibroblastes d'embryons de souris (MEF) dérivés de Lztr1 +/+ et Lztr1 −/− Embryons de souris, cellules de Schwann humaines primaires exprimant la protéine fluorescente verte en épingle à cheveux courte (shGFP) ou shLZTR1, et cellules de Schwann humaines immortalisées et cellules HeLa avec des indels LZTR1 médiés par CRISPR-Cas9 (fig. S3). Dans tous les modèles testés, la perte de LZTR1 a augmenté le taux de croissance (Fig. 1D et Fig. S4, A à C). La surexpression de LZTR1 de type sauvage (wt-LZTR1), mais pas de mutants LZTR1, a réduit le taux de croissance amélioré (Fig. 1E et fig. S4, D et E). La perte de LZTR1 dans les cellules de Schwann a amélioré la colonie bidimensionnelle et la croissance indépendante de l'ancrage (AI) (Fig. 1F et fig. S4, F à H), et la surexpression de wt-LZTR1, mais pas de mutants LZTR1 associés à la maladie, supprimée Croissance de l'IA dans les cellules LZTR1-indel (Fig. 1G). De plus, l'épuisement de LZTR1 dans les cellules de Schwann a montré une signature d'expression génique (Fig. 1H) ressemblant à celle des cellules de Schwann en prolifération pendant la régénération nerveuse (10). Ces données suggèrent que la perte de LZTR1 pousse les cellules de Schwann des cellules myélinisantes au repos vers les cellules en prolifération.

LZTR1 agit comme un adaptateur de substrat pour les complexes cullin 3 (CUL3) ubiquitine ligase (11). Pour identifier les substrats candidats LZTR1, nous avons utilisé une méthode Virotrap de spectrométrie de masse (MS), qui a permis le piégeage de complexes protéiques à partir de cellules de mammifères intactes (fig. S5A) (12). L'écran avec LZTR1 comme appât a détecté CUL3, l'homologue de l'oncogène viral du sarcome de rat Harvey (HRAS) et l'homologue de l'oncogène viral du neuroblastome RAS (NRAS) parmi les meilleurs résultats (Fig. 2A). Le criblage réciproque de Virotrap avec le mutant HRAS-deltaCAAX, qui manque des quatre derniers acides aminés, a confirmé la formation du complexe avec LZTR1 et identifié CUL3 (Fig. 2B). De plus, un anticorps panRAS qui reconnaît toutes les isoformes RAS co-immunoprécipitées avec l'hémagglutinine (HA)-étiqueté LZTR1. De même, LZTR1 marqué au drapeau co-immunoprécipité avec les protéines RAS endogènes, mais pas RAC1 (fig. S5B). De plus, nous avons introduit un Halo-tag HiBiT (13) à la LZTR1 locus dans les cellules HeLa et les MEF (Fig. 2C et fig. S5, C et D). Anticorps panRAS co-immunoprécipité avec RAS endogène et HiBiT-LZTR1 endogène (Fig. 2C et Fig. S5E). Des co-immunoprécipitations réciproques (co-IP) ont démontré que LZTR1 interagissait avec chacune des trois isoformes Flag-RAS (fig. S5F). Ensemble, ces résultats indiquent que LZTR1, CUL3 et RAS forment un complexe.

