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Un numéro de gène flybase (FBgn), de nombreux identifiants Affymetrix

Un numéro de gène flybase (FBgn), de nombreux identifiants Affymetrix


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J'essaie de convertir un ensemble d'identifiants Affymetrix, comme celui-ci 143053_at_3745, en Flybase Gene Numbers (FBgn) comme celui-ci FBgn0000015. J'ai téléchargé le fichier Flybase requis pour le faire (comme décrit ici), mais j'ai remarqué que la plupart des FBgn ont plus d'un identifiant Affy associé.

Ma question est, comment puis-je savoir lequel attribuer à mes données ? Dans la liste des identifiants affy que j'ai, comment puis-je étiqueter chacun avec le approprié FBgn ? J'utilise les données des Ayroles et al 2009 (DGRP) qui ont une colonne AffyID qui ressemble à celles du fichier Flybase mais plus courte (1638273_at). Peut-être que je ne comprends pas pourquoi il y en aurait plus d'un.

Certains ont un identifiant affy qui est répété sur 15 colonnes dans le fichier, tandis que d'autres semblent avoir plusieurs identifiants affy qui leur sont associés.

Quelques questions que ce problème soulève :

Pourquoi un identifiant FBgn singulier a-t-il plusieurs identifiants affy associés ?

Pourquoi certains ensembles de données, comme celui que je possède, ont-ils des versions plus courtes de l'identifiant affy ?

Où puis-je trouver une liste à jour et appropriée correspondant correctement à ces identifiants Affy et aux identifiants FBgn ?


Je peux répondre à ceci - je n'ai peut-être pas le temps de creuser dans le fichier que vous indiquez… mais voici quelques explications - lmk si vous avez besoin de plus.

Les noms plus courts (123456_at) sont les noms d'origine des ensembles de sondes donnés par Affymetrix. Le fichier sur lequel vous posez des questions a été étendu aux fins de FlyBase et je ne suis que vaguement conscient de son existence. Il semble que Flybase ait essayé de renommer l'ensemble de sondes en une liste de gènes minimale et de créer des mappages moins ambigus. Je ne le connais pas. Si j'ai le temps, j'essaierai de le regarder et de mettre quelque chose ici, mais je suis assez claqué cette semaine.

En général, vous devez savoir qu'il existe une relation plusieurs à plusieurs entre les ensembles de sondes des puces et les gènes.

Il y a plusieurs raisons à cela. Les raisons les plus courantes :

Plus d'un jeu de sondes par gène 1) Plus d'une séquence de départ par gène. Les puces IVT telles que celles que vous regardez ne lisent que l'extrémité 3' du gène. S'il y a plus d'une telle terminaison, vous aurez plus d'un ensemble de sondes. 2) Gènes en double. Si l'extrémité 3' du gène a été dupliquée récemment, un ensemble de sondes peut lire plus d'un gène et ne pas être en mesure de les distinguer, il aura donc les deux références de gènes dans ses fichiers d'annotation. 3) Ensembles de sondes en double. Pour les matrices plus anciennes, cela s'est produit lorsque les sondes de deux ensembles de sondes seront pour la plupart ou entièrement les mêmes. 4) des gènes autrefois séparés sont maintenant réunis en un seul gène. Ceci est similaire à (1) ci-dessus, mais avec la raison supplémentaire que deux transcrits voisins vus séparément au moment de la conception du réseau sont actuellement connus pour faire partie du même transcrit. C'est une chose à laquelle nous ne pensons souvent pas, mais la puce a peut-être été conçue avant que votre gène d'intérêt actuel n'ait une séquence complète.

Dans plusieurs cas, le comportement de transcription des deux ensembles de sondes sera assez différent et vous pouvez décider lequel prendre en fonction de son comportement expérimental. par exemple, l'un des ensembles de sondes peut ne jamais répondre tandis qu'un autre peut enregistrer des changements importants avec les conditions de l'échantillon biologique. Désolé, je ne peux pas être plus utile ici. Il y a trop de scénarios possibles à considérer pour écrire de manière convaincante.

Plus d'un gène par ensemble de sondes 1) un seul tronçon d'ADN, même sur le même brin, peut simplement être associé à plus d'un gène et l'ensemble de sondes les lira tous les deux. 2) Même s'ils ne sont pas exactement les mêmes, certains gènes se ressemblent par une séquence nucléotidique impossible de choisir des sondes qui ne les lisent pas tous les deux.

Comme ils ont une longueur de lecture similaire à celle d'un ensemble de sondes, tout cela est également vrai dans une certaine mesure pour les séquenceurs NGS à lecture courte dans les données RNASeq.

Comme vous pouvez le constater, l'ambiguïté est quelque chose à laquelle vous devez vous attendre dans une certaine mesure lorsque vous décidez de travailler avec un système biologique. Dans de nombreux cas (~ 80%), vous aurez un seul gène lu par ensemble de sondes, mais avec ces chances, vous regarderez le navigateur de génome pour une demi-douzaine de vos résultats expérimentaux préférés.


Un numéro de gène flybase (FBgn), plusieurs identifiants Affymetrix - Biologie

Classification - protéase spécifique de l'ubiquitine

Le système visuel de la drosophile fournit un système génétique puissant pour analyser les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régulent la sélection des cibles axonales. L'œil composé comprend

750 ommatidies, chacune contenant huit neurones photorécepteurs (cellules R R1-R8). Chaque classe de cellules R forme des connexions spécifiques avec les neurones de deux ganglions différents du lobe optique, la lame et la moelle. Les axones R1-R6 se terminent dans la lame, tandis que les axones R7 et R8 traversent la lame et s'arrêtent dans la moelle. Lorsque les axones des cellules R pénètrent dans la lame, ils rencontrent à la fois des cellules gliales et des neurones. non-stop (codant une protéase spécifique de l'ubiquitine) a été isolé dans un criblage génétique pour les défauts de projection des cellules R (Martin, 1995). non-stop est nécessaire pour le développement des cellules gliales et hedgehog pour le développement neuronal. L'élimination des cellules gliales mais pas des neurones perturbe le ciblage R1-R6. Il est proposé que les cellules gliales fournissent le signal d'arrêt initial favorisant la terminaison du cône de croissance dans la lame. Ces découvertes révèlent une nouvelle fonction des interactions neurones-gliales dans la régulation de la spécificité de la cible (Poeck, 2001).

La sélection de la couche cible se produit pendant le développement larvaire. À ce stade, la zone cible de la lame se compose de cellules gliales et de neurones. Les cônes de croissance R1-R6 se terminent entre les rangées de cellules épithéliales et gliales marginales. Les corps cellulaires des neurones laminaires forment des colonnes au-dessus du plexus laminaire. Ces neurones représentent les futurs partenaires synaptiques des axones R1-R6 chez l'adulte. Bien que les cônes de croissance des cellules R se terminent dans le plexus laminaire de la larve, ils ne forment des synapses que quatre jours plus tard, au cours de la seconde moitié du développement nymphal (Poeck, 2001).

