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Spores bacillus subtilis dans le lait

Spores bacillus subtilis dans le lait


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Je dois inoculer des spores dans du lait et ensuite compter sur l'assiette. Je ne vois jamais de spore, alors comment la reconnaître à partir de la cellule germinale ? est-ce que quelqu'un connaît la procédure et s'il y a des différences par rapport à un compte normal dans les colonies de gélose?


Si vous devez inoculer du lait avec un nombre connu de Bacillus subtilis spores alors vous devrez suivre un protocole de "sporulation" - (en me basant sur votre question, je ne suis pas sûr à 100% si c'est ce que vous voulez faire).

Cependant, veuillez trouver ci-dessous un protocole de sporulation, développé par les universités de Bonn et de Fribourg :

Sporulation

  1. Culture nocturne

    • Inoculer votre culture de Bacillus subtilis dans 4 ml LB-moyen
    • Laissez-les pousser une nuit à 37°C, 200 rpm
  2. Croissance exponentielle

    • Mesurez la DO600 de votre culture de nuit et diluez-la dans du milieu LB jusqu'à une DO600 d'environ 0,1-0,2/ml dans 10 ml de LB
    • Laisser pousser les cellules jusqu'à une DO600 de 0,8/ml (37°C, 200 rpm)
  3. Sporulation

    • Centrifuger 10 ml des cellules à 13 000 x g pendant 1 minute
    • Laver le culot avec 1 x PBS
    • Re-suspendre le culot dans 5 ml de DSM (Difco Sporulation Medium)
    • Laisser pousser les cellules pendant 24 heures à 37°C (200 rpm)
  4. Traitement au lysozyme (supplémentaire pour la purification des spores)

    • Traiter les échantillons avec du lysozyme (15 mg/ml) à une dilution de 1:6
    • Incuber 1h à température ambiante
    • Laver 6 fois avec 1 x PBS
  5. Supplémentaire:

    • compter les spores à l'aide d'une chambre de comptage améliorée Neubauer et faire des aliquotes avec un nombre défini de spores par aliquote (par exemple 100 millions de spores par 500 l)

(Remarque : utilisez toujours du DSM frais car le FeSO4 rouille lorsqu'il est en dilution)

Puis-je faire une mention particulière de la Bacillus subtilis Manuel ici qui a été élaboré par l'équipe iGEM et s'est avéré être une excellente ressource. Le protocole ci-dessus en a été tiré.

Une fois que vous avez le nombre de spores, vous pouvez ensuite inoculer le lait à votre convenance. Cependant, sachez que le lait, à moins qu'il ne soit complètement pasteurisé avant l'inoculation, n'est pas un produit stérile. Cela signifie que d'autres organismes peuvent se développer sur la gélose que vous décidez de mettre sur une plaque.


Résistance à la chaleur des spores de bacillus subtilis

Bacillus subtilis est un organisme modèle bien étudié qui est capable de former des endospores dormantes. Ces spores peuvent survivre à des conditions environnementales difficiles et sont donc une préoccupation majeure pour l'industrie alimentaire.

Dans cette recherche, l'accent est mis sur les isolats alimentaires de B. subtilis qui produisent des spores très résistantes à la chaleur. Le traitement thermique est couramment appliqué dans l'industrie alimentaire pour réduire la teneur en bactéries des produits, ce qui permet d'éviter la détérioration et d'allonger la durée de conservation des produits. De toute évidence, il existe une grande variation entre les résistances à la chaleur des spores entre différentes souches, et il a également été établi que les conditions de sporulation sont importantes pour déterminer les propriétés finales de résistance à la chaleur des spores [1,2].

Ce projet vise à identifier les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la résistance à la chaleur des spores. Après avoir établi les différences de résistance à la chaleur des spores entre les souches, une caractérisation phénotypique et génotypique des souches extrêmement résistantes à la chaleur sera effectuée.


Introduction

La présence omniprésente de spores bactériens dans la nature peut être largement attribuée à leur capacité à produire des endospores (spores) qui peuvent survivre à des conditions environnementales difficiles (Nicholson et al., 2000 Setlow, 2006). Les spores bactériennes peuvent entrer dans la chaîne alimentaire à partir de nombreuses sources différentes, par exemple via le sol, la poussière et les biofilms (Heyndrickx, 2011). Les propriétés intrinsèques de résistance des spores peuvent entraîner leur survie lors de la transformation des aliments, dans laquelle le chauffage est l'un des traitements les plus couramment appliqués pour réduire les charges bactériennes. De tels traitements exercent une pression sélective sur la microflore présente, permettant la survie des souches produisant des spores très résistantes à la chaleur (Postollec et al., 2012). Les spores survivantes peuvent germer lors de l'exposition à certains déclencheurs environnementaux, et peuvent ensuite reprendre la croissance végétative, entraînant potentiellement une pathogénicité ou une détérioration des aliments, selon l'espèce (Scheldeman et al., 2006 Wells-Bennik et al., 2016).

