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Pourquoi le repliement des protéines ne dépend-il pas de l'ordre dans lequel elles sont synthétisées ?

Pourquoi le repliement des protéines ne dépend-il pas de l'ordre dans lequel elles sont synthétisées ?


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J'ai lu récemment un article écrit par un chercheur du Département de biochimie de l'Université de Washington, qui déclarait que :

De même, le succès de la conception de protéines de novo repose sur la question que je reçois après chaque intervention sur l'importance de l'ordre de synthèse en chaîne sur le ribosome pour le repliement des protéines ; les calculs informatiques de conception de protéines ignorent complètement l'ordre de synthèse qui ne peut donc pas être critique pour le repliement des protéines.

Je me demandais comment se fait-il que la forme sous laquelle la protéine est repliée n'ait rien à voir avec la séquence d'acides aminés qui constitue cette protéine ? Ce que je veux dire, c'est que si je regarde l'image miroir d'une protéine, est-ce qu'elle se plierait de la même manière ? si je considère par exemple les séquenceurs : ser-gly-ala-glu-pro-asp et asp-pro-glu-ala-gly-ser, vont-ils tous les deux plier de la même manière ? (Je pense que ce sont des protéines d et c'est la contrepartie de la protéine l)

Quelqu'un peut-il fournir la preuve que c'est effectivement le cas. Ou ai-je mal compris la section citée?

lien vers l'article : sci-hub.tw/10.1002/pro.3588


comment se fait-il que la forme sous laquelle la protéine est repliée n'ait rien à voir avec la séquence d'acides aminés qui constitue cette protéine ?

La citation du chercheur dit que la forme n'est pas liée au sens de synthèse (N->C plutôt que C->N). Cela implique que tous ce qui compte, c'est la séquence d'acides aminés qui constitue la protéine, et ce repliement de la protéine est déterminé par la stabilité thermodynamique plutôt que par la cinétique.

au cas où je regarderais l'image miroir d'une protéine, se plierait-elle de la même manière ?

Oui, si vous aviez une image miroir exacte d'une protéine seule en solution, elle adopterait le même pli mais en miroir. Les extrémités N et C seraient sur les mêmes acides aminés, mais tous les acides aminés seraient de chiralité D plutôt que L. Cette molécule ne serait généralement pas trouvée en biologie, car la vie utilise généralement des acides L-aminés. Il aurait un comportement enzymatique différent sur les molécules chirales.

si je considère par exemple les séquences : ser-gly-ala-glu-pro-asp et asp-pro-glu-ala-gly-ser, se plieront-elles toutes les deux de la même manière ? (Je pense que ce sont des protéines d et c'est la contrepartie de la protéine l)

Ce ne sont pas des images miroir, ce sont des molécules entièrement différentes. Ce ne sont pas des homologues chiraux (L et D). En général, ils ne se plieraient pas à la même structure que les groupes CO et N de l'épine dorsale sont inversés, voir plus sur reddit. Cependant, il s'agit d'un sujet de recherche et certaines séquences réversibles ont été trouvées, voir Zhang2016 et Mittl2000.

À un niveau plus profond, l'affirmation du chercheur selon laquelle la direction de la synthèse (et donc la synthèse au sens large) n'est pas importante n'est pas claire. Pour les protéines conçues, cela peut être vrai, mais elles sont petites et hyperstables. Pour les protéines plus grosses et les complexes protéiques, la cinétique joue un rôle plus important et des chaperons peuvent être utilisés pour protéger une chaîne en croissance lorsqu'elle se détache du ribosome. Voir par exemple la discussion dans Sorokina2018 et Deane2007.


Je soupçonne que l'auteur voulait dire quelque chose d'un peu différent. Ce n'est pas seulement que peu importe qu'une protéine soit synthétisée à partir de l'extrémité N ou C, il n'est pas non plus important pour le résultat final du repliement que la synthèse soit graduelle.

Lors de la conception des protéines de novo ils modélisent le pliage sur ordinateur. L'ajout progressif de résidus d'acides aminés à la protéine ne fait pas partie de ces modèles, les calculs sont effectués sur l'ensemble de la séquence en une seule fois. Pourtant, lorsque les protéines conçues sont synthétisées sur les ribosomes, elles se replient correctement. Ainsi, le fait que les protéines soient construites étape par étape ne devrait pas beaucoup influencer la façon dont elles sont repliées. Tant qu'il y a un état d'énergie libre suffisamment faible, il sera atteint.

Aussi,N-ser-gly-ala-glu-pro-asp-CetN-asp-pro-glu-ala-gly-ser-Cne sont pas exactement les images en miroir les uns des autres. Ils ont juste des groupes terminaux amino et carboxyle échangés. J'imagine que cela peut influencer un peu le pliage.


En plus de ce qui a déjà été dit, je veux mentionner quelque chose de plus subtil. Ce que d'autres personnes ont commenté ici concerne un vieux « dogme » dû à Christian Anfinsen, qui postule que tout ce qui compte est la séquence des acides aminés + le microenvironnement (pH, température, etc.).