La formation du motif de projection des cellules R repose sur des interactions bidirectionnelles complexes entre les axones des cellules R et différentes populations de cellules dans la cible. Les axones des cellules R fournissent des signaux antérogrades (y compris le ligand Hedgehog et Spitz) pour induire la prolifération et la différenciation des neurones lamina ainsi que la différenciation et la migration des cellules gliales. À leur tour, les neurones de la lamina, les cellules gliales ou les deux types de cellules peuvent alors fournir des signaux rétrogrades agissant comme des signaux de guidage pour les axones des cellules R. Les gènes codant pour les récepteurs, les molécules de signalisation et les facteurs nucléaires qui agissent dans les cellules R contrôlent la sélection des cibles. Ni les signaux de ciblage ni les cellules qui les produisent dans la lame n'ont été identifiés. Alors qu'il a été proposé que les cellules gliales agissent comme cibles intermédiaires pour les cônes de croissance R1-R6, sur la base de leurs positions caractéristiques dans la lame, cette hypothèse n'a pas été abordée de manière critique. Il a été démontré que la perte de cellules gliales mais pas de neurones à un stade précoce du développement du limbe entraîne un mauvais ciblage de R1-R6. Ces résultats fournissent la preuve que les cellules gliales peuvent réguler la spécificité de cible des connexions neuronales (Poeck, 2001).

Non-stop est exprimé dans le cytoplasme des cellules du lobe optique et du cerveau central. Des niveaux d'expression plus élevés, cependant, sont observés dans les cellules précurseurs de lamina mais pas dans les neurones lamina différenciés. Non-stop est également exprimé à des niveaux plus élevés dans les cellules gliales marginales, épithéliales et médullaires adjacentes au plexus laminaire. Sur la base du modèle d'expression, sans arrêt pourrait fonctionner dans les LPC pour contrôler à la fois le ciblage R1-R6 et la migration des cellules gliales. Alternativement, sans arrêt pourrait fonctionner directement dans les cellules gliales de la lamina pour favoriser leur migration. Un objectif de recherche était de distinguer entre ces possibilités deux approches génétiques différentes ont été utilisées. Premièrement, la capacité d'expression ciblée de sans arrêt aux cellules gliales a été évaluée, en utilisant le système GAL4/UAS pour sauver les phénotypes mutants. Depuis l'expression basale de l'UAS-sans arrêt (c'est-à-dire, en l'absence de GAL4 entraîné dans les cellules gliales de la lamina) est suffisant pour sauver à la fois la migration des cellules gliales et les défauts de ciblage, cette approche pour résoudre le problème n'est pas possible. Par conséquent, le système FLP/FRT a été utilisé pour générer des clones de cellules gliales lamina ou de neurones (et leurs précurseurs) mutants homozygotes pour sans arrêt dans un autre type sauvage (pas 1 /+) arrière-plan. UNE choc thermique-FLP (hsFLP) transgène a fourni une recombinase dans les cellules mitotiquement actives dans la zone cible. Les animaux portaient un gène exprimé dans toutes les cellules, codant pour la protéine fluorescente verte sous le contrôle d'un promoteur d'ubiquitine (Ub-GFP). Suite à la recombinaison mitotique, sans arrêt les cellules mutantes homozygotes n'exprimaient pas la GFP Les cellules hétérozygotes exprimaient des niveaux modérés de GFP, car elles portent une seule copie du gène marqueur et les clones de type sauvage, portant deux copies de Ub-GFP, ont été identifiés par leurs niveaux d'expression plus élevés. sans arrêt les clones mutants homozygotes ont été comparés à des clones témoins créés de la même manière en utilisant un FRT de type sauvage à la place d'un pas 1 Chromosome FRT (Poeck, 2001).

Les complexes œil-cerveau ont été colorés avec mAb24B10 pour visualiser les axones des cellules R et avec anti-Repo pour identifier les cellules gliales. Environ 10 % de tous les animaux examinés contenaient des clones dans la zone cible. Chez les animaux mosaïques avec des clones dans les précurseurs du limbe et les neurones du limbe, le motif de projection des cellules R semblait normal. De plus, des rangées normales de cellules gliales épithéliales, marginales et médullaires de type sauvage se sont formées sous ces clones. Cela indique que sans arrêt n'est pas nécessaire dans les neurones lamina pour réguler le ciblage R1-R6 ou le développement des cellules gliales (Poeck, 2001).

Les cellules gliales sont générées dans les zones GPC et migrent vers leurs positions adjacentes au plexus laminaire. Dans environ la moitié des échantillons témoins de type sauvage, les clones de cellules gliales étaient de grande taille, contenant au moins cinq cellules épithéliales ou gliales marginales. Les zones GPC ont montré des clones de tailles variables, avec des cellules non marquées à côté de groupes de cellules marquées portant une ou deux copies de GFP. La région adjacente à la ligne médiane dorso-ventrale près de la surface du lobe optique semble donner naissance à des clones particulièrement grands. De plus, il a été observé que 21 des 23 clones étaient constitués à la fois de cellules épithéliales et de cellules gliales marginales, deux petits clones contenaient uniquement des cellules gliales épithéliales (Poeck, 2001).

Le nombre de sans arrêt les cellules épithéliales et gliales marginales mutantes bordant le lamina plexus étaient nettement réduites par rapport aux clones témoins. Dans les clones témoins de type sauvage, 203 cellules non marquées ont été comptées dans 23 clones. En revanche, dans sans arrêt clones mutants, il y avait 125 cellules dans 39 clones examinés. Cela représente environ une différence de 3 fois. De plus, pour les cellules gliales marginales, cette différence était de 10 fois dans les clones de type sauvage, il y avait 71 cellules dans 23 clones, alors qu'il y avait 11 cellules dans 39 sans arrêt clones mutants. Les sans arrêt les clones mutants et témoins dans la zone GPC étaient similaires en taille et en fréquence. Dans six cas, bien qu'homozygotes sans arrêt des clones étaient présents dans les zones GPC, il n'y avait pas de cellules gliales mutantes dans la cible. En revanche, des cellules épithéliales et gliales marginales non marquées ont été observées le long du plexus laminaire dans tous les clones de type sauvage examinés. Blocs de sans arrêt les cellules gliales mutantes n'ont jamais été observées adjacentes au plexus laminaire. Vraisemblablement, chez les animaux mosaïques, les cellules de type sauvage migrent dans ces régions, remplaçant efficacement les cellules gliales mutantes et sauvant le défaut de ciblage R1-R6 observé dans sans arrêt mutants. Ces données soutiennent un modèle dans lequel sans arrêt est nécessaire dans les cellules gliales, leurs précurseurs ou d'autres types de cellules dans la zone GPC pour la migration des cellules épithéliales et marginales de la GPC vers la zone cible (Poeck, 2001).

Alors que les études de mosaïque génétique ont établi que sans arrêt est nécessaire dans les cellules gliales pour leur migration, il restait formellement possible que sans arrêt était nécessaire dans les neurones de la lame pour médier la terminaison R1-R6 dans la lame. Pour évaluer de manière critique ce problème, des tentatives ont été faites pour éliminer les neurones lamina de la région cible. Si sans arrêt étaient nécessaires dans les neurones lamina, alors la suppression complète des neurones lamina devrait conduire à un ciblage erroné de R1-R6. hérisson 1 (hh 1 ) est une mutation régulatrice qui affecte spécifiquement le système visuel. Dans hh 1 ,

12 rangées d'amas de cellules R sont formées d'axones de cellules R, cependant, manquent de Hh et ne parviennent pas à induire les neurones lamina. A l'inverse, la migration et la différenciation des cellules gliales ne dépendent pas de la signalisation Hh. Un sous-ensemble d'axones R1-R6 a été visualisé dans hh 1 mutants, en utilisant le marqueur Ro-taulacZ. Ces axones se sont arrêtés dans le limbe, malgré l'absence de neurones du limbe, comme détecté à l'aide d'un anticorps contre le teckel. Le marquage avec mAb24B10 pour visualiser tous les axones des cellules R a révélé que le réseau de cônes de croissance R7 et R8 dans la moelle ne pouvait pas être distingué du type sauvage. Ces résultats démontrent que le ciblage initial des axones R1-R6 ne nécessite pas de neurones lamina (Poeck, 2001).