Spores d'espèces mésophiles appartenant à la B. subtilis se trouvent couramment dans divers ingrédients alimentaires et produits alimentaires. Les B. subtilis groupe comprend l'espèce B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. vallismortis, B. mojavensis, B. atropheus, et B. sonorensis, qui sont phylogénétiquement proches, mais distinguables (Logan et Vos, 2009). Ces espèces peuvent généralement croître entre des températures de 30 ° 201350 ° °C, avec des températures de croissance rapportées de B. licheniformis jusqu'à 58ଌ (Warth, 1978). Les spores de B. subtilis, B. amyloliquefaciens et B. licheniformis se trouvent couramment dans divers ingrédients et produits alimentaires, notamment le cacao, les herbes, les épices, le pain, les soupes, le lait et les poudres de lait (te Giffel et al., 1996 Oomes et al., 2007 Lima et al., 2011 L࿌king et al., 2013 Miller et al., 2015). Ces espèces sont par exemple des contaminants bien connus des matières premières utilisées dans la fabrication du pain (Rosenkvist et Hansen, 1995 Sorokulova et al., 2003), et les spores peuvent même potentiellement survivre au processus de cuisson du pain (Valerio et al., 2015). Après la survie des spores, la germination et l'excroissance, les cellules végétatives de B. amyloliquefaciens, B. subtilis ou B. licheniformis peut entraîner des produits alimentaires avariés. B. subtilis, par exemple, a été signalée comme étant présente dans le cacao (Lima et al., 2011) conduisant à des boissons chocolatées avariées, B. licheniformis peuvent être présents dans le lait et les poudres de lait entraînant la détérioration des produits laitiers traités thermiquement (Gopal et al., 2015), et B. amyloliquefaciens peut gâcher le pain, ce qui donne du pain filé par la dégradation de l'amidon et la formation de polysaccharides extracellulaires (Sorokulova et al., 2003 Valerio et al., 2012, 2015). Certaines souches de B. licheniformis peut produire une toxine, la lichenisyne A, qui peut provoquer des maladies d'origine alimentaire (Salkinoja-Salonen et al., 1999 Nieminen et al., 2007 Logan, 2012). La lichenisyne est un lipopeptide non synthétisé par des ribosomes qui est thermostable (Konz et al., 1999). En raison du potentiel pathogène des souches de B. licheniformis, il est essentiel de contrôler ces spores dans la chaîne alimentaire (Madslien et al., 2013).

Des différences notables ont été observées en ce qui concerne les propriétés de résistance à la chaleur humide des spores des souches dans le B. subtilis (Kort et al., 2005 Oomes et al., 2007 Lima et al., 2011 Berendsen et al., 2015). Suite à une analyse détaillée de la résistance à la chaleur des spores de 14 souches appartenant à la B. subtilis groupe, les souches pourraient être divisées en deux groupes en fonction de la résistance à la chaleur des spores (Berendsen et al., 2015). Pour B. subtilis souches, il a été récemment démontré que les spores ayant une résistance thermique élevée contiennent un Tn1546 transposon, englobant un spoVA opéron directement responsable de ce phénotype (désigné spoVA 2mob , où mob indique la présence sur un élément génétique mobile Berendsen et al., 2016a). De plus, nous avons observé une résistance thermique élevée des spores de B. licheniformis et B. amyloliquefaciens souches qui portaient le Tn1546 transposon, les spores de ces souches ont montré des niveaux de résistance à la chaleur similaires à ceux des spores de B. subtilis souches avec un Tn1546 transposon (Berendsen et al., 2015, 2016a).

Dans cette étude, nous rapportons la présence et la composition de Tn1546 homologues de transposon de B. subtilis trouvés dans des souches de B. amyloliquefaciens et des souches de B. licheniformis qui produit des spores très résistantes à la chaleur. Ceci a été réalisé par analyse du génome ou détection par PCR. Les spoVA 2mob opérons trouvés dans B. amyloliquefaciens et B. licheniformis ont été introduits dans B. subtilis pour évaluer leur rôle dans la résistance à la chaleur des spores. De plus, les températures de croissance de tous B. amyloliquefaciens et B. licheniformis souches (neuf chacune) avec ou sans le Tn1546 les transposons ont été évalués.


Analyse des facteurs qui influencent la sensibilité des spores de Bacillus subtilis aux produits chimiques endommageant l'ADN

Objectifs : Élucider les facteurs influençant la sensibilité des spores de Bacillus subtilis aux produits chimiques endommageant l'ADN.