Cependant, je pense que vous pourriez confondre deux autres couches de complexité biochimique. Un, les acides aminés L contre D. Si toute la machinerie de la synthèse des protéines (y compris le ribosome et l'ARN messager !) était parfaitement spéculaire (c'est-à-dire les acides aminés D et les sucres L, et la séquence d'ARN correspondante), tout le reste étant pareil, alors on s'attendrait à ce que le repliement soit le même (bien qu'en pratique, il s'agisse d'un nouveau domaine de l'ingénierie moléculaire qui n'est pas si avancé). En fait, on ne sait pas pourquoi nous avons une forme chirale particulière de sucres et d'acides aminés, et cela pourrait tout aussi bien être un accident de l'évolution.

La deuxième chose qui pourrait être confondue dans votre question est l'ordre dans lequel un acide aminé particulier est ajouté à une protéine nouvellement synthétisée. Même si les réponses précédentes semblent rejeter cela comme sans importance; c'est en effet très important. Les acides aminés au début d'une chaîne protéique se replient dès qu'ils sortent du ribosome. Il s'agit donc d'un processus assez important, car les protéines n'attendent pas seulement d'être complètement synthétisées pour que le repliement commence : elles interagissent en permanence avec l'environnement (y compris les chaperons !), donc le repliement dépend aussi de l'ordre de synthèse.


La citation est que la structure des protéines est généralement déterminée par la thermodynamique et non par la cinétique. Les structures seraient différentes si vous preniez une image miroir de la séquence que vous avez montrée, car les acides aminés aux extrémités n et c sont différents, tout comme l'orientation de tous les autres acides aminés. Cependant, si le ribosome était capable de se traduire dans la direction de l'extrémité c à n plutôt que n à l'extrémité c, la structure de la protéine formée serait la même, c'est ce à quoi la citation veut en venir. En effet, comme je l'ai dit, le repliement des protéines est généralement thermodynamique, même si certains acides aminés sortent d'abord du ribosome et forment une structure (la structure cinétique étant donné que ces acides aminés sont venus en premier), la structure avec la plus faible énergie libre est formée. Cela se produit parce qu'il n'y a généralement pas de grande barrière énergétique à surmonter pour que la protéine se replie pour trouver sa structure d'énergie libre minimale et donc l'énergie thermique est suffisante pour permettre à l'énergie d'activation d'être surmontée et donc le processus est conduit thermodynamiquement pour minimiser l'énergie libre de la protéine.


Fondements scientifiques de la biotechnologie

1.17.13 Remarques finales

Le repliement des protéines dans le RE dépend d'un grand nombre de chaperons, d'enzymes de repliement, de modificateurs de protéines et de molécules de traitement qui aident au repliement, aux modifications post-traductionnelles, à l'assemblage, au contrôle qualité et au transport final vers les destinations appropriées. La forte concentration de protéines clientes et de molécules participant au repliement des protéines au sein du RE rend cet organite particulièrement vulnérable aux perturbations et également un capteur sensible de l'état cellulaire. Le contrôle de la qualité et l'homéostasie du RE sont tous deux maintenus par les composants de l'UPR. Il a été démontré que la dyshoméostasie du RE, le mauvais repliement des protéines et l'agrégation contribuent à un nombre croissant de maladies humaines. Davantage de recherches sur les processus de repliement des protéines et le contrôle de la qualité sont essentielles pour une meilleure compréhension des maladies conformationnelles des protéines.


Aperçu du traitement des protéines :

Aperçu du Golgi et de la transformation des protéines:

Le diagramme de gauche résume le flux de protéines entre les compartiments du système endométre. Dans la première partie de cette unité, nous considérerons le transfert des protéines du RE vers le golgi (flèche rouge) et le transfert inverse (rétrograde) des récepteurs et des protéines destinés à la rétention dans le compartiment du RE (flèche bleue). La partie non mise en évidence de la figure montre le flux de protéines dans les voies sécrétoires, lysosomales et endocytotiques qui seront considérées plus loin. Cliquez sur l'image pour l'élargir.


Sandwalk

Les ponts disulfure peuvent être rompus en traitant une protéine avec du 2-mercaptoéthanol (HS-CH2-CHOH). La liaison entre les deux soufres dans la protéine est rompue et une nouvelle liaison se crée entre deux soufres au bout de deux molécules de 2-mercaptoéthanol. (2-mercaptoéthanol était autrefois appelé β-mercaptoéthanol ou βME.) Le traitement au 2-mercaptoéthanol est maintenant une procédure standard pour dénaturer les protéines. Par exemple, 2ME est toujours inclus lorsque les protéines sont préparées pour l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS.

Anfinsen voulait montrer que l'information pour le repliement des protéines résidait entièrement dans la séquence d'acides aminés de la protéine. Il a choisi la ribonucléase A comme modèle de repliement mais il n'a pas pu dénaturer complètement la protéine à moins de la traiter avec l'urée dénaturante plus 2ME pour briser les ponts disulfures.

Dans ces conditions, la protéine s'est dépliée. Il se replierait spontanément une fois qu'il aurait retiré l'urée et le 2ME de la solution de repliement. La ribonucléase A a retrouvé une activité biologique dans ces conditions. Cela a démontré que le repliement pouvait avoir lieu in vitro.