Les mécanismes contrôlant la migration des cellules gliales dans le limbe et les voies moléculaires impliquées ne sont pas connus. Cette sans arrêt code pour une protéase spécifique de l'ubiquitine suggère que les voies de dégradation des protéines peuvent jouer un rôle important dans ce processus. Dans la voie ubiquitine-protéasome, les protéines sont ciblées pour la dégradation en protéasome 26S après avoir été « marquées » avec l'ubiquitine. La modification de l'ubiquitine est réversible. La désubiquitination est catalysée par deux familles de protéases spécifiques, les hydrolases ubiquitine-C-terminales et les protéases spécifiques de l'ubiquitine (UBP). Bien que ces familles soient structurellement distinctes, elles ont des fonctions qui se chevauchent. Non-stop est apparenté à la deuxième famille en raison de deux séquences consensus conservées dans le domaine catalytique, les domaines Cys et His. Il a été démontré que les UBP jouent divers rôles en inhibant ou en stimulant la dégradation des protéines. Ils peuvent empêcher la dégradation des protéines et inverser la modification de l'ubiquitine pour « relire » les protéines ubiquitinées par erreur ou pour réguler la stabilité des protéines en antagonisant l'activité du protéasome. Il a également été découvert que les UBP stimulent la dégradation des protéines en modifiant la taille des chaînes de polyubiquitine, en libérant de l'ubiquitine après que la protéine a été ciblée sur le protéasome ou en désassemblant les chaînes de polyubiquitine pour restaurer le pool cellulaire d'ubiquitine libre (Poeck, 2001).

L'observation que des protéines ubiquitinées supplémentaires s'accumulent dans les larves mutantes est cohérente avec le fait que Non-stop agit en tant qu'UBP. De plus, l'amélioration des défauts de ciblage dans sans arrêt mutants résultant de l'élimination d'une seule copie d'un gène codant pour une sous-unité du protéosome suggère que Non-stop favorise la dégradation des protéines. Depuis la perte de sans arrêt entraîne un défaut spécifique dans le système visuel en développement, il peut réguler les niveaux de substrats spécifiques nécessaires à la migration des cellules gliales. En effet, une autre UBP de drosophile, l'ubiquitine-63E, contrôle indirectement la migration des cellules frontières au cours de l'ovogenèse en stabilisant le facteur de transcription C/EBP (Rørth, 2000). Il existe également un précédent pour la régulation dépendante de l'ubiquitine des protéines de signalisation, telles que les récepteurs de la surface cellulaire et les régulateurs du cytosquelette, qui peuvent être directement impliqués dans la migration cellulaire (Poeck, 2001).

sans arrêt Les mutations fournissent un réactif clé pour répondre aux besoins cellulaires du ciblage R1-R6. Perte de fonction sans arrêt les mutations perturbent sélectivement le développement des cellules gliales à un stade précoce. Pendant le temps que les cellules gliales sont générées dans la région précurseur, la migration dans la lame en développement est interrompue. En tant que telles, de grandes régions de la lamina cible sont appauvries en cellules gliales. Les analyses de mosaïque génétique soutiennent que le ciblage erroné de R1-R6 résulte d'une perte de cellules gliales dans la lame cible et non d'une exigence de sans arrêt dans les axones des cellules R ou les neurones laminaires. L'analyse de hérisson 1 des mutants dans lesquels la sélection des couches est normale en l'absence de neurones lamina. L'analyse génétique, cependant, ne permet pas d'exclure la possibilité formelle (bien qu'improbable) que sans arrêt fonctionne dans les cellules gliales dans deux processus distincts pour réguler la migration et le ciblage R1-R6 séparément (Poeck, 2001).

Les contributions relatives des cellules gliales épithéliales, marginales et médullaires dans le ciblage R1-R6 n'ont pas pu être déterminées, car toutes les trois semblent affectées dans sans arrêt mutants. Leur morphologie, cependant, suggère qu'ils ont des fonctions différentes. Les cônes de croissance R1-R6 dans le plexus laminaire sont en contact intime avec une frange dense de processus cellulaires gliaux provenant à la fois de la glie épithéliale et marginale, mais pas avec les processus de la glie médullaire. Il est probable que les cellules gliales marginales émettent les signaux d'arrêt, car les axones R1-R6 se développent au-delà des cellules gliales épithéliales mais se terminent le long de la face distale des cellules gliales marginales. De plus, les cellules épithéliales et gliales marginales peuvent fournir des signaux aux cônes de croissance R1-R6, les « maintenant » en place. L'oxyde nitrique (voir Drosophila Nitric oxide synthase) joue un rôle important dans le maintien de la position des axones R7 et R8 dans le neuropile médullaire au début du développement pupal, ce qui soulève la possibilité intrigante qu'un mécanisme similaire puisse maintenir les neurones R1-R6 dans la lame (Poeck , 2001).

En résumé, l'exigence de sans arrêt dans le développement des cellules gliales, l'échec des cônes de croissance R1-R6 à se terminer dans la lame dans sans arrêt mutants, et l'association étroite entre les cellules gliales de la lamina et les cônes de croissance R1-R6 dans le plexus lamina soutiennent que les cellules épithéliales et marginales gliales fournissent des signaux de ciblage pour les neurones R1-R6 (Poeck, 2001)

L'existence de cibles intermédiaires est essentielle pour générer des modèles spécifiques de connexions de cellules R. Ces cibles permettent de retarder la formation de connexions neuronales jusqu'à ce que les futurs partenaires synaptiques des cellules R, les neurones laminaires, se soient formés. Les axones R1-R6 se projettent du primordium de l'œil de manière séquentielle vers leur couche cible au cours du développement larvaire. Les cônes de croissance des cellules R au sein du même ommatidium forment un groupe serré niché entre les cellules épithéliales et gliales marginales et s'arrêtent dans cette région au début du développement de la pupe. Les axones des cellules R arrivant tôt attendent environ 70 heures, tandis que les axones arrivant plus tard s'arrêtent pendant environ 36 heures. Au cours de cette période, les neurones lamina s'assemblent en colonnes, adoptent des destins cellulaires spécifiques (c'est-à-dire L1-L5) et projettent des axones à travers le plexus lamina et dans la moelle. La maturation des neurones lamina se traduit par l'expression du marqueur moléculaire Elav. Ce marqueur est vu initialement dans des cellules individuelles dans les colonnes les plus proches du sillon du limbe et s'accumule dans tous les neurones du limbe dans les colonnes les plus matures au bord postérieur du limbe en développement. Ainsi, le réseau précis de neurones laminaires se développe longtemps après que les cônes de croissance des cellules R pénètrent dans la région cible (Poeck, 2001).

De plus, la formation de connexions entre la rétine et la lame nécessite le préassemblage d'un champ cible organisé avec précision. Au cours du développement des pupes, les cônes de croissance R1-R6 se défasciculent de leur faisceau d'origine. Chaque cône de croissance se projette vers différentes cibles postsynaptiques voisines et se développe en un terminal étendu, formant de nombreuses synapses en passant avec un sous-ensemble de neurones laminaires. La formation des synapses est complète par le développement pupal tardif. Cette réorganisation complexe des axones des cellules R au sein de la cible garantit que, chez l'adulte, les cellules R « regardant » de l'œil au même point dans l'espace se connectent aux mêmes neurones postsynaptiques dans la lame (Poeck, 2001).