Méthodes et résultats : Les spores de type sauvage de B. subtilis fabriquées à des températures plus basses étaient plus sensibles au formaldéhyde et à l'acide nitreux chimiques qui endommagent l'ADN que les spores fabriquées à des températures plus élevées, mais ce n'était pas le cas avec les agents d'alkylation de l'ADN éthylméthanesulfonate et méthylméthanesulfonate. Les spores dépourvues de la plupart des protéines protectrices de l'ADN de type alpha/bêta, petites protéines solubles dans l'acide (appelées spores alpha-bêta) fabriquées à des températures plus basses étaient également plus sensibles à la destruction par les dommages causés à l'ADN par le peroxyde d'hydrogène que les spores alpha-bêta fabriquées à des températures plus élevées. températures. L'enveloppe des spores, dont la composition varie considérablement avec la température de sporulation, n'a joué qu'un rôle mineur dans la résistance des spores à ces agents endommageant l'ADN. Les spores fabriquées à des températures plus basses présentaient une perméabilité plus élevée à la méthylamine et germent plus rapidement avec le tensioactif dodécylamine que les spores fabriquées à des températures plus élevées. Le traitement des spores avec l'agent oxydant hydroperoxyde de cumène a sensibilisé les spores survivantes à tous ces agents endommageant l'ADN. La composition en acides gras de la membrane interne des spores fabriquées à différentes températures différait significativement, mais les niveaux d'acides gras insaturés dans la membrane interne n'ont pas influencé la résistance des spores aux agents endommageant l'ADN ou la sensibilisation à ces agents par traitement préalable avec de l'hydroperoxyde de cumène.

Conclusion : Les taux plus élevés de perméation de la méthylamine à travers la membrane interne des spores fabriquées à des températures plus basses et la plus grande sensibilité des spores de type sauvage fabriquées à des températures inférieures au formaldéhyde et à l'acide nitreux et des spores alpha-bêta fabriquées à des températures inférieures au peroxyde d'hydrogène, tous agents qui doivent traverser la membrane interne de la spore pour endommager l'ADN dans le noyau de la spore, suggèrent que la perméabilité de la membrane interne est un facteur important influençant la sensibilité des spores à ces agents. La sensibilisation des spores aux produits chimiques endommageant l'ADN par un prétraitement avec un agent oxydant, un traitement qui augmente la perméabilité de la membrane interne de la spore, et la germination plus rapide de la dodécylamine des spores produites à des températures plus basses sont compatibles avec cette suggestion.

Importance et impact de l'étude : Les résultats de cette communication fournissent de nouvelles informations sur les facteurs qui influencent la résistance des spores des espèces de Bacillus aux produits chimiques qui tuent les spores en endommageant l'ADN des spores.


Méthodes d'inactivation physique pour Bacille spores

Traitement thermique conventionnel

Appert (1810) a démontré que le chauffage des aliments dans des récipients scellés pouvait conserver une stabilité de conservation pendant de longues périodes à température ambiante, et Bigelow et al. (1920) ont réalisé le premier modèle mathématique lié au traitement thermique en tant que cinétique d'inactivation des spores log-linéaire (Gould, 2006 Leuschner et Lillford, 2003).

Bacille des espèces à endospores sont présentes dans divers légumes épicés tels que l'ail, le gingembre et l'oignon. Un traitement à haute température dans une cornue peut être utilisé pour stériliser les spores résistantes à la chaleur. Bacille sont souvent présentes dans le lait cru et jouent un rôle important dans la détérioration du lait et des produits à base de lait, et l'utilisation d'un traitement à ultra-haute température (UHT) peut inactiver les spores intactes afin d'obtenir une longue durée de conservation dans la pièce température (Atrih et Foster, 2002 Crielly et al., 1994 Gould, 2006).

Les micro-organismes résistants à la chaleur tels que B. subtilis des spores dérivées du sol peuvent être présentes dans le lait de soja, et le traitement conventionnel à long terme à haute température du lait de soja fournit une inactivation suffisante pour ces spores. Cependant, les processus de chauffage impliquant l'autoclave et l'UHT affectent négativement la qualité du goût, de la couleur et de la texture en raison de la dénaturation des protéines et de la décomposition des nutriments à des températures élevées de 121 à 135 °C (Crielly et al., 1994 Leuschner et Lillford, 2003).

Le mécanisme de résistance des spores à la chaleur humide est inconnu, mais peut être à plusieurs composants, tels que les protoplastes de spores avec de faibles niveaux d'eau. De plus, la minéralisation des spores contribue à la résistance à la chaleur tout comme le calcium DPA. Contrairement à un manque de compréhension du mécanisme de résistance à la chaleur humide, les petites protéines solubles dans l'acide se liant à l'ADN sont une cause majeure de résistance à la chaleur sèche (Atrih et Foster, 2002 Crielly et al., 1994 Leuschner et Lillford, 2003).