(UNE et B) Criblage Virotrap réalisé dans des cellules HEK293T en utilisant l'antigène spécifique de groupe (GAG)-LZTR1 (A) ou GAG-HRAS-deltaCAAX (deltaC) (B) comme appâts. Escherichia coli la dihydrofolate réductase (eDHFR) fusionnée à GAG a été utilisée comme contrôle négatif. (C) Un schéma pour la génération de cellules exprimant la protéine HiBiT-LZTR1 dans le cadre. Le RAS a été immunoprécipité à partir des lysats de cellules HeLa édités par HiBiT-LZTR1 avec l'anticorps panRAS. Le signal luminescent a été généré par HiBiT incubé avec LgBiT. nt, nucléotide. () Le RAS ubiquitiné a été purifié à partir de cellules HEK293T exprimant les constructions indiquées par chromatographie d'affinité métallique au Co 2+ et détecté par immunotransfert. Les nombres à gauche sont les masses moléculaires en kDa. 2xUb, deux Ub 1xUb, un Ub EV, vecteur vide, WCL, lysat de cellules entières ns, non spécifique. (E) Un workflow pour l'analyse ubiquitaire. LC-MS/MS, chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem. (F) Une carte thermique montrant des peptides différentiellement ubiquitinés dans Lztr1 +/+ et Lztr1 −/− MEF. L'échelle montre Z-valeurs d'intensité du site notées. (g) La quantification de l'analyse PLA de cellules de Schwann exprimant Cas9 ou Cas9/gLZTR1 en utilisant des anticorps contre panRAS et Ub. Les valeurs sont des moyennes ± SEM m = 3. P les valeurs proviennent d'un étudiant bilatéral t test. Les abréviations à une lettre des résidus d'acides aminés sont les suivantes : A, Ala C, Cys D, Asp E, Glu F, Phe G, Gly H, His I, Ile K, Lys L, Leu M, Met N, Asn P , Pro Q, Gln R, Arg S, Ser T, Thr V, Val W, Trp et Y, Tyr.

Pour tester si le complexe LZTR1-CUL3 pouvait contrôler l'ubiquitination du SRA, nous avons effectué une réaction d'ubiquitination in vitro. Nous avons observé une ubiquitination de wt-HRAS spécifiquement en présence du complexe LZTR1-CUL3 (fig. S6A). La coexpression de LZTR1 et CUL3 dans des cellules 293T de rein embryonnaire humain (HEK) a augmenté les quantités de RAS ubiquitiné (Fig. 2D et Fig. S6B). By contrast, treatment with the cullin neddylation inhibitor MLN4924 or loss of LZTR1 led to decreased ubiquitination of all Flag-tagged RAS protein isoforms (fig. S6, C to F). Thus, the LZTR1-CUL3 complex can promote ubiquitination of RAS.

To investigate the role of LZTR1 in ubiquitination of endogenous RAS, we characterized ubiquitination profiles of Lztr1 +/+ et Lztr1 −/− MEFs by MS (Fig. 2E). Ubiquitome analysis revealed that ubiquitination of Hras at Lys 170 (K170) was abrogated in MEFs lacking Lztr1 (Fig. 2F and fig. S6G), indicating that endogenous Ras may serve as a substrate for the LZTR1-CUL3 complex. We also optimized a proximity ligation assay (PLA) with paired antibodies to ubiquitin (Ub) and panRAS. Consistent with the MS results, Hras-K170R (Lys 170 →Arg) knock-in or depletion of LZTR1 led to a decrease in panRAS-Ub proximity signals (Fig. 2G and fig. S7). MS analyses failed to detect any C-terminal peptides of Nras or Kras, perhaps because these isoforms are not highly expressed in MEFs and their C termini are lysine-rich (fig. S8A). However, LZTR1 interacted with (fig. S5F) and ubiquitinated all three RAS isoforms (fig. S6F), consistent with evolutionary conservation of K170 (fig. S8D). Thus, the LZTR1-CUL3 complex appears to mediate ubiquitination of all RAS isoforms.

Although multiple truncating and missense mutations of LZTR1 have been reported in Noonan syndrome and schwannomatosis (13, 14), no recurrent germline LZTR1 mutations have been identified to date. Additional sequencing analysis of blood samples from schwannomatosis patients revealed several recurrent germline mutations of LZTR1 within the BTB (broad-complex, tramtrack, and bric-a-brac)–BACK domains predicted to mediate dimerization and CUL3 binding (11, 15) (Fig. 3A). Concordantly, the BTB-BACK LZTR1 mutants, except L812P (Leu 812 →Pro), exhibited reduced binding to CUL3 (Fig. 3B and fig. S9A). Although LZTR1-L812P retained interaction with CUL3, it failed to form dimers (Fig. 3C). Oligomerization of BTB domains determines the subcellular distribution of CUL3 adaptors (15, 16). Indeed, both endogenous and ectopically expressed HA-tagged LZTR1 showed punctate endomembrane immunostaining (fig. S9B), whereas the BTB-BACK domain LZTR1 mutants, including LTZR1-L812P, showed diffuse cytoplasmic staining (Fig. 3D and fig. S9C).