Anfinsen a découvert que l'élimination du 2ME mais pas de l'urée conduisait à une récupération de 1% de l'activité. Ceci est attribué à la formation de ponts disulfures aléatoires entre les 8 cystéines présentes dans la protéine. Il y a 105 possibilités différentes (7x5x3x1) donc la récupération de 1% est logique. Il montre également que la conformation tridimensionnelle correcte doit être obtenue assez rapidement lorsque l'urée est éliminée puisque la plupart des protéines dans ces conditions deviennent actives.

Cependant, la récupération n'est pas à 100%. Des erreurs sont commises in vitro et vraisemblablement in vivo également. Cela a conduit à la découverte d'une enzyme appelée protéine disulfure isomérase (PDI), une enzyme qui catalyse la réduction des liaisons disulfure incorrectes et permet à une protéine piégée dans une conformation incorrecte de se déployer et de réessayer.

La PDI est une enzyme omniprésente, comme on peut s'y attendre en raison de son rôle important dans le bon repliement. Le site actif de l'enzyme contient un disulfure (représenté par deux atomes de soufre jaune sur la figure). Ainsi, l'enzyme agit très bien comme le 2-mercaptoéthanol, catalysant une réaction d'échange de disulfure où le pont disulfure incorrect dans la protéine mal repliée est réduit et le PDI est oxydé. (Le nom correct de la protéine est « thiol-disulfure oxydoréductase. Les oxydoréductases forment une grande classe d'enzymes très importantes.)

L'enzyme reconnaît préférentiellement les ponts disulfure incorrects car ceux-ci ont tendance à être exposés à la surface de la protéine mal repliée, alors que les ponts disulfure corrects sont généralement enfouis à l'intérieur hydrophobe de la protéine correctement repliée.


Structures des protéines : primaire, secondaire, tertiaire, quaternaire

Les protéines sont la classe de molécules biologiques la plus vaste et la plus variée, et elles présentent la plus grande variété de structures. Beaucoup ont des modèles de pliage tridimensionnels complexes qui donnent une forme compacte, mais d'autres ne se replient pas du tout (protéines nativement non structurées) et existent dans des conformations aléatoires. La fonction des protéines dépend de leur structure, et la définition de la structure des protéines individuelles est une grande partie de la biochimie et de la biologie moléculaire modernes.

Pour comprendre comment les protéines se replient, nous allons commencer par les bases de la structure et progresser jusqu'à des structures de complexité croissante.

Liaisons peptidiques

Pour fabriquer une protéine, les acides aminés sont reliés entre eux par un type de liaison amide appelée « liaison peptidique ». Cette liaison se forme entre le groupe alpha amino d'un acide aminé et le groupe carboxyle d'un autre dans une réaction de condensation. Lorsque deux acides aminés se joignent, le résultat s'appelle un dipeptide, trois donnent un tripeptide, etc. Plusieurs acides aminés donnent un polypeptide (souvent abrégé en “peptide”).

Étant donné que l'eau est perdue au cours de la création de la liaison peptidique, les acides aminés individuels sont appelés « résidus d'acides aminés » une fois qu'ils sont incorporés. Une autre propriété des peptides est la polarité : les deux extrémités sont différentes. Une extrémité a un groupe amino libre (appelé “N-terminal”) et l'autre a un groupe carboxyle libre (“C-terminal”).

Dans le cours naturel de la fabrication d'une protéine, les polypeptides sont allongés par l'ajout d'acides aminés à l'extrémité C-terminale de la chaîne en croissance. Classiquement, les peptides sont écrits N-terminal en premier, donc gly-ser n'est pas le même que ser-gly ou GS n'est pas le même que SG. La connexion donne lieu à un motif répétitif d'atomes « 8220NCC-NCC-NCC… / 8221 le long de la molécule. C'est ce qu'on appelle le « backbone » du peptide. Si elles sont étirées, les chaînes latérales des résidus individuels se projettent vers l'extérieur à partir de ce squelette.

La liaison peptidique est écrite comme une liaison simple, mais elle présente en fait certaines caractéristiques d'une double liaison en raison de la résonance entre les liaisons C-O et C-N :

Cela signifie que les six atomes impliqués sont coplanaires et qu'il n'y a pas de rotation libre autour de l'axe C-N. Cela limite la flexibilité de la chaîne et empêche certains modèles de pliage.

Structure primaire des protéines

Il est commode de discuter de la structure des protéines en termes de quatre niveaux (primaire à quaternaire) de complexité croissante. La structure primaire est simplement la séquence de résidus constituant la protéine. Ainsi, la structure primaire n'implique que les liaisons covalentes liant les résidus entre eux.

La taille minimale d'une protéine est définie comme environ 50 résidus de chaînes plus petites sont simplement appelées peptides. Ainsi, la structure primaire d'une petite protéine consisterait en une séquence d'environ 50 résidus. Même ces petites protéines contiennent des centaines d'atomes et ont des poids moléculaires de plus de 5000 Daltons (Da). Il n'y a pas de taille maximale théorique, mais la plus grande protéine découverte à ce jour a environ 30 000 résidus. Étant donné que le poids moléculaire moyen d'un résidu est d'environ 110 Da, cette chaîne unique a un poids moléculaire de plus de 3 millions de daltons.