Nouveau traitement thermique

Le chauffage ohmique basé sur le chauffage par résistance électrique aurait été utilisé pour inactiver les micro-organismes dans le lait en 1919 (Anderson et Finkelstein, 1919). Aujourd'hui, diverses études utilisant un courant alternatif basse fréquence de 500 Hz à 20 kHz au lieu d'un courant alternatif commercial de 50 à 60 Hz ont été menées et des conditions applicables à certains produits tels que la sauce en pâte et les croquettes de poisson ont été établies. Le chauffage ohmique avec un courant alternatif à basse fréquence est utile en raison de la stabilité et de l'efficacité énergétique accrues (Uemura et al., 2010).

Jusqu'à récemment, on pensait généralement que le chauffage ohmique tuait les micro-organismes par l'effet thermique d'une génération de chaleur uniforme et rapide. Cependant, de plus en plus de preuves suggèrent que des effets non thermiques peuvent se produire (Somavat et al., 2012). Les traitements ohmiques à des fréquences de 60 Hz et 10 kHz ont été comparés à un chauffage conventionnel à 121, 125 et 130 °C pendant quatre temps de maintien différents. Les deux traitements ohmiques ont montré une tendance générale d'accélération Géobacillus stearothermophilus inactivation des spores. On suppose que dans des conditions de température élevée, les oscillations du champ électrique des molécules d'acide dipicolinique polaire (DPA) et des protéines de spores peuvent conduire à une inactivation accélérée. Cependant, il existe très peu de littérature sur l'effet non thermique spécifique de l'électricité sur les spores bactériennes lors du chauffage ohmique. Une vérification biologique efficace du chauffage ohmique pour réaliser le plein potentiel du procédé nécessite de nouvelles méthodes d'analyse et d'interprétation. S'il y a un effet non thermique de l'électricité sur le chauffage ohmique, il peut potentiellement améliorer la qualité en réduisant la sévérité du processus (Somavat et al., 2012).

Uemura et al. (2010) ont étudié l'effet de l'inactivation de B. subtilis spores dans le lait de soja avec chauffage par radiofréquence (Uemura et al., 2010). Lors du traitement du lait de soja à une fréquence de 28 MHz, les résultats suivants ont été obtenus. Traitement de chauffage par radiofréquence réduit B. subtilis spores dans le lait de soja par quatre ordres logarithmiques à une température de sortie de 115 °C. Lors du traitement du lait de soja, le film de téflon recouvrant l'électrode empêchait efficacement l'entartrage. Le tofu fabriqué avec du lait de soja chauffé par radiofréquence avait une résistance à la rupture plus élevée que le tofu fabriqué avec du lait de soja chauffé conventionnel. Il a été conclu que le chauffage par radiofréquence pourrait être utilisé pour améliorer la sécurité du soja et la qualité du tofu (Uemura et al., 2010).

Traitement d'inactivation non thermique

L'attention récente s'est portée sur les méthodes d'inactivation microbienne non thermique basées sur divers types d'énergie physique tels que les hautes pressions, les ultrasons, les champs électriques à haute tension et le plasma froid pour inactiver les bactéries entéropathogènes d'origine alimentaire et les champignons de détérioration liés à la détérioration de qualité et sécurité (Cho et al., 1999 Hayakawa et al., 1998 Marquez et al., 1997 Mendes-Oliveira et al., 2019).

Cependant, les bactéries formant des endospores telles que B. subtilis présentent une résistance aux traitements physiques. De nombreuses nouvelles méthodes ont été étudiées récemment dans le but de surmonter la résistance de certaines spores aux méthodes d'inactivation non thermique (Tableau 2) (Cho et al., 1999 Hayakawa et al., 1998 Marquez et al., 1997 Moreau et al., 2000 Sawai et al., 1997 Vaid et Bishop, 1998 Warrimer et al., 2000). Une étude a examiné la destruction des spores bactériennes à l'aide d'un champ électrique pulsé à haute tension (HVPEF) (Marquez et al., 1997). Les résultats ont indiqué que Bacille les spores étaient endommagées lorsque l'intensité du champ électrique était ≥ 35 kV/cm. Le mécanisme de base de l'inactivation des spores a été expliqué par la polarité des impulsions, et les ions dans le cortex des spores deviendraient une couche de protection qui empêchait le rayonnement de pénétrer dans le noyau, et le cortex a été détruit par la polarisation interfaciale ionique cependant, le mécanisme exact n'était pas clair ( Marquez et al., 1997). Dans une autre étude, une méthode associée au champ électrique concentré à haute intensité (CHIEF) développée par l'Université du Minnesota a un potentiel considérable en tant que procédé commercial pour la pasteurisation non thermique des aliments liquides frais (Deng et al., 2013). La moyenne (± écart type) de l'inactivation microbienne après avoir soumis des échantillons de lait à un seul passage dans CHIEF était de 2,95 (± 0,35), 2,75 (± 0,25) et 0,18 (± 0,15) log UFC/ml pour Salmonelle, L. monocytogenes et spore de B. cereus, respectivement. L'effet d'inactivation du traitement en un seul passage pour Bacille moins de spores, mais des passages supplémentaires devraient entraîner une réduction plus importante des bactéries (Deng et al., 2013).