(UNE) LZTR1 mutations in schwannomatosis and Noonan syndrome individuals. Missense LZTR1 mutations identified in our cohort of schwannomatosis patients are shown in blue. In the schematic, K indicates Kelch domain. See Fig. 2 legend for amino acid abbreviations. (B) Flag-tagged CUL3 purified from HEK293T cells was incubated with HA-tagged LZTR1-overexpressing cell lysates and then immunoprecipitated using anti-Flag resin. LZTR1 was detected by immunoblotting with anti-HA antibody. (C) Cross-linking reactions were performed using HA-tagged LZTR1 purified from HEK293T cells. LZTR1 was detected by immunoblotting using anti-HA antibody. () Immunostaining of HeLa cells expressing HA-tagged wt-LZTR1 or LZTR1 mutants with anti-HA antibody. Barre d'échelle, 10 m. (E) RAS proteins were immunoprecipitated with antibody against panRAS. LZTR1 was detected by immunoblotting with anti-HA antibody. (F) Colocalization of mCherry-NRAS and HA-tagged LZTR1 expressed in HeLa-Cas9/gLZTR1 cells. Values are means ± SEM. P values were detected by two-sided Student’s t test. (g) Ubiquitinated NRAS was purified from HEK293T cells expressing the indicated constructs by Co 2+ metal affinity chromatography and detected by anti-Flag antibody.

Missense mutations within the LZTR1 Kelch domain predicted to mediate substrate binding are also found in human disease. In co-IP assays, Kelch domain LZTR1 mutants showed decreased binding to RAS (Fig. 3E). The Kelch domain mutants, like wt-LZTR1, displayed punctate immunostaining, but only wt-LZTR1 led to relocalization of RAS to the LZTR1-CUL3–containing puncta, which represent loci of LZTR1-CUL3–mediated ubiquitination (Fig. 3F and fig. S9, D and E). Consistently, the LZTR1-L812P mutant, which does not form puncta, only weakly ubiquitinated RAS, as did the LZTR1-Y726* (Tyr 726 →Stop) mutant (Fig. 3G). Thus, disease-associated LZTR1 mutations appear to abrogate RAS ubiquitination by disrupting the formation of the RAS-LZTR1-CUL3 complex.

RAS ubiquitination affects RAS–mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling (17). Loss of LZTR1 led to increased RAS activity and phosphorylation of MEK1/MEK2 and ERK1/ERK2 in all tested model systems, whereas enhanced phosphorylation of V-Akt murine thymoma viral oncogene homolog (AKT) was cell dependent (Fig. 4A and fig. S10). After serum stimulation, Lztr1 −/− MEFs showed higher MEK1/MEK2 activity at all time points, whereas Lztr1 +/− MEFs had higher MEK1/MEK2 phosphorylation only at later time points (fig. S11A). Thus, Lztr1 abundance may fine-tune the activation of Ras signaling. Restoration of wt-LZTR1 expression in LZTR1-indel cells decreased MEK1/MEK2 activity (fig. S11B). Finally, LZTR1-mutated schwannomas showed strong staining of phosphorylated ERK1/ERK2 compared to wt-LZTR1 nerve trunk (fig. S11, C and D). The MEK1 inhibitor pimasertib abolished the colony growth difference between wt-LZTR1 and LZTR1-mutant cells (fig. S11E). Pimasertib treatment also rescued the embryonic lethality of Lztr1 −/− mice (Fig. 4B). Thus, LZTR1-mediated phenotypes arise, at least in part, from increased RAS signaling.