Le rôle des neurones en tant que cibles transitoires intermédiaires est bien documenté dans l'hippocampe et le néocortex des mammifères en développement. Comme dans la lame en développement, les partenaires synaptiques finaux ne sont pas encore en place dans ces systèmes lorsque les premiers axones afférents arrivent. Dans cet article, il a été montré que les cellules gliales peuvent également agir comme cibles intermédiaires. En effet, cette fonction des cellules gliales pourrait être plus répandue. Dans le système olfactif en développement du papillon Manduca sexta, les axones antennaires interagissent avec les cellules gliales dans la zone cible avant d'établir des contacts avec les neurones cibles centraux. Chez les animaux rendus déficients en gliales par traitement à l'hydroxyurée ou par irradiation gamma, les axones olfactifs ne confinent pas leurs projections à leurs cibles normales, les glomérules olfactifs. Ce traitement empêche également le développement de cellules gliales spécifiques, qui séparent les axones en fascicules distincts lorsqu'ils pénètrent dans la région cible à partir du nerf antennaire. Par conséquent, il n'est pas clair si ce sont ces cellules gliales ou, alternativement, les cellules gliales associées aux neuropiles dans la zone cible qui sont essentielles pour réguler la spécificité de la cible dans ce système. Les cellules gliales peuvent également fonctionner comme cibles intermédiaires dans certaines régions du système nerveux des mammifères. Par exemple, les axones olfactifs des rongeurs interagissent avec les cellules gliales radiales, avant le recrutement des processus mitral et périglomérulaire (par exemple, les cibles synaptiques des neurones olfactifs) dans les glomérules. En l'absence de cellules mitrales ou périglomérulaires, les axones olfactifs sélectionnent leurs cibles glomérulaires appropriées. Sur la base de ces observations, il a été proposé que le ciblage des axones olfactifs vers des glomérules spécifiques soit régulé par les cellules gliales. Alors que le rôle des cellules gliales dans la spécification des cibles est nouveau, il a déjà été démontré que les cellules gliales jouent un rôle clé en tant que « points de repère » le long des trajectoires axonales vers leurs cibles. Par exemple, dans le système nerveux central embryonnaire de la drosophile, les cellules gliales de la ligne médiane fournissent un signal répulsif, Slit, pour empêcher une croissance inappropriée des axones sur la ligne médiane (Poeck, 2001 et références y figurant).

L'identification des cellules gliales comme cibles intermédiaires pour les neurones R1-R6 constitue une étape importante dans l'isolement des signaux de ciblage régulant la spécificité de R1-R6. Ceci peut être réalisé grâce à des criblages moléculaires utilisant des cellules gliales marquées à la GFP isolées du lobe optique en développement pour identifier les gènes codant pour les protéines de surface cellulaire exprimées sélectivement dans ces cellules. Alternativement, en ciblant la recombinaison mitotique sur les cellules précurseurs gliales à l'aide de la méthode FLP/FRT, il peut être possible d'isoler spécifiquement les gènes requis dans les cellules gliales pour contrôler la sélection de la couche cible (Poeck, 2001).

dDsk2 régule H2Bub1 et l'ARN polymérase II en s'arrêtant au niveau des gènes cibles du complexe dHP1c

dDsk2 (Ubqln2/Ubiquilin) ​​est un récepteur d'ubiquitine extraprotéasomal conservé qui cible les protéines ubiquitylées pour la dégradation. Cette étude rapporte que dDsk2 joue une fonction non protéolytique dans la régulation de la transcription. dDsk2 interagit avec le complexe dHP1c, se localise au niveau des promoteurs des gènes du développement et est nécessaire à la transcription. À travers le domaine de liaison à l'ubiquitine, dDsk2 interagit avec H2Bub1 (H2B monoubiquitylé), une modification qui se produit au niveau des sites de liaison du complexe dHP1c. H2Bub1 n'est pas requis pour la liaison du complexe cependant, l'épuisement de dDsk2 réduit fortement H2Bub1. La co-déplétion de la déubiquitylase H2Bub1 dUbp8/Nonstop supprime cette réduction et sauve l'expression des gènes cibles. L'ARN polymérase II est fortement interrompue au niveau des promoteurs des gènes cibles du complexe dHP1c et l'épuisement de dDsk2 perturbe la pause. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que dDsk2 empêche la désubiquitylation H2Bub1 dépendante de dUbp8/Nonstop au niveau des promoteurs des gènes cibles du complexe dHP1c et régule la pause de l'ARN polymérase II. Ces résultats élargissent le catalogue des fonctions non protéolytiques des récepteurs de l'ubiquitine à la régulation épigénétique des modifications de la chromatine (Kessler, 2015).

Cette étude rapporte que le récepteur d'ubiquitine extraprotéasomal dDsk2 interagit avec le complexe dHP1c, se localise au niveau des promoteurs et est nécessaire à la transcription. Les sites de liaison du complexe dHP1c sont marqués par H2Bub1 et les résultats suggèrent que, via le domaine UBA, dDsk2 se lie à H2Bub1. Cependant, la réduction des niveaux de H2Bub1 n'affecte que faiblement la liaison du complexe, indiquant que l'interaction avec H2Bub1 n'a qu'une contribution mineure au recrutement. En fait, dDsk2 contient un seul site de liaison à l'ubiquitine de faible affinité (Kd

400 &muM), ce qui contraste avec la plupart des récepteurs d'ubiquitine qui contiennent plusieurs sites de liaison à l'ubiquitine qui agissent en synergie pour fournir une liaison de haute affinité. De même, l'interaction de dDsk2 avec H2Bub1 est de faible spécificité puisque la reconnaissance sélective de substrats ubiquitylés est largement basée sur la reconnaissance du type de liaison, de la longueur et du site d'ancrage d'une chaîne de polyubiquitine, et, par conséquent, nécessite la présence de plusieurs liaisons à l'ubiquitine. des sites. En fait, le domaine UBA de dDsk2 reconnaît une monoubiquitylation dans PTEN avec une affinité similaire à celle de H2B. D'autre part, la liaison du complexe dHP1c implique probablement la reconnaissance de séquences d'ADN spécifiques car elle dépend des protéines à doigt de zinc WOC et ROW. Il est à noter que les sites de liaison du complexe dHP1c sont significativement enrichis dans un motif de séquence d'ADN spécifique. Cependant, bien que l'interaction avec H2Bub1 soit faible, la liaison du complexe dépend de manière inattendue de dDsk2. De plus, dHP1c est dispensable pour la liaison WOC et ROW, ainsi que pour la liaison dDsk2). Ces effets ne semblent pas être la conséquence de changements dans les niveaux d'expression des gènes puisque les niveaux d'ARNm dDsk2 ne changent pas de manière significative sur l'épuisement de WOC, ROW ou dHP1c. De plus, l'épuisement de dDsk2 régule à la hausse le ROW et régule faiblement à la baisse les niveaux d'ARNm de dHP1c. Enfin, il a été rapporté que dHP1c interagit avec l'ARN pol II, suggérant que la liaison du complexe dHP1c pourrait dépendre de l'ARN pol II. Cependant, en arguant contre cette possibilité, il a été observé que la liaison du complexe aux promoteurs est résistante au traitement avec l'actinomycine D. Au total, ces résultats suggèrent que WOC, ROW et dDsk2 constituent le module de liaison réel du complexe, étant totalement interdépendants pour la liaison. à la chromatine et requis pour la liaison de dHP1c. À cet égard, la légère réduction des niveaux de protéines ROW et dHP1c observée sur l'épuisement de dDsk2 est très probablement due à leur incapacité à se lier à la chromatine, comme décrit précédemment pour dHP1c dans les knockdowns ROW et WOC, ainsi que pour d'autres protéines associées à la chromatine lorsque leur la liaison à la chromatine est altérée (Kessler, 2015).