Hayakawa et al. (1998) ont signalé l'utilisation de la décompression rapide pour inactiver les spores tolérantes à la chaleur de B. stéarothermophile IFO 12550. En dessous de 400 MPa, les spores résistantes à la chaleur telles que B. stéarothermophilus n'a pas pu être stérilisé par une simple méthode de pressage (Amador-Espejo et al., 2014 Hayakawa et al., 1998). Cependant, lorsqu'une pression de 200 MPa a été appliquée à 75 °C pendant 60 min, le taux de destruction des spores était de 4 log CFU/ml. Ce processus d'inactivation a augmenté la perméabilité à l'eau à haute pression et à haute température en raison de la destruction physique de la couche de spores (Amador-Espejo et al., 2014 Hayakawa et al., 1998).

L'irradiation UV est efficace pour tuer les bactéries sporulantes qui contaminent la surface de diverses substances. Il a été établi que l'inactivation des cellules par irradiation UV est principalement due à l'effet fatal sur l'ADN. L'exposition au rayonnement UV peut provoquer un certain nombre d'effets néfastes tels qu'un flux ionique anormal, une perméabilité accrue de la membrane cellulaire et une dépolarisation de la membrane cellulaire (Cho et al., 2012 Gayán et al. 2013 Sun et al., 2016). UV254 a montré l'effet d'inactivation le plus fort, le niveau de B. subtilis les spores ont diminué d'environ 3,6 log de cycle après 3 min d'exposition et de 2,5 log de réduction des spores après 3 min d'exposition aux UV185 (Cho et al., 2012).

La lumière intense pulsée (IPL) est l'une des technologies de traitement non thermique qui applique des impulsions lumineuses intenses et à court terme à la surface des aliments. Le spectre utilisé par IPL est similaire à celui de la lumière solaire (170-2600 nm), mais l'intensité de la lumière est 20 000 fois plus forte. Cette lumière peut être appliquée sur les surfaces alimentaires ou les matériaux d'emballage pour tuer efficacement les micro-organismes avec une réduction logarithmique de 3 à 6 Bacille spores. Bien que le mécanisme d'inactivation de l'IPL n'ait pas été entièrement élucidé, il est généralement admis que la principale action létale de l'IPL peut être attribuée à des mécanismes photothermiques et/ou photochimiques associés à la modification chimique et au clivage de l'ADN (Anderson et al., 2000 Cho et al., 2012 Setlow, 2006).


Tuer les spores de Bacille espèces par le bromure de cétyltriméthylammonium

Peter Setlow, Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT 06030-3305, États-Unis.

École d'ingénierie des ressources et de l'environnement, Université des sciences et technologies du Jiangxi, Ganzhou, Chine

Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT, États-Unis

Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT, États-Unis

Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT, États-Unis

Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT, États-Unis

Peter Setlow, Département de biologie moléculaire et de biophysique, UConn Health, Farmington, CT 06030-3305, États-Unis.

Résumé

Pour étudier les effets du tensioactif cationique bromure de cétyltriméthylammonium (CTAB), un désinfectant, sur les spores de Bacille espèce.

Méthodes et résultats

La capacité du CTAB à déclencher la libération de Bacille L'important dépôt d'acide dipicolinique (DPA) des spores dans un chélate 1 : 1 avec Ca 2+ (CaDPA) et de tuer les spores a été étudié. Libération de CaDPA déclenchée par CTAB à partir de spores de Bacillus subtilis, Bacillus cereus et Bacillus mégaterium, mais n'a pas été suivie de l'achèvement de la germination. La libération de CaDPA déclenchée par CTAB a augmenté à des températures plus élevées et était optimale pour B. subtilis spores à pH 9,4 et 30 g ml -1 CTAB. CTAB a également tué Bacille comme le montrent les dénombrements sur plaque et la coloration vitale des spores dormantes traitées, et après leur germination. Cependant, B. cereus et B. mégaterium les spores étaient plus sensibles au CTAB que B. subtilis spores. Libération de CaDPA et destruction de spores isogéniques traitées au CTAB B. subtilis des mutants dépourvus de protéines de germination ont également été examinés et comparés aux effets de la dodécylamine germinante bien connue sur les spores, afin de déterminer comment le CTAB exerce ses effets sur les spores.