(UNE) MEFs isolated from three Lztr1 +/+ and three Lztr1 −/− embryos were serum-starved, stimulated with 10% serum, and analyzed by immunoblotting. Values are means of phosphorylated (p) relative to nonphosphorylated protein levels ± SEM. P values are from a two-way ANOVA. (B) Progeny from the indicated Lztr1 +/− matings. Pregnant mice were treated with pimasertib starting from E7.5. (C) Quantitative ubiquitome analysis of Lztr1 +/+ et Lztr1 −/− MEFs. FDR, false discovery rate. () Ubiquitinated RAS was purified from HEK293T cells expressing the indicated constructs by Co 2+ metal affinity chromatography and detected by immunoblotting. (E) The PLA analysis of wt-Hras and Hras-K170R MEFs expressing shGFP or shLztr1 using antibodies against panRAS and Ub. Red, PLA signal blue, 4′,6-diamidino-2-phenylindole scale bar, 10 μm. (F) HEK293T cells expressing the indicated constructs were serum-starved overnight, stimulated with 10% serum, and analyzed by immunoblotting. Values are means of phosphorylated relative to nonphosphorylated protein levels ± SEM m = 3. P values are from a two-way ANOVA. (g) Snapshots of Ub-conjugated RAS at the lipid bilayer composed of 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) and 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) lipids (3:1 molar ratio). (H et je) Immunoblotting of the membrane and cytoplasmic fractions isolated from HeLa cells expressing shGFP and shLZTR1 (H) or wt-Hras and Hras-K170R MEFs (I). HSP70, heat shock protein 70.

Although our MS analysis detected Ras ubiquitination at several lysines, loss of Lztr1 abrogated ubiquitination of Ras only at K170 (Fig. 4C). Thus, ubiquitination of Hras at K170 may specifically require Lzrt1. Indeed, though LZTR1 depletion hindered ubiquitination of wt-HRAS, it did not affect ubiquitination of the HRAS-K170R mutant (Fig. 4D). Loss of LZTR1 also abolished the difference in Ras ubiquitination between wt-Hras and Hras-K170R MEFs (Fig. 4E and fig. S12A). Nonetheless, the LZTR1-CUL3 complex did ubiquitinate mutant HRAS-K170R in vitro (fig. S6A). The site specificity in vivo could be directed by anchoring of RAS to the membrane. Moreover, overexpression of the HRAS-K170R mutant led to higher activation of ERK1/ERK2 than did overexpression of wt-HRAS, and LZTR1 depletion did not affect ERK1/ERK2 activity in cells overexpressing HRAS-K170R (Fig. 4F and fig. S12B). K170R knock-in MEFs also showed increased MAPK signaling and growth rates (fig. S12, C and D). Collectively, these data indicate that LZTR1-mediated ubiquitination of RAS at K170 suppresses RAS-MAPK signaling.

Ubiquitination of RAS can inhibit its activity by triggering its degradation (18). However, quantitative MS analysis did not reveal an increase in RAS protein abundance in Lztr1 −/− MEFs (fig. S6G). wt-LZTR1 and LZTR1-indel Schwann cells treated with the protein synthesis inhibitor cycloheximide also showed similar RAS stability (fig. S12E), Thus, LZTR1 regulates RAS by a nondegradative mechanism. Ubiquitination of RAS also induces its relocalization to endomembranes (19, 20). However, LZTR1 overexpression increased the endomembrane fraction of both wt-RAS and the HRAS-K170R mutant (fig. S12F). LZTR1 alone also only slightly increased RAS ubiquitination (Fig. 2D) and did not affect the MAPK pathway (fig. S12G), suggesting that LZTR1 overexpression promotes endomembrane localization of RAS independently of its ability to mediate ubiquitination at K170.