Structure secondaire

Ce niveau de structure décrit le modèle de repliement local du squelette polypeptidique et est stabilisé par des liaisons hydrogène entre les groupes N-H et C=O. Divers types de structures secondaires ont été découverts, mais les plus courantes sont de loin les formes répétitives ordonnées connues sous le nom d'hélice a et de feuille b.

Une hélice a, comme son nom l'indique, est un arrangement hélicoïdal d'une seule chaîne polypeptidique, comme un ressort hélicoïdal. Dans cette conformation, les groupes carbonyle et N-H sont orientés parallèlement à l'axe. Chaque carbonyle est lié par une liaison hydrogène au N-H d'un résidu situé 4 résidus plus loin dans la séquence au sein d'une même chaîne. Tous les groupes C=O et N-H sont impliqués dans les liaisons hydrogène, formant un cylindre assez rigide.

L'hélice alpha a des dimensions précises : 3,6 résidus par tour, 0,54 nm par tour. Les chaînes latérales se projettent vers l'extérieur et entrent en contact avec tout solvant, produisant une structure semblable à un goupillon ou une brosse à cheveux ronde. Un exemple de protéine avec de nombreuses structures a-hélicoïdales est la kératine qui compose les cheveux humains.

La structure d'une feuille b est très différente de la structure d'une hélice a. Dans une feuille b, la chaîne polypeptidique se replie sur elle-même de sorte que les brins polypeptidiques se ressemblent côte à côte et sont maintenus ensemble par des liaisons hydrogène, formant une structure très rigide. Encore une fois, les groupes polypeptidiques N-H et C=O forment des liaisons hydrogène pour stabiliser la structure, mais contrairement à l'hélice a, ces liaisons sont formées entre des brins polypeptidiques voisins (b).

Généralement, la structure primaire se replie sur elle-même selon une disposition parallèle ou antiparallèle, produisant une feuille b parallèle ou antiparallèle. Dans cet agencement, les chaînes latérales font saillie alternativement vers le haut et vers le bas à partir de la feuille. Le constituant majeur de la soie (fibroïne de soie) se compose principalement de couches de feuille b empilées les unes sur les autres.

Autres types de structure secondaire. Alors que l'hélice a et la feuille b sont de loin les types de structure les plus courants, de nombreuses autres sont possibles. Ceux-ci incluent diverses boucles, hélices et conformations irrégulières. Une seule chaîne polypeptidique peut avoir différentes régions qui prennent différentes structures secondaires. En fait, de nombreuses protéines ont un mélange d'hélices a, de feuilles b et d'autres types de motifs de pliage pour former diverses formes globales.

Qu'est-ce qui détermine si une partie particulière d'une séquence se repliera dans l'une ou l'autre de ces structures ? Un déterminant majeur est constitué par les interactions entre les chaînes latérales des résidus dans le polypeptide. Plusieurs facteurs entrent en jeu : l'encombrement stérique entre les grandes chaînes latérales voisines, la répulsion de charge entre les chaînes latérales voisines de même charge et la présence de proline.

Proline contient un anneau qui contraint les angles de liaison de sorte qu'il ne s'insère pas exactement dans une feuille a-hélice ou b. De plus, il n'y a pas de H sur une liaison peptidique lorsque la proline est présente, de sorte qu'une liaison hydrogène ne peut pas se former. Un autre facteur important est la présence d'autres groupes chimiques qui interagissent les uns avec les autres. Cela contribue au niveau suivant de la structure des protéines, la structure tertiaire.

Structure tertiaire

Ce niveau de structure décrit comment les régions de secondaire la structure se replie, c'est-à-dire l'arrangement 3D d'une chaîne polypeptidique, y compris les hélices a, les feuilles b et toutes les autres boucles et plis. La structure tertiaire résulte d'interactions entre les chaînes latérales, ou entre les chaînes latérales et le squelette polypeptidique, qui sont souvent distantes en séquence. Chaque protéine a un modèle particulier de repliement et ceux-ci peuvent être assez complexes.

Alors que la structure secondaire est stabilisée par la liaison H, les quatre forces «faibles» contribuent à la structure tertiaire. Habituellement, la force la plus importante est l'interaction hydrophobe (ou les liaisons hydrophobes). Les chaînes polypeptidiques contiennent généralement à la fois des résidus hydrophobes et hydrophiles. Tout comme les micelles détergentes, les protéines sont plus stables lorsque leurs parties hydrophobes sont enfouies, tandis que les parties hydrophiles sont à la surface, exposées à l'eau. Ainsi, des résidus plus hydrophobes tels que trp sont souvent entourés par d'autres parties de la protéine, à l'exclusion de l'eau, tandis que des résidus chargés tels que l'asp sont plus souvent à la surface.