Conclusion

Les résultats de cette enquête ont montré que le CTAB tue les spores de trois Bacille espèce, peut-être en endommageant la membrane interne des spores, bien qu'il soit également possible qu'une certaine mort par cet agent suive son déclenchement de la germination des spores.

Importance et impact de l'étude

Les résultats de ce travail indiquent que le CTAB est également un désinfectant, mais aussi un sporicide, et peut être un complément utile dans la décontamination des spores, en particulier à des températures plus élevées.


Les spores de Bacillus thermoamylovorans à très haut niveau de résistance à la chaleur germent mal en milieu riche malgré la présence de ger Amas mais efficacement lors de l'exposition à l'acide calcium-dipicolinique

FIG 1 Comparaison du nombre de spores (log10 UFC/ml) obtenu par souche par cytométrie en flux et étalement sur BHI après un traitement thermique à 80°C pendant 10 min. Les comptes moyens de trois expériences indépendantes ont été tracés et les barres d'erreur affichent les écarts types.

Germination avec des germes nutritifs.

Figure 2 Quantification de l'efficacité de germination des spores par microscopie à contraste de phase. Les spores étaient soit activées par la chaleur (HA) ou non (n-HA) et exposées au BHI plus vitamine B12 (A), Ca-DPA (B) ou tampon Tris (témoin). La germination a été calculée comme le pourcentage de spores de phase sombre sur des images microscopiques à contraste de phase réalisées après 3, 6 et 24 h d'incubation avec le germinant (les images sont montrées pour 24 h seulement). Les pourcentages moyens de deux expériences indépendantes ont été tracés, y compris les barres d'erreur basées sur les écarts types. Barre d'échelle, 2 m.

Germination avec Ca-DPA.

Extraction du génome pour les gènes de germination.

FIG 3 Visualisation schématique des structures d'opéron prédites de ger(X1)abc et ger(X2)abc, codant pour des récepteurs germinatifs putatifs (A), cwlJ, gerQ, cwlJ2, et gerQ2, impliqué dans la germination du Ca-DPA (B), et cinq spoVA opérons, spo(VA1), spo(VA2), spo(VA3), spo(VA4), et spo(VA5) (C). Les sites de liaison du facteur sigma, ainsi que le seuil P valeurs utilisées pour leur prédiction, sont indiquées par des flèches noires. L'astérisque indique que cwlJ2 et gerQ2 ne sont présents que dans les souches B4064 et B4065 (A). Les spoVA opérons 2, 3 et 4 [spo(VA2), spo(VA3), et spo(VA4)] à côté de spoVA les gènes contiennent également des gènes codant pour des protéines hypothétiques, indiqués par des flèches gris clair, et des sites de liaison au facteur sigma internes prédits (C). Opéron spo(VA2), contenant le spo(VA2)C et spo(VA2) gènes, est situé à la limite du contig dans les génomes de tous les isolats alimentaires de B. thermoamylovorans. Ainsi, la séquence nucléotidique et les promoteurs prédits en amont des deux gènes qui codent pour des protéines hypothétiques (indiquées par h**) sont inconnus. Cependant, comme la séquence nucléotidique des deux h** gènes codant pour des protéines hypothétiques dans l'opéron spo(VA2) est très similaire à la séquence de h** gène devant le spo(VA3)C gène dans l'opéron spo(VA3), il est probable que les séquences en amont des opérons spo(VA2) et spo(VA3) sont similaires (C). Les échelles sous chaque partie de la figure indiquent les distances en paires de bases de nucléotides.

Inactivation et modélisation de la chaleur des spores.

Figure 4 (A à D) Graphiques d'inactivation par la chaleur des spores des souches de B. thermoamylovorans B4065 (A), B4166 (B), B4167 (C) et B4064 (D) à 110°C. (E et F) Pour la souche B4064, cette inactivation des spores a été en outre déterminée à 115 °C (E) et 120 °C (F). Pour toutes les souches, deux cultures de spores indépendantes ont été exposées à un traitement thermique, suivi d'une exposition au Ca-DPA (40 mM pendant 3 h) ou non avant le dénombrement des survivants. Les cercles vides et les carrés vides correspondent aux cultures de spores 1 et 2, respectivement, sans traitement Ca-DPA. Les cercles pleins et les carrés pleins correspondent aux cultures de spores 1 et 2, respectivement, avec un traitement Ca-DPA.