To assess how ubiquitination of RAS at K170 controls its activity, we elucidated modes of the interaction between RAS and conjugated Ub. LZTR1 colocalized with NRAS at RAB11–Transferrin receptor–positive recycling endosomes (fig. S13), suggesting that LZTR1 regulates ubiquitination of farnesylated and palmitoylated RAS. Therefore, we performed molecular simulations on lipidated RAS. In the initial structures of Ub conjugated to K170 of RAS, the hypervariable regions (HVRs) of RAS exposed their anchor portions to the solution. The long-lasting simulations showed that Ub secured the anchor portion of the HVR by sequestering the farnesyl and palmitoyl groups (fig. S14). Concordantly to a rapid kinetics of spontaneous insertion of lipidated RAS into the membrane (2124), the HVRs of nonubiquitinated RAS straightforwardly associated with membranes. However, Ub conjugation to K170 of RAS prevented the HVRs from binding to and inserting into membranes (Fig. 4G). Thus, ubiquitination at K170 may disrupt the association of RAS to the membrane. Indeed, loss of LZTR1 or Hras-K170R knock-in increased the fraction of membrane-bound RAS (Fig. 4, H and I, and fig. S15). These results are all consistent with RAS ubiquitination at K170 inhibiting RAS activity by impairing its association with the membrane.

Our results indicate that LZTR1-mediated ubiquitination of RAS on K170 modulates RAS activity, dysregulation of which leads to human disease. An accompanying study shows that LZTR1 dysregulation also confers drug resistance (25). Understanding this unconventional mechanism of RAS activation may help to identify patients who might benefit from RAS pathway inhibitors and inform new therapeutic approaches for these patients.


Genetic Insights into Mammalian Cytoplasmic Dynein Function Provided by Novel Mutations in the Mouse

Anna Kuta , . Elizabeth M.C. Fisher , in Dyneins , 2012

18.10 Using Mouse Genetics to Further Unravel the Role of the Cytoplasmic Dynein Heavy Chain

Mouse mutants have given and will continue to give novel insight into the role of cytoplasmic dynein, insights that would have been impossible to gain from in vitro études. In addition, one aspect of working with genetic mouse models that can give information about the interactions of proteins of interest is to cross different mouse strains and analyze the phenotype of the resulting progeny. In 2005, heterozygous Dync1h1 Loa/+ mice were crossed with the SOD1 G93A transgenic mice [16] . The latter strain (TgSOD1 G93A ) carries a human transgene array of a mutant superoxide dismutase 1 gene, which is causative for ALS in both humans and mice. TgSOD1 G93A mice typically die at about 125 days of age (depending on genetic background) from motor neuron loss and with pathophysiological symptoms resembling ALS in humans.

Somewhat surprisingly, the double mutant progeny that carried the human transgene array and the Loa mutation in Dync1h1 lived for 28% longer than their TgSOD1 G93A littermates or parents. The double mutants had a delay in disease onset and death, although a similar time course of disease. Axonal transport was analysed in embryonic motor neurons derived from progeny of the cross, using a fluorescently labeled fragment of the tetanus toxin. This showed two surprising results: axonal retrograde transport in TgSOD1 G93A was delayed compared to wild-type and Dync1h1 Loa/+ littermates, whereas it was faster in the TgSOD1 G93A –Dync1h1 Loa/+ double mutants [16] . This result may indicate an unexpected interaction, either direct or indirect, between Dync1h1 and mutant (and possibly wild-type) SOD1 [10,34] .

The extension of lifespan in TgSOD1 G93A –Dync1h1 Loa/+ double mutants was also shown by two other groups: Chen, Popko, and colleagues, who found a 21% increase in the lifespan of these mice compared to TgSOD1 G93A littermates [3] and Ilieva, Cleveland, and colleagues, who reported a 9% increase [14] . The latter group crossed their Dync1h1 Loa/+ mice with two other transgenic animals with different mutations in SOD1 that also give models of ALS they found no ameliorating effect of the dynein subunit mutation, which they suggest may reflect a difference in SOD1 protein levels in the transgenics.

Interestingly, Teuchert and colleagues reported that TgSOD1 G93A –Dync1h1 Cra1/+ double mutants also have a delayed disease onset compared to TgSOD1 G93A littermates [26] , but this effect is not seen in TgSOD1 G93A –Dync1h1 Swl/+ double mutants [3] , indicating that different members of this dynein subunit allelic series may well have different interactions. This also highlights the use of having an allelic series of mutants for helping to tease out protein–protein interactions that take place in different domains.