D'autres forces qui contribuent à la structure tertiaire sont les liaisons ioniques entre les chaînes latérales, les liaisons hydrogène et les forces de van der Waals. Ces liaisons sont beaucoup plus faibles que les liaisons covalentes, et il faut de multiples interactions pour stabiliser une structure.

Il existe une liaison covalente qui est également impliquée dans la structure tertiaire, et c'est la liaison disulfure qui peut se former entre les résidus cystéine. Cette liaison n'est importante que dans les protéines non cytoplasmiques car il existe des systèmes enzymatiques présents dans le cytoplasme pour éliminer les liaisons disulfure.

Visualisation des structures protéiques Parce que les structures 3D des protéines impliquent des milliers d'atomes dans des arrangements complexes, diverses manières de les représenter afin qu'elles soient comprises visuellement ont été développées, chacune mettant l'accent sur une propriété différente de la protéine. Des outils logiciels ont été écrits pour représenter les protéines de différentes manières et sont devenus essentiels pour comprendre la structure et la fonction des protéines.

Domaines structuraux des protéines

La structure des protéines peut également être décrite par un niveau d'organisation distinct de ceux dont nous venons de parler. Cette unité organisationnelle est la protéine « domaine », et le concept de domaines est extrêmement important pour comprendre la structure tertiaire. Un domaine est une région distincte (séquence d'acides aminés) d'une protéine, tandis qu'un domaine structurel est une partie repliée indépendamment d'une protéine qui se replie en une structure stable. Une protéine peut avoir de nombreux domaines ou n'être constituée que d'un seul domaine. Les protéines plus grosses sont généralement constituées de domaines structuraux connectés. Les domaines sont souvent séparés par une région peu pliée et peuvent créer des fentes entre eux.

Quaternaire Structure

Certaines protéines sont composées de plusieurs chaînes polypeptidiques. Dans de telles protéines, la structure quaternaire fait référence au nombre et à la disposition des chaînes polypeptidiques individuelles. Chaque polypeptide est appelé sous-unité de la protéine. Les mêmes forces et liaisons qui créent la structure tertiaire maintiennent également les sous-unités ensemble dans un complexe stable pour former la protéine complète.

Les chaînes individuelles peuvent être identiques, quelque peu similaires ou totalement différentes. A titre d'exemple, la protéine CAP est un dimère avec deux sous-unités identiques, tandis que l'hémoglobine est un tétramère contenant deux paires de sous-unités non identiques (mais similaires). Il a 2 sous-unités a et 2 sous-unités b. Les protéines sécrétées ont souvent des sous-unités qui sont maintenues ensemble par des liaisons disulfure. Les exemples incluent les molécules d'anticorps tétramères qui ont généralement deux sous-unités plus grandes et deux sous-unités plus petites ("chaînes lourdes" et "chaînes légères") reliées par des liaisons disulfure et des forces non covalentes.

Dans certaines protéines, des hélices a entrelacées maintiennent des sous-unités ensemble, elles sont appelées bobines enroulées. Cette structure est stabilisée par une surface hydrophobe sur chaque hélice a qui est créée par un motif répété heptamère de résidus hydrophiles/hydrophobes. La séquence de la protéine peut être représentée comme « abcdefg abcdefg abcdefg … » avec les positions « a » et « d » remplies de résidus hydrophobes tels que A, V, L etc. Chaque a-hélice a une surface hydrophobe qui correspond donc L'autre. Lorsque les deux hélices s'enroulent l'une autour de l'autre, ces surfaces se rejoignent, enterrant les chaînes latérales hydrophobes et formant une structure stable. Un exemple d'une telle protéine est la myosine, la protéine motrice trouvée dans le muscle qui permet la contraction.


Synthèse des protéines

La synthèse des protéines se produit dans les ribosomes et procède en joignant l'extrémité carboxyle du premier acide aminé à l'extrémité aminée du suivant (Figure 2.19). L'extrémité de la protéine qui a le groupe libre &alpha-amino est appelée extrémité amino ou N-terminal. L'autre extrémité est appelée extrémité carboxyle ou extrémité C, car elle contient le seul groupe &-carboxyle libre. Tous les autres groupes &alpha-amino et les groupes &alpha-carboxyle sont liés pour former le peptide. Figure 2.19 Liaison des acides aminés par des liaisons de formation de liaisons peptidiques qui relient les acides aminés adjacents. Les protéines sont synthétisées en commençant par l'extrémité aminée et se terminant à l'extrémité carboxyle.

Figure 2.20 - Orientation cis vs trans des groupes R autour de la liaison peptidique Image d'Aleia Kim

Schématiquement, sur la figure 2.18, nous pouvons voir comment les groupes R séquentiels d'une protéine sont disposés dans une orientation alternée de chaque côté de la chaîne polypeptidique. L'organisation des groupes R de cette manière n'est pas aléatoire. Un encombrement stérique peut survenir lorsque des groupes R consécutifs sont orientés du même côté d'un squelette peptidique (Figure 2.20)

Structure primaire

La structure primaire est le déterminant ultime de la conformation globale d'une protéine. La structure primaire de toute protéine est arrivée à son état actuel à la suite d'une mutation et d'une sélection au cours du temps évolutif. La structure primaire des protéines est mandatée par la séquence d'ADN qui les code dans le génome. Les régions des protéines spécifiant l'ADN sont appelées régions codantes (ou gènes).