Contenu

Engagement envers la sporulation Modifier

Bien que la sporulation dans B. subtilis est induite par la famine, le programme de développement de la sporulation n'est pas lancé immédiatement lorsque la croissance ralentit en raison d'une limitation en nutriments. Diverses réponses alternatives peuvent se produire, notamment l'activation de la motilité flagellaire pour rechercher de nouvelles sources de nourriture par chimiotaxie, la production d'antibiotiques pour détruire les microbes concurrents du sol, la sécrétion d'enzymes hydrolytiques pour piéger les protéines extracellulaires et les polysaccharides, ou l'induction de la « compétence ' pour l'absorption d'ADN exogène pour la consommation, avec l'effet secondaire occasionnel que de nouvelles informations génétiques sont intégrées de manière stable. La sporulation est la réponse de dernier recours à la famine et est supprimée jusqu'à ce que les réponses alternatives se révèlent inadéquates. Même alors, certaines conditions doivent être remplies telles que l'intégrité des chromosomes, l'état de réplication chromosomique et le fonctionnement du cycle de Krebs. [1]

Nature de la réglementation Modifier

La sporulation nécessite beaucoup de temps et aussi beaucoup d'énergie et est essentiellement irréversible [2], ce qui rend crucial pour une cellule de surveiller efficacement son environnement et de s'assurer que la sporulation n'est lancée qu'aux moments les plus appropriés. La mauvaise décision peut être catastrophique : une cellule végétative mourra si les conditions sont trop dures, tandis que les bactéries formant des spores dans un environnement propice à la croissance végétative seront détrônées. [3] En bref, l'initiation de la sporulation est un réseau très étroitement réglementé avec de nombreux points de contrôle pour un contrôle efficace.

Deux régulateurs transcriptionnels, H et Spo0A, jouent un rôle clé dans l'initiation de la sporulation. Plusieurs protéines supplémentaires participent, principalement en contrôlant la concentration accumulée de Spo0A

P. Spo0A se situe à la fin d'une série de réactions de phosphotransfert interprotéique, Kin-Spo0F-Spo0B-Spo0A, appelée «phosphorelay». La régulation de ces différents facteurs contrôlant la concentration accumulée de Spo0A

P, et leurs interactions sont décrites en détail dans la figure 2 :

Dans le tableau ci-dessous, le terme 'Activateurs' fait référence aux gènes/protéines qui entraînent finalement l'initiation de la sporulation et 'Répresseurs' désigne ceux qui inhibent cette initiation de la sporulation.

Les spores font partie des cycles de vie d'un large éventail d'organismes tels que de nombreuses bactéries, plantes, algues, champignons et certains protozoaires. Dans Saccharomyces cerevisiae (Kingdom Fungi), l'ensemble des gènes précoces activant la sporulation est induit par Ime1 (Inducer of Meiosis 1) et un régulateur des gènes intermédiaires est Ndt80p. [4] De même, dans Dictyostelium discoideum (moisissure visqueuse), le SDF-2 et les cytokinines sont sécrétés au cours du développement tardif pour déclencher des voies de transduction du signal qui conduisent à une augmentation de l'activité de la protéine kinase dépendante de l'AMPc, PKA, qui déclenche une encapsulation rapide et assure la dormance des spores. [5]


Application de Bacillus subtilis en agriculture, biomatériaux et médecine

Parce que c'est un probiotique non pathogène, B. subtilis est souvent utilisé comme additif microbien pour améliorer la fonction intestinale chez les animaux. Il a été trouvé qu'il favorisait la croissance des animaux et prévenait les maladies [80]. Il peut être fabriqué sous forme d'endospores, qui pénètrent ensuite dans le tractus intestinal des animaux et se réactivent rapidement pour sécréter des protéases hautement actives, comme les lipases et les amylases dans le tractus intestinal supérieur, ce qui est utile pour dégrader les glucides complexes dans les aliments pour plantes. Par ailleurs, B. subtilis peut produire des polypeptides qui ont un effet antagoniste contre les agents pathogènes intestinaux, améliorant efficacement la digestibilité des aliments. De plus, il peut être utilisé dans la biorestauration de l'eau et prévenir les maladies chez les organismes aquacoles tels que les crevettes et les poissons [7]. Parce que B. subtilis est une bactérie aérobie, elle contribue à l'environnement anaérobie en consommant de l'oxygène dans les intestins, ce qui à son tour favorise la reproduction des bactéries dominantes dans l'intestin, maintenant l'équilibre écologique des intestins.