Ces résultats suggèrent que la fonction principale de dDsk2 dans le complexe dHP1c est d'empêcher la désubiquitylation de H2Bub1 par dUbp8/Nonstop, car les niveaux de H2Bub1 sont fortement réduits lors de la déplétion de dDsk2 et récupérés après la co-déplétion dUbp8/Nonstop. Une protection contre la désubiquitylation a également été rapportée pour Rad23 et semble être une caractéristique commune de nombreux récepteurs de l'ubiquitine. La déplétion simultanée dDsk2 et dUbp8/Nonsstop restaure également l'expression des gènes cibles, alors qu'elle n'a aucun effet sur le recrutement du complexe au niveau des promoteurs. De plus, la surexpression de la construction ΔUBA-dDsk2, qui manque le domaine UBA qui médie l'interaction avec H2Bub1 in vitro, réduit les niveaux de H2Bub1 au niveau des promoteurs et régule à la baisse l'expression des gènes cibles. Au total, ces résultats suggèrent fortement que la contribution de dDsk2 à la régulation de la transcription repose principalement sur cette fonction protectrice (Kessler, 2015).

Les gènes cibles du complexe dHP1c présentent des caractéristiques associées à une forte pause de l'ARN pol II. Les résultats soutiennent une contribution de dDsk2 à la pause puisque son appauvrissement réduit l'occupation de l'ARN pol II préférentiellement au niveau du TSS et diminue fortement les niveaux de NELF-E. L'épuisement de dDsk2 régule négativement l'expression et, en bon accord, l'occupation totale de l'ARN pol II à travers les gènes cibles est réduite. Fait intéressant, la majorité des gènes cibles NELF sont également régulés négativement sur l'épuisement NELF dans les cellules S251, et NELF potentialise l'expression des gènes dans l'embryon de drosophile. Réellement,

80 % des gènes cibles du complexe dHP1c qui modifient l'expression dans les conditions de précipitation NELF sont régulés à la baisse. De plus, la déplétion NELF-E montre une réduction similaire de l'occupation totale de l'ARN pol II à travers les gènes cibles. Dans l'ensemble, ces observations suggèrent que la perturbation de la pause de l'ARN pol II n'augmente généralement pas la transcription productive, mais entraîne une réduction de l'occupation totale de l'ARN pol II et une diminution de l'expression. Il est possible que la libération prématurée de la pause interfère avec l'activation de l'ARN pol II jusqu'à l'élongation, entraînant une transcription avortée qui, à son tour, pourrait affecter le recrutement et/ou la réinitiation de l'ARN pol II. Notez, cependant, que l'épuisement de dDsk2 n'affecte pas l'étendue de l'acétylation des histones détectée au niveau des promoteurs cibles, ce qui suggère qu'ils conservent l'état transcriptionnel de la chromatine active (Kessler, 2015).

Notamment, la co-épuisement de dUbp8/Nonstop, qui sauve H2Bub1, sauve également le défaut de pause causé par l'épuisement de dDsk2 et les niveaux d'expression sont restaurés, suggérant que la régulation dynamique des niveaux de H2Bub1 au niveau des promoteurs des gènes cibles dHP1c joue un rôle dans la pause de l'ARN pol II . À cet égard, les travaux effectués chez la levure ont suggéré que l'activation transcriptionnelle implique des cycles séquentiels d'ubiquitylation et de désubiquitylation de H2B et que Ubp8 favorise la phosphorylation dépendante de Ctk1 de Ser2 dans le CTD33, une modification nécessaire pour l'activation dans la forme allongée Pol IIoser2. Néanmoins, la désubiquitylation de H2Bub1 au TSS ne semble pas être suffisante à elle seule pour induire la libération de pause puisque l'épuisement de dBre1, qui réduit également H2Bub1 au TSS, n'a pas d'effet significatif sur la pause. À cet égard, il faut noter que dBre1 se déplace avec l'ARN pol II allongé le long des régions codantes pour induire H2Bub1, qui stimule l'activité Facilitate-Chromatine-Transcription (FACT) et, ainsi, facilite l'allongement. D'autre part, l'activité de dUbp8/Nonstop est principalement limitée aux promoteurs puisque son épuisement dans les cellules déficientes en dBre1 a peu d'effet sur les niveaux de H2Bub1 dans les régions codantes. Au contraire, l'appauvrissement en dUbp8/Nonsstop dans les cellules déficientes en dDsk2 sauve fortement les niveaux de H2Bub1 dans les régions codantes. Fait intéressant, alors que l'épuisement dUbp8/Nonstop restaure l'expression des gènes cibles dans les cellules appauvries en dDsk2, il n'a qu'un léger effet dans les cellules déficientes en dBre1. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'épuisement de dBre1 altère l'élongation et, ainsi, pourrait empêcher la libération d'ARN pol II en pause en perturbant son engagement réel dans l'élongation. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour mieux comprendre les mécanismes qui régulent la pause de l'ARN pol II, la contribution réelle de dDsk2 et si cela implique H2Bub1 et/ou des facteurs supplémentaires également ciblés par l'ubiquitylation (Kessler, 2015).

Le complexe dHP1c semble avoir une contribution particulièrement importante au développement et au fonctionnement du système nerveux, car les gènes cibles sont enrichis en fonctions apparentées et les conditions de précipitation affectent préférentiellement l'expression des gènes dans le système nerveux. En fait, WOC et ROW sont fortement exprimés dans le système nerveux au cours du développement embryonnaire et larvaire, et les larves mutantes présentent des défauts cérébraux. De plus, chez l'homme, l'homologue WOC DXS6673E/ZNF261 a été impliqué dans le retard mental lié à l'X. Interestingly, mutations in the human Dsk2 homologues (Ubqln-1/2) have been associated with Alzheimer's disease as well as other neurodegenerative diseases. Noteworthy, Ubqln-1/2 are detected in both the nucleus and the cytoplasm, and the development and progression of neurofibrillary tangles in Alzheimer's disease brains associate with an altered nuclear Ubqln-1 content. Whether the role of dDsk2 in transcription regulation is conserved in humans and contributes to disease remains to be determined (Kessler, 2015).

In summary, these results indicate that the ubiquitin receptor dDsk2 plays a nonproteolytic function in the regulation of H2Bub1 and RNA pol II pausing at promoters of dHP1c complex target genes. Ubiquitin receptors have been previously reported to play nonproteolytic functions in DNA repair and transcription elongation. Furthermore, in response to DNA damage, human Rad23B was found to interact with ubiquitylated p53, localize at chromatin and accumulate at the p21 promoter. In addition, in mouse embryonic stem cells, several components of the NER complex, including Rad23B, have been shown to act as an Oct4/Sox2 co-activator complex that associates with chromatin and is required for stem cell maintenance. Recruitment of NER factors to active promoters has also been reported in HeLa cells in the absence of DNA damage. However, in these cases, the precise function of the ubiquitin receptor has not been elucidated. In this regard, these results expand the catalogue of nonproteolytic functions of ubiquitin receptors to the epigenetic regulation of chromatin modifications and transcription initiation. It must also be noted that ubiquitylation participates in the regulation of multiple genomic functions and that the number of proteins containing ubiquitin-binding domains is large,

100 in humans. Therefore, a role of ubiquitin-binding proteins as epigenetic regulators of chromatin emerges as a distinct possibility (Kessler, 2015).