Les séquences de bases de ces régions spécifient directement la séquence d'acides aminés dans les protéines, avec une correspondance un à un entre les codons (groupes de trois bases consécutives) dans l'ADN et les acides aminés dans la protéine codée. La séquence de codons dans l'ADN, copiée dans l'ARN messager, spécifie une séquence d'acides aminés dans une protéine. (Figure 2.21).

Figure 2.21 - De l'ARN aux acides aminés - le code génétique Wikipédia

L'ordre dans lequel les acides aminés sont réunis dans la synthèse des protéines commence à définir un ensemble d'interactions entre les acides aminés alors même que la synthèse se produit. C'est-à-dire qu'un polypeptide peut se replier alors même qu'il est fabriqué. L'ordre des structures du groupe R et les interactions résultantes sont très importants car les premières interactions affectent les interactions ultérieures. C'est parce que les interactions commencent à établir des structures - secondaires et tertiaires. Si une structure hélicoïdale (structure secondaire), par exemple, commence à se former, les possibilités d'interaction d'un acide aminé particulier Rgroup peuvent être différentes que si l'hélice ne s'était pas formée (Figure 2.22). Les interactions du groupe R peuvent également provoquer des courbures dans une séquence polypeptidique (structure tertiaire) et ces courbures peuvent créer (dans certains cas) des opportunités d'interactions qui auraient été possibles sans la courbure ou empêcher (dans d'autres cas) des possibilités d'interaction similaires.

Structure secondaire

Au fur et à mesure que la synthèse des protéines progresse, des interactions entre des acides aminés proches les uns des autres commencent à se produire, donnant lieu à des modèles locaux appelés structure secondaire. Ces structures secondaires comprennent les brins bien connus &alpha-hélice et &beta-. Les deux ont été prédits par Linus Pauling, Robert Corey et Herman Branson en 1951. Chaque structure a des caractéristiques uniques.

Figure 2.22 - L'hélice &alpha. Les liaisons hydrogène (lignes pointillées) entre l'oxygène carbonyle et l'hydrogène amine stabilisent la structure. Image par Aleia Kim

L'hélice &alpha a une structure enroulée, avec 3,6 acides aminés par tour d'hélice (5 tours hélicoïdaux = 18 acides aminés). Les hélices sont majoritairement droitières - ce n'est que dans de rares cas, comme dans les séquences avec de nombreuses glycines, que des hélices alpha et gauchers peuvent se former. Dans l'hélice &alpha, des liaisons hydrogène se forment entre les groupes C=O et les groupes N-H dans le squelette polypeptidique qui sont distants de quatre acides aminés. Ces liaisons hydrogène sont les principales forces stabilisant l'hélice alpha.

Figure 2.23 - hélices &alpha dans une protéine avec un domaine structural de fermeture à glissière leucine. Les hélices &alpha sont représentées en bleu et vert et sont liées à une double hélice d'ADN en marron.

Nous utilisons les termes montée, répétition et hauteur pour décrire les paramètres de toute hélice. La répétition est le nombre de résidus dans une hélice avant qu'elle ne commence à se répéter. Pour une hélice &alpha, la répétition est de 3,6 acides aminés par tour d'hélice. L'élévation est la distance que l'hélice élève avec l'ajout de chaque résidu. Pour une hélice alpha, c'est 0,15 nm par acide aminé. Le pas est la distance entre les tours complets de l'hélice. Pour une hélice &alpha, c'est 0,54 nm. La stabilité d'une hélice alpha est renforcée par la présence de l'acide aminé aspartate.

Figure 2.24 - & sculpture en hélice alpha à l'extérieur de la maison d'enfance de Linus Pauling & rsquos Wikipedia Figure 2.25 - Représentation de la roue hélicoïdale d'une hélice &alpha. Le code génétique à une lettre est utilisé. L'hélice commence à Serine #77 à droite et se termine à lysine #92 en bas à droite. Les acides aminés hydrophobes sont indiqués en jaune et les acides aminés ionisants sont indiqués en bleu. Les acides aminés hydrophobes ont tendance à interagir entre eux et non avec les acides aminés ionisants. Wikipédia

&beta toron/feuille

Figure 2.26 - brin &beta

Une hélice est, bien sûr, un objet tridimensionnel. Une forme d'hélice aplatie en deux dimensions est une description courante pour un brin &beta-. Plutôt que des bobines, les brins bêta ont des coudes et ceux-ci sont parfois appelés plis, comme les plis d'un rideau. Les brins &beta peuvent être organisés pour former des structures minutieusement organisées, telles que des feuilles, des barils et d'autres arrangements.

Les structures à brin & bêta d'ordre supérieur sont parfois appelées structures supersecondaires), car elles impliquent des interactions entre des acides aminés qui ne sont pas proches dans la séquence primaire. Ces structures sont également stabilisées par des liaisons hydrogène entre les atomes d'oxygène carbonyle et les hydrogènes des groupes amine dans le squelette polypeptidique (figure 2.28). Dans une structure d'ordre supérieur, les brins peuvent être disposés parallèlement (orientations amino à carboxyle identiques) ou antiparallèles (orientations amino à carboxyle opposées l'une à l'autre (sur la figure 2.27, la direction du brin est indiquée par la pointe de flèche dans le ruban schémas).