New research indicates that the role of the dynein HC mutation in ameliorating the effect of the TgSOD1 G93A transgene may lie in a surprising alteration in mitochondrial function that is found in the Dync1h1 Loa/+ and TgSOD1 G93A –Dync1h1 Loa/+ double mutant mice [10] . Morsi El-Kadi, Hafezparast, and colleagues have shown that in the double mutants the Dync1h1 Loa mutation leads to a significant reduction in the amount of toxic SOD1 G93A protein in the mitochondrial matrix, resulting in amelioration of the defects in mitochondrial membrane potential and respiration. The precise mechanism by which mutant dynein affects the differential deposition of SOD1 G93A in the double mutants and its role in ameliorating mitochondrial function is not understood yet. But, taking into account the role of dynein in mitochondrial transport and possibly mitochondrial fission [30] , it is likely that the Dync1h1 Loa mutation improves the transport of mitochondria and that the improved transport could make them less prone to mutant SOD1 association, leading to ameliorated membrane potential and respiration and/or reducing the association of mutant SOD1 protein with the mitochondrial membranes via an as-yet-unknown mechanism thus, the Dync1h1 Loa mutation could restore the docking of dynein (and kinesin) to the mitochondria to improve its transport ( Fig. 18.6 ) [10,29] .

Figure 18.6 . Effets de la Dync1h1 Loa mutation on the TgSOD1 G93A mouse phenotype. mSOD1, mutant SOD1 ●, mSOD1 aggregates ?, not tested yet.

The unexpected outcome of crossing the Dync1h1 Loa/+ and TgSOD1 G93A mice has prompted other crosses with the dynein HC subunit mutants. Ravikumar, Acevedo-Arozena, Rubinsztein, and colleagues crossed the Dync1h1 Loa/+ mouse with a mouse model of the neurodegenerative disorder Huntington’s disease (Hdh HD/+ ) [23] . They found that the Huntington’s phenotype, including tremor onset, motor coordination, and muscle function, was enhanced in compound heterozygote animals. This effect likely resulted from effects of the dynein mutation on the autosome–lysosome fusion process – showing a potential novel role for the dynein HC subunit in this pathway.

In other mouse models of neurological disorders, the Dync11h Loa/+ has had no effect on phenotype [2] .


Fichiers supplémentaires

Fichier supplémentaire 1 :

Sequences of each gene and CRISPR/Cas9-induced mutants or synthesized templates used in all experiments.

Fiche complémentaire 2 : Tableau S1.

List of primers used in this study.

Additional file 3: Fig. 1.

The yield of temperature gradient PCR with different single point mutation templates of NtCRTISO (synthesized) and different combination of primers was detected by agarose gel electrophoresis.

Additional file 4: Fig. 2.

The yield of temperature gradient PCR with different multiple point mutation templates of NtCRTISO (synthesized) and different combination of primers was detected by agarose gel electrophoresis.

Additional file 5: Fig. 3.

Identification of CRISPR/Cas9-induced crtiso mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 6: Fig. 4.

The sequencing and sequences analysis of different clones of NtCRTISO transgenic lines.

Additional file 7: Fig. 5.

Identification of CRISPR/Cas9-induced myb86 mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 8: Fig. 6.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtMYB86.

Additional file 9: Fig. 7.

Identification of CRISPR/Cas9-induced ggpps1 mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 10: Fig. 8.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtGGPPS1.

Additional file 11: Fig. 9.

Identification of CRISPR/Cas9-induced rin4 mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 12: Fig. 10.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtRIN4.

Additional file 13: Fig. 11.

Identification of CRISPR/Cas9-induced pvy mutants in tobacco by MSBSP-PCR.

Additional file 14: Fig. 12.

The sequencing and sequences analysis of different transgenic lines of NtPVY.


Voir la vidéo: Les Mutations Génétiques (Janvier 2023).