Les non-stop expression pattern was examined in the target area as a first step toward assessing in which cells non-stop may function. In situ hybridization labeling of eye-brain complexes with non-stop antisense mRNA probes revealed weak expression in the optic lobe and higher expression in the lamina precursor cells. Since the resolution of in situ hybridization in the optic lobe is not high, protein expression was examined by placing a c-myc tag at the C terminus of the non-stop open reading frame in a genomic clone and the transgene was introduced into flies. Since this transgene rescues the projection phenotype and lethality associated with non-stop mutations and expression is similar in two independently derived transgenic lines, it is concluded that the transgene is expressed in a pattern similar to wild type. Anti-myc labeling reveals ubiquitous expression in the cytoplasm of cells in the optic lobe and central brain. Higher levels of expression, however, are observed in lamina precursor cells but not in differentiated lamina neurons. Non-stop is also expressed at higher levels in marginal, epithelial, and medulla glial cells adjacent to the lamina plexus (Poeck, 2001).

The simple cellular composition and array of distally pointing hairs has made the Drosophila wing a favored system for studying planar polarity and the coordination of cellular and tissue level morphogenesis. A gene expression screen was carried out to identify candidate genes that functioned in wing and wing hair morphogenesis. Pupal wing RNA was isolated from tissue prior to, during and after hair growth and used to probe Affymetrix Drosophila gene chips. 435 genes were identified whose expression changed at least 5 fold during this period and 1335 whose expression changed at least 2 fold. As a functional validation, 10 genes were chosen where genetic reagents existed but where there was little or no evidence for a wing phenotype. New phenotypes were found for 9 of these genes providing functional validation for the collection of identified genes. Among the phenotypes seen were a delay in hair initiation, defects in hair maturation, defects in cuticle formation and pigmentation and abnormal wing hair polarity. The collection of identified genes should be a valuable data set for future studies on hair and bristle morphogenesis, cuticle synthesis and planar polarity (Ren, 2005).

The expression of the non-stop (not) gene decreased 3.9 fold from 24 to 40 hrs. mutations dans ne pas result in photoreceptor neurons projecting through the lamina instead of terminating there. The mutations also result in approximately 20% of ommatidia being misoriented -- a planar polarity phenotype. Strong alleles of ne pas die as prepupae so ne pas clones were examined in both adult and pupal wings. Large numbers of clones were induced. Perhaps 25% of wing cells are found in clones. All adult wings of this genotype had regions where there were cells that failed to form hairs or that had very small hairs. These were found only in proximal medial regions on the ventral wing surface. All such wings also had subtle polarity abnormalities small groups of hairs with slightly abnormal polarity in all regions of the wing. Consistently finding such defects leads to the conclusion that these were due to ne pas cloner. Of 47 such wings examined 27 also contained multiple hair cells and a further 10 contained regions with planar polarity defects reminiscent of genes such as fz et dsh. When marked ne pas clones were examined in pupal wings most, but not all, showed cells where hair differentiation was delayed or absent. Such clones were seen in all wing regions. It is suggested that all ne pas clones have delayed hair formation. When the clones are located in wing regions where hairs normally form first (distal or peripheral regions) the hairs form later than normal but still have enough time to reach a relatively normal length. In contrast, when clones are located in regions where hair formation is normally late (proximal and medial regions on the ventral wing surface) not enough time remains prior to cuticle deposition to produce a normal hair. Les ne pas gene encodes a ubiquitin carboxyterminal hydrolase likely to function in the removal of ubiquitin from proteins during protein degradation (Ren, 2005).

Post-transcription initiation function of the ubiquitous SAGA complex in tissue-specific gene activation

The Spt-Ada-Gcn5-acetyltransferase (SAGA) complex was discovered from Saccharomyces cerevisiae and has been well characterized as an important transcriptional coactivator that interacts both with sequence-specific transcription factors and the TATA-binding protein TBP. SAGA contains a histone acetyltransferase and a ubiquitin protease. In metazoans, SAGA is essential for development, yet little is known about the function of SAGA in differentiating tissue. This study analyzed the composition, interacting proteins, and genomic distribution of SAGA in muscle and neuronal tissue of late stage Drosophila embryos. The subunit composition of SAGA was the same in each tissue however, SAGA was associated with considerably more transcription factors in muscle compared with neurons. Consistent with this finding, SAGA was found to occupy more genes specifically in muscle than in neurons. Strikingly, SAGA occupancy was not limited to enhancers and promoters but primarily colocalized with RNA polymerase II within transcribed sequences. SAGA binding peaks at the site of RNA polymerase pausing at the 5' end of transcribed sequences. In addition, many tissue-specific SAGA-bound genes required its ubiquitin protease activity for full expression. These data indicate that in metazoans SAGA plays a prominent post-transcription initiation role in tissue-specific gene expression (Weake, 2011).

SAGA has been purified from Drosophila and mammalian cells and was found to contain homologs of most of the yeast SAGA subunits, including the Gcn5 (see Drosophila Pcaf) and Ubp8 catalytic subunits. In metazoans, SAGA may have roles in both normal development and cancer (Koutelou, 2010). Individual loss of the SAGA subunits Gcn5, Ada2b, Ada3, WDA, Sgf11, and SAF6 results in developmental defects and larval lethality in flies (Weake, 2009 and references therein). Similarly, Gcn5 deletion in mice leads to defects in mesoderm development and embryonic lethality (Xu, 2000). However, catalytic site mutations in Gcn5 survive longer but suffer neural tube closure defects and exencephaly (Bu, 2007). Furthermore, loss of the ubiquitin protease in Drosophila SAGA (Nonstop) leads to defects in photoreceptor axon targeting followed by lethality at late larval stages (Weake, 2011).

A system was designed in which SAGA could be isolated from different cell types in Drosophila embryos so that its composition and localization pattern could be determined in different tissues. To this end, the GAL4/UAS system was used to express a Flag-HA tagged version of the SAGA-specific protein Ada2b (Ada2bH1F2) in muscle or neuronal cells using the mef2-GAL4 and elav-GAL4 drivers, respectively. Expression of Ada2bH1F2 under the control of its genomic enhancer sequences rescues viability of the lethal ada2b 1 allèle. Tandis que mef2 is expressed in committed mesoderm, the somatic and visceral musculature, and cardiac progenitors, elav is expressed prominently in neuronal cells and transiently in glial cells of the embryonic CNS. Ada2bH1F2 is expressed at levels similar to those of endogenous Ada2b using this system. To enrich for cell populations of interest that express tagged Ada2b, muscle and neuronal cells were labelled using GFP, and these cells were isolated using fluorescence-activated cell sorting (FACS). To determine whether the purified cells exhibit the characteristic gene expression profiles of each cell type, GFP-labeled neuronal and muscle cells were isolated from late stage embryos by FACS. RNA isolated from these tissues was compared with RNA extracted from whole embryos using cDNA microarrays, and genes were identified that are differentially expressed in muscle or neurons using significance analysis of microarrays. The differentially expressed genes identified using this approach were compared with ImaGO terms that describe the expression pattern of individual genes during Drosophila embryogenesis as determined by in situ hybridization. Genes identified as being expressed preferentially in muscle relative to neurons were enriched for ImaGO terms including embryonic/larval muscle system and dorsal prothoracic pharyngeal muscle. In contrast, genes identified as being expressed preferentially in neurons were enriched for ImaGO terms such as ventral nerve cord and dorsal/lateral sensory complexes. It is concluded that cells isolated using the FACS approach are enriched for the cell types of interest (Weake, 2011).