Figure 2.27 - Représentations en ruban des arrangements supersecondaires de &bêta-feuilles (A-D) et &alpha-hélice (E-F) Image par Aleia Kim

Les virages (parfois appelés virages inversés) sont un type de structure secondaire qui, comme son nom l'indique, provoque un virage dans la structure d'une chaîne polypeptidique. Les tours donnent finalement lieu à une structure tertiaire, provoquant des interruptions dans les structures secondaires (hélices &alpha et brins &bêta) et servent souvent de régions de connexion entre deux régions de structure secondaire dans une protéine. La proline et la glycine jouent des rôles communs dans les virages, offrant respectivement moins de flexibilité (démarrage du virage) et une plus grande flexibilité (facilitant le virage).

Figure 2.28 - Composants d'une feuille &beta dans un arrangement parallèle. Liaisons H en jaune. Image par Aleia Kim

Il existe au moins cinq types de virages, avec de nombreuses variantes de chacun donnant lieu à de nombreux virages différents. Les cinq types de virages sont

&bull &delta-turns - les acides aminés terminaux sont séparés par une liaison peptidique

&bull &gamma-turns - séparation par deux liaisons peptidiques

&bull&beta-turns - séparation par trois liaisons peptidiques

&bull&alpha-turns - séparation par quatre liaisons peptidiques

&bull&pi-turns - séparation par cinq obligations

Parmi ceux-ci, les tours &bêta sont la forme la plus courante et les tours &delta sont théoriques, mais peu probables, en raison de limitations stériques. La figure 2.29 illustre un tour &beta.

310 hélices

Figure 2.29 - &bêta-tour. Les groupes R sont représentés en orange, les hydrogènes en jaune, les carbones dans le charbon de bois, les azotes en violet et les oxygènes en vert. Une liaison hydrogène stabilisante est indiquée par la ligne pointillée. Image par Aleia Kim

En plus de l'hélice &alpha, des brins &bêta et de diverses spires, d'autres structures régulières et répétitives sont observées dans les protéines, mais se produisent beaucoup moins fréquemment. Le 310 l'hélice est la quatrième structure secondaire la plus abondante dans les protéines, constituant environ 10 à 15 % de toutes les hélices. L'hélice tire son nom du fait qu'elle contient 10 acides aminés en 3 tours. Il est droitier. Des liaisons hydrogène se forment entre les acides aminés séparés de trois résidus. Le plus souvent, les 310 l'hélice apparaît à l'extrémité amine ou carboxyle d'une hélice . Comme l'hélice &alpha, les 310 l'hélice est stabilisée par la présence d'aspartate dans sa séquence.

Figure 2.30 - Vue de dessus d'une 310 Helix. Les groupes carbonyle sont en rouge et pointés vers le haut. Notez la symétrie 3 fois presque parfaite Wikipedia Figure 2.31 - Résonance de la liaison peptidique Wikipédia Figure 2.32 - Hélice &pi Wikipédia

Figure 2.33 - Plans (bleu clair) définis par le caractère doublement lié de la liaison peptidique Image d'Aleia Kim

Une hélice &pi peut être considérée comme un type spécial d'hélice &alpha. Certaines sources le décrivent comme une hélice &alpha avec un acide aminé supplémentaire coincé au milieu (Figure 2.32). Les hélices &pi ne sont pas exactement rares, se produisant au moins une fois sur 15 % de toutes les protéines. Comme l'hélice &alpha, l'hélice &pi est droitière, mais là où l'hélice &alpha a 18 acides aminés en 5 tours, l'hélice &pi a 22 acides aminés en 5 tours. Les hélices &pi ne s'étendent généralement pas sur de très longues distances. La plupart n'ont qu'une longueur d'environ 7 acides aminés et la séquence se produit presque toujours au milieu d'une région alpha-hélicoïdale.

Parcelles de Ramachandran

Figure 2.34 - Angles de rotation &omega, &psi et &phi dans un peptide Image d'Aleia Kim

En 1963, G.N. Ramachandran, C. Ramakrishnan et V. Sasisekharan ont décrit une nouvelle façon de décrire la structure des protéines. Si l'on considère le squelette d'une chaîne polypeptidique, il s'agit d'un ensemble répété de trois liaisons. Séquentiellement (dans le sens amino vers carboxyle), il s'agit 1) d'une liaison rotative (&psi) entre &alpha-carbone et &alpha-carboxyle précédant la liaison peptidique (voir ICI), 2) d'une liaison peptidique non rotative (&omega) entre le &alpha -carboxyle et &alpha-amine), et 3) une liaison rotative (&phi) entre le &alpha-amine et le &alpha-carbone suivant la liaison peptidique (voir ICI). Notez dans les figures 2.33 et 2.34 que la direction amino à carboxyle est de droite à gauche.