B. subtilis peuvent sécréter une variété de peptides antimicrobiens et de bactériocines de faible poids moléculaire, tels que la surfactine [81], la bacilysine [82] et la subtiline [83], qui ont une valeur potentielle dans le génie biomédical, l'alimentation et l'agriculture [84]. Peptides antimicrobiens de B. subtilis sont des outils thérapeutiques prometteurs, en raison de leur large activité et de leur activité de destruction rapide contre une variété d'agents pathogènes. Avec les problèmes croissants de résistance microbienne dus à l'utilisation non rationnelle des antibiotiques conventionnels, les peptides antimicrobiens joueront un rôle plus important dans le traitement des infections bactériennes [85]. Les peptides antimicrobiens présentent également les avantages de la sécurité et du respect de l'environnement. Ils sont largement utilisés comme additifs alimentaires dans l'agriculture et l'élevage pour améliorer la digestion des fibres animales et la santé intestinale. B. subtilis peut améliorer l'équilibre de la flore intestinale et a le potentiel d'améliorer la santé intestinale et l'efficacité de l'absorption des aliments. Des études ont montré que l'ajout B. subtilis les spores dans l'alimentation des bovins laitiers peuvent améliorer la production de lait et de protéines [86]. De plus, en ajoutant B. subtilis à l'alimentation des poules pondeuses peut améliorer leurs performances ainsi que la qualité de la coquille des œufs produits par les poules pondeuses âgées [87].

Les biofilms sont des communautés structurées de cellules étroitement associées qui constituent l'état prédominant de croissance bactérienne dans les environnements naturels et artificiels [88]. Les biofilms peuvent être utilisés pour produire des matériaux vivants dotés de fonctions d'auto-guérison, qui sont souhaitables pour de nombreux produits [89]. B. subtilis peut former des biofilms complexes et robustes et est une bonne souche modèle pour étudier la formation de biofilms. Des études récentes ont montré que les biofilms basés sur le mécanisme de la protéine amyloïde TasA dans B. subtilis présentent un comportement viscoélastique des hydrogels. Des études ont montré que les biofilms peuvent être fabriqués avec précision en diverses microstructures tridimensionnelles (3D) grâce à la technologie d'impression 3D et de microencapsulation [90]. Comparé aux matériaux chimiques, ce matériau vivant artificiel a une activité métabolique, une capacité d'auto-renouvellement et une programmabilité [89]. De plus, la capacité de B. subtilis former des biofilms favorise la synthèse de pentapeptide à détection de quorum et d'oxyde nitrique (NO), ce qui peut retarder le vieillissement de l'hôte [91]. La formation de biofilm améliore la capacité des micro-organismes à métaboliser les nutriments et à produire des produits chimiques, et peut être utilisée pour améliorer la stabilité des processus de fermentation. Des études récentes montrent qu'un réacteur à biofilm peut favoriser la sécrétion extracellulaire de MK-7 [92].

Face à la famine, B. subtilis produit des endospores qui peuvent survivre longtemps dans un état d'anabiose. Et lorsque les nutriments sont disponibles, il germe à nouveau [93]. Cette caractéristique est propice à l'expression réussie d'antigènes hétérologues ou à l'augmentation de l'activité relative, de la thermostabilité, de la stabilité du pH et de la réutilisation des enzymes à la surface des spores. L'énorme résistance au stress des endospores peut être cooptée pour améliorer la stabilité et favoriser la réutilisation des enzymes dans des environnements complexes [94]. De plus, la technologie d'affichage à la surface des spores a récemment été appliquée avec succès dans la production de polymères protéiques, de vaccins et d'enzymes industrielles [95]. Des enzymes telles que la lipase et la chitinase ont été exprimées avec succès à la surface des endospores [94].

Conclusions et perspectives d'avenir

En tant que principale espèce modèle de bactéries Gram-positives, B. subtilis has a broad array of mature genetic tools, promoters, and plasmid expression systems, which can be used in metabolic engineering, protein expression, and synthetic biology. It can produce chemicals, enzymes, and other industrial bio-products, but also be used as a platform for vaccine preparation or a feed additive in agriculture. Moreover, it is also an ideal model for studying biofilm formation and other physiological characteristics of attached cells. This paper reviewed the advantages of B. subtilis as a chassis cell from several aspects, including genetic manipulation, and heterologous gene expression, as well as its application in industry, agriculture, and medicine.

Cependant, bien que B. subtilis has various attractive applications, it remains far less studied than its Gram-negative counterpart, E. coli. This remains true even in the present era with rich methodology and rapid tool development. One major bottleneck in the application of new methods attribute to the lower efficiency of plasmids construction in B. subtilis compared with E. coli. To solve this, future engineered strains of B. subtilis can be developed to allow direct plasmid construction. Conversely, the high recombination rate of B. subtilis has some advantages for the development of genome editing tools.

Our goal was to provide reads with a general understanding of the characteristics of B. subtilis, so one can take advantage of its features for certain applications or research purposes. Of course, as more and more scientists and engineers contribute studies on B. subtilis, more technologies, tools, and methods will be applied to B. subtilis in the future, and the potential of this bacterium for scientific and industrial applications will be enhanced further.


Voir la vidéo: Intro Bacillus subtilis ISO8 (Novembre 2022).