This study examined SAGA composition and localization in muscle and neuronal cells of late stage Drosophila embryos. Surprisingly, extensive colocalization of SAGA with Pol II was observed at both promoters and coding regions in muscle cells. Notably, genes at which SAGA was not detected in this assay have low levels of Pol II bound. It is suggested that SAGA might be important for recruitment and/or retention of high levels of Pol II at the promoter-proximal pause site in flies, and perhaps, therefore, more generally in higher eukaryotes. SAGA has been previously observed on the coding sequence of a small number of individual transcribed genes in yeast. Recently, low levels of Ada2b were detected on the 3' region of several different genes during larval development (Zsindely, 2009). It is noted that although some SAGA is present across the coding region of many genes, the peak of acetylated H3-Lys9 is restricted to the 5' region of the two genes that were examined: wupA et exba. A similar 5' bias of acetylated H3-Lys9 has been observed previously in genome-wide studies of histone modifications. It is speculated that the acetylation activity of SAGA in the 3' region of the gene is counteracted by histone deacetylases such as Rpd3S that have been shown to associate with the elongating form of Pol II (Weake, 2011).

SAGA localizes to different genes in muscle and neurons of late stage Drosophila embryos, and the number of genes bound by the complex in each tissue correlates with the number of transcription factors associated with the complex. These findings indicate that the differential localization of SAGA may be regulated by its association with different transcription factors in different cell types. A number of studies have found that transcription factor-binding sites tend to be clustered within the fly genome. This observed colocalization of transcription factors, together with the current data showing the association of SAGA with a large number of different transcription factors, indicates that multiple transcription factors might be involved in recruiting SAGA to its target genes (Weake, 2011).

SAGA is present at the promoter-proximal pause site together with Pol II at genes that are stalled or infrequently transcribed. The presence of SAGA together with paused Pol II is consistent with a role for SAGA in post-initiation deubiquitination of H2B, which has been shown in yeast to be important for phosphorylation of Ser-2 of the Pol II CTD and its subsequent transition into transcription elongation. In flies, phosphorylation of Ser-2 of the Pol II CTD by P-TEFb is also required for release of the paused polymerase into transcription elongation. Hence, the strong colocalization of SAGA with polymerase that has initiated transcription but is paused prior to elongation suggests a prominent function for SAGA in regulating tissue-specific gene expression at a step occurring post-initiation in metazoans. Consistent with the possibility, it was observe that the SAGA-bound genes that are most dependent on its ubiquitin protease activity for full expression are preferentially expressed in a specific tissue (Weake, 2011).

Biochemical and genetic studies support a role for Non-stop acting as a ubiquitin-specific protease. Three ubiquitinated proteins of 29, 55, and 200 kDa accumulated in P-element insert mutations not 1 and not 2 extracts of third instar larval tissue, as assessed on Western blots probed with an anti-Ubiquitin antibody. Both the non-stop targeting defect and prepupal lethality are dominantly enhanced by loss of one copy of a proteasome subunit encoded by l(3)73Ai . This suggests that Non-stop functions to regulate the degradation of a substrate via a ubiquitin-dependent pathway (Poeck, 2001).

It was necessary to show that non-stop is not required in the eye to regulate R cell target selection. To examine the genetic requirement of non-stop in targeting, the FLP/FRT system was used to induce eye-specific mitotic recombination and the marker Rh1-taulacZ was used to assess R1-R6 projections in adult cryostat sections. Les sans yeux-FLP (eyFLP) transgene was used to provide FLP recombinase activity in dividing cells of eye imaginal discs. To increase the size and number of clones in the eye, the FRT chromosome carried either a recessive cell lethal mutation (rfc) or a Minute mutation [M(3)RpS17 4 ]. Using an eye pigment marker, it was estimated that about 60% (with Rfc) to 80% (with RpS) of the cells in mosaic eyes were homozygous mutant. As in wild type, all axons of Rh1-taulacZ-expressing R cells in non-stop mutant eye tissue terminate in the lamina. Minor defects in ommatidial polarity and cell number were observed in non-stop mosaic eyes. However, because the projections are normal, these defects cannot account for the R1-R6 targeting errors. In further support of this finding, the projections of non-stop mutant R cell axons into a wild-type target in third instar larvae, as visualized by mAb24B10, were largely indistinguishable from wild type. Thus, it is concluded that non-stop function is required in the target but not in R cell axons for normal layer selection (Poeck, 2001).

Si non-stop were to act in the target tissue, then it could do so in two different ways. It could be directly required for the production of a targeting signal. Alternatively, it could be required for the development of the cells expressing targeting signals. To distinguish between these possibilities, the development of lamina neurons and glial cells was examined in the target area in non-stop mutants. A subpopulation of neuroblasts in the outer proliferation center, adjacent to the developing lamina, generates lamina precursor cells (LPCs) that, in response to inductive signals from R cell axons, give rise to neurons. Older R cell axon bundles are associated with columns of lamina neurons and are shifted posteriorly as additional R cell axon bundles enter the target region. Lamina neuron development in non-stop mutants was assessed using the early neuronal differentiation marker Dachshund, the late neuronal differentiation marker Elav, and an antibody to a Brain-specific homeobox (Bsh) protein. In addition, the organization of lamina neurons into columns was examined. As in wild type, Dachshund is expressed in LPCs and was maintained in differentiating lamina neurons in non-stop mutants. Elav is expressed in mature lamina neurons L1-L5, and anti-Bsh is restricted to L5. Lamina neurons in non-stop mutants form columns largely as in wild type. D'où, non-stop is not required for lamina neuron differentiation (Poeck, 2001).

R cell axons encounter different glial cell types in the eye disc and in the optic stalk as they project into the optic lobe. Glial cells in the larval eye-brain complex can be visualized using the nuclear glial cell-specific marker anti-Repo. R cell axons grow past subretinal glial cells at the base of the optic stalk as well as satellite glial cells, which are interspersed among lamina neurons. R1-R6 growth cones terminate between rows of epithelial (distal) and marginal (proximal) glial cells. A third row of glial cells (medulla glial cells) lies beneath the marginal glial cells, demarcating the boundary between the developing lamina and medulla. Analysis of glial cell morphology using specific Gal4 drivers to express cytoplasmic ß-galactosidase has shown that epithelial and marginal glial cells have a unique morphology in comparison with the other glial cell types in the larval visual system. In contrast to the long ensheathing processes of eye disc, satellite, and medulla glial cells, epithelial and marginal glial cells assume a cuboidal shape and elaborate numerous fine processes, especially from the surface juxtaposing R1-R6 growth cones within the lamina plexus. The close contact between these glial cells and R1-R6 growth cones is consistent with a role as intermediate target cells (Poeck, 2001).

The development of glial cells in non-stop homozygous mutant eye-brain complexes was assessed using the marker anti-Repo. While glial cells found in the eye imaginal disc, optic stalk, and the entrance to the optic lobe appear normal in non-stop mutants, the rows of epithelial, marginal, and medulla glial cells are severely disrupted. The number of Repo-positive glial cells surrounding the lamina plexus is reduced in non-stop when compared to wild type. Whereas an average of 55 epithelial, marginal, and medulla glial cells is found in optical sections of third instar larval optic lobes in wild type, only about 20 glial cells are observed in non-stop mutants. The number of glial cells in wild type was determined using single optical sections, while the number of these cells in non-stop mutants was assessed using a merged image comprising between 4 and 11 1 µm thick optical sections. Hence, this difference is an underestimate (Poeck, 2001).

Glial cells in the target area originate from glial precursor cell areas that are located at the most dorsal and ventral edges of the R cell projection field on the surface of the optic lobe. Glial cells migrate to their characteristic positions along the lamina plexus. In wild type, a small number of migrating glial cells express Repo as they enter the R cell projection field. Dans non-stop mutants, however, a marked increase (57% wild type, n = 13 non-stop, n = 31) is observed in the number of Repo-expressing glial cells in this region. Cela indique que non-stop, either directly or indirectly, affects the migration of epithelial, marginal, and medulla glial cells into the target region (Poeck, 2001).

SAGA-mediated H2B deubiquitination controls the development of neuronal connectivity in the Drosophila visual system

Nonstop, which has previously been shown to have homology to ubiquitin proteases, is required for proper termination of axons R1-R6 in the optic lobe of the developing Drosophila eye. This study establish that Nonstop actually functions as an ubiquitin protease to control the levels of ubiquitinated histone H2B in flies. Nonstop is the functional homolog of yeast Ubp8, and can substitute for Ubp8 function in yeast cells. In yeast, Ubp8 activity requires Sgf11. In Drosophila, loss of Sgf11 function causes similar photoreceptor axon-targeting defects as loss of Nonstop. Ubp8 and Sgf11 are components of the yeast SAGA complex, suggesting that Nonstop function might be mediated through the Drosophila SAGA complex. Indeed, it was found that Nonstop does associate with SAGA components in flies, and mutants in other SAGA subunits display nonstop phenotypes, indicating that SAGA complex is required for accurate axon guidance in the optic lobe. Candidate genes regulated by SAGA that may be required for correct axon targeting were identified by microarray analysis of gene expression in SAGA mutants (Weake, 2008).

This study has identified a novel role for the coactivator complex dSAGA in Drosophila neural development. The Gcn5 (KAT2) HAT acts as the catalytic subunit of the yeast SAGA, SLIK, ADA and A2 multi-subunit protein complexes. Although many studies in multicellular organisms have focused on the HAT activity of the Gcn5 (KAT2) complexes, SAGA itself possesses a second catalytic activity. In addition to its HAT activity, yeast SAGA contains an H2B deubiquitinating enzyme, Ubp8. Ubp8 functions as part of a modular subunit domain within yeast SAGA that contains two additional proteins, Sgf11 and Sus1. Previous studies on histone deubiquitination have focused on its role in transcription in yeast. This study has characterized a role for histone deubiquitination in gene regulation in Drosophila (Weake, 2008).

Nonstop and Sgf11 constitute the H2B deubiquitination module within dSAGA. Moreover, both Nonstop and Sgf11 are required for correct axon targeting in the developing visual system. As in yeast, the two catalytic functions of SAGA are separable. However, mutations that differentially affect the two catalytic activities of dSAGA have overlapping but distinct effects on gene expression. Despite the differences in activity, both catalytic modules of dSAGA are required for correct axon targeting in the optic lobe. This implicates dSAGA in the regulation of pathways essential for neural development in higher eukaryotes (Weake, 2008).

This analysis of the axon-targeting defects in the nonstop, sgf11 et ada2b mutants indicates that the R-cell misprojection phenotype is associated in all three cases with a loss of glial cells from the lamina region of the optic lobe, and an increase in the number of glial cells at the dorsal and ventral margins of the lamina. Clonal analysis indicates that nonstop glial cells fail to migrate from these dorsal and ventral regions into the lamina plexus. This suggests that dSAGA may be required within glial cells to regulate pathways important for their migration. It is possible that the requirement of dSAGA may be due to its role in the ecdysone response as indicated by microarray analysis of genes downregulated in nonstop, sgf11 et ada2b larves mutantes. However, further studies on the role of dSAGA in these glial cells will be required to determine which pathway(s) are primarily responsible for the axon-targeting defect observed in these dSAGA mutants (Weake, 2008).

Mutations that affect the deubiquitination activity of dSAGA, such as nonstop et sgf11, appear to result in a more severe axon-targeting defect than those that affect the acetylation activity, such as ada2b. However, there is some variability in the degree of expressivity of the phenotype in all three mutant genotypes, and some ada2b mutants show phenotypes very similar to nonstop et sgf11. It is evident from studies on yeast SAGA that both enzymatic activities are required for optimal transcription upon gene induction. The variability in the ada2b mutant may be due to the large maternal contribution of Ada2b, and it is notable that the ada2b mutant larvae show considerably less developmental delay in comparison to nonstop, sgf11 et gcn5. Thus far, mutations in other components of dSAGA, such as wda et nipped-A, have not been examined for this phenotype because these do not reach the third instar larval stage of development (Weake, 2008).

Although in this study a specific effect was observed of the dSAGA deubiquitination module on histone H2B, it remains likely Nonstop and Sgf11 are also required for deubiquitination of other target proteins within the cell. Previous studies observed an increase in the level of three ubiquitinated proteins of 29, 55 and 200 kDa in extracts from nonstop third instar larval tissue relative to wild-type extracts. The smallest of these may correspond to ubiquitinated H2B, but the others may correspond to as yet unidentified potential targets of the deubiquitination module within dSAGA (Weake, 2008).

It is likely that the role of SAGA and H2B deubiquitination in neural development may be conserved in mammalian systems, as there is a striking degree of similarity between Sgf11 and ATXN7L3/ATXN7 in humans. ATXN7 is a subunit of the human STAGA and TFTC complexes. Polyglutamine expansions in the Spinocerebellar ataxia type 7 (sca7) gene, encoding ATXN7, result in a dominant neurodegenerative disorder that affects the retina. There is increased recruitment of STAGA/TFTC containing this polyQ-expanded ATXN7 at certain promoters in a mouse SCA7 model, resulting in hyperacetylation of H3. Interestingly, despite this increased promoter recruitment and hyperacetylation, these genes show decreased levels of transcription. However, in other studies incorporation of polyQ-expanded ATXN7 into STAGA reduces the acetyltransferase activity of the complex. The effect of the polyQ expansions in ATXN7 on the putative deubiquitination activity of mammalian STAGA/TFTC has not yet been examined (Weake, 2008).

Van der Knaap (2005) has demonstrated that another ubiquitin protease in flies, USP7, specifically deubiquitinates Histone H2B in vitro. However, RNAi of USP7 had little effect on global levels of ubiquitinated H2B, and it was found that USP7 cannot functionally replace UBP8 in yeast. Yeast Ubp15, the putative homolog of USP7, also deubiquitinates H2B in vitro, but the biological role of this activity is presently unknown. In addition to Ubp8 in yeast, Ubp10 is also required for deubiquitination of H2B at the telomeres and at the rDNA locus. It is unknown whether the putative homolog of Ubp10 in flies, CG15817, is also required for H2B deubiquitination and gene silencing. It is intriguing that both Ubp10 and USP7 (via an interaction with the Polycomb complex) function in regulating heterochromatin structure, while Ubp8/Nonstop are required for active transcription. It remains to be determined whether alternative mechanisms for regulating histone ubiquitination at distinct chromatin environments exist within the genomes of higher eukaryotes (Weake, 2008).

Taken together, these results advance the understanding of the role of histone deubiquitination in transcription, while demonstrating a novel role for SAGA in regulating neural development in the visual system of Drosophila. These findings have implications for the use of Drosophila as a model system to understand the underlying mechanisms of neurodegenerative diseases (Weake, 2008).

Bu, P., Evrard, Y. A., Lozano, G. and Dent, S. Y. (2007). Loss of Gcn5 acetyltransferase activity leads to neural tube closure defects and exencephaly in mouse embryos. Mol. Cell Biol. 27: 3405-3416. PubMed Citation: 17325035

Kessler, R., Tisserand, J., Font-Burgada, J., Reina, O., Coch, L., Attolini, C. S., Garcia-Bassets, I. and Azorin, F. (2015). dDsk2 regulates H2Bub1 and RNA polymerase II pausing at dHP1c complex target genes. Nat Commun 6: 7049. PubMed ID: 25916810

Koutelou, E., Hirsch, C. L. and Dent, S. Y. (2010). Multiple faces of the SAGA complex. Cour. Avis. Cell Biol. 22: 374-382. PubMed Citation: 20363118

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