La présence de l'oxygène carbonyle sur le groupe &-carboxyle permet à la liaison peptidique d'exister en tant que structure résonante, ce qui signifie qu'elle se comporte parfois comme une double liaison. Les doubles liaisons ne peuvent bien sûr pas tourner, mais les liaisons de chaque côté ont une certaine liberté de rotation. Les angles &phi et &psi sont limités à certaines valeurs, car certains angles entraîneront un encombrement stérique. De plus, chaque type de structure secondaire a une plage caractéristique de valeurs pour &phi et &psi.

Figure 2.35 - Diagramme théorique de Ramachandran Image de Penelope Irving

Ramachandran et ses collègues ont effectué des calculs théoriques de la stabilité énergétique de tous les angles possibles de 0° à 360° pour chacun des angles &phi et &psi et ont tracé les résultats sur un tracé de Ramachandran (également appelé tracé &phi-&psi), délimitant les régions d'angles qui étaient théoriquement le plus stable (figure 2.35).

Trois régions principales de stabilité ont été identifiées, correspondant aux angles &phi-&psi des brins &beta (en haut à gauche), des hélices &alpha-droites (en bas à gauche) et des hélices &alpha-gauches (en haut à droite). Les tracés de la stabilité prédite sont remarquablement précis par rapport aux angles &phi-&psi des protéines réelles.

Prédiction de structure secondaire

Tableau 2.3 - Tendances relatives de chaque acide aminé à être dans une structure secondaire. Des valeurs plus élevées indiquent une plus grande tendance Image de Penelope Irving

En comparant la structure primaire (séquences d'acides aminés) aux structures protéiques 3D connues, on peut compter chaque fois qu'un acide aminé est trouvé dans une &alpha-hélice, &beta-brin/feuille, ou un tour. L'analyse informatique de milliers de ces séquences permet d'attribuer une probabilité qu'un acide aminé donné apparaisse dans chacune de ces structures. En utilisant ces tendances, on peut, avec une précision allant jusqu'à 80%, prédire des régions de structure secondaire dans une protéine en se basant uniquement sur la séquence d'acides aminés.

C'est ce que montre le tableau 2.3. L'occurrence dans la séquence primaire de trois acides aminés consécutifs avec des tendances relatives supérieures à un est un indicateur que cette région du polypeptide est dans la structure secondaire correspondante. Une ressource en ligne pour prédire les structures secondaires appelée PSIPRED est disponible ICI.

Hydrophobie

Tableau 2.4 - Scores d'hydropathie

La chimie des groupes R d'acides aminés affecte les structures dans lesquelles ils se trouvent le plus souvent. Des sous-ensembles de leurs propriétés chimiques peuvent donner des indices sur la structure et, parfois, l'emplacement cellulaire. Un excellent exemple est l'hydrophobie (tendances à éviter l'eau) de certains groupes R. Etant donné l'environnement aqueux de la cellule, de tels groupes R ne sont pas susceptibles d'être sur la surface extérieure d'une protéine repliée.

Cependant, cette règle ne s'applique pas aux régions de protéines qui peuvent être incorporées dans les bicouches lipidiques des membranes cellulaires/organites. En effet, la région de ces protéines qui forment les domaines transmembranaires sont enfouies dans l'environnement hydrophobe au milieu de la bicouche lipidique.

Il n'est pas surprenant que le balayage des séquences primaires à la recherche d'étirements d'acides aminés hydrophobes spécifiquement dimensionnés/espacés puisse aider à identifier les protéines présentes dans les membranes. Le tableau 2.4 montre les valeurs d'hydrophobie pour les groupes R des acides aminés. Dans cet ensemble, l'échelle va des valeurs positives (hydrophobe) aux valeurs négatives (hydrophile). Un graphique d'hydropathie KyteDoolittle pour la protéine membranaire du protooncogène RET est illustré à la figure 2.36. Deux régions de la protéine sont très hydrophobes comme le montrent les pics près des acides aminés 5-10 et 630-640. On peut raisonnablement s'attendre à ce que de telles régions soient situées soit à l'intérieur de la protéine repliée, soit comme faisant partie de domaines transmembranaires.

Bobines aléatoires

Figure 2.36 Diagramme d'hydropathie de Kyte-Doolittle pour le protooncogène RET Wikipedia

Certaines sections d'une protéine n'assument aucune structure régulière et discernable et sont parfois dites dépourvues de structure secondaire, bien qu'elles puissent avoir des liaisons hydrogène. De tels segments sont décrits comme étant des bobines aléatoires et peuvent avoir une fluidité dans leur structure qui leur confère de multiples formes stables. Les bobines aléatoires sont identifiables avec des méthodes spectroscopiques, telles que le dichroïsme circulaire Wikipedia et la résonance magnétique nucléaire (RMN) dans lesquelles des signaux distinctifs sont observés. Voir aussi les protéines métamorphiques (ICI) et les protéines intrinsèquement désordonnées (ICI).

Figure 2.37 - Représentation en ruban d'une épingle à cheveux &beta. Deux brins &beta en turquoise interagissent les uns avec les autres.

Structure super-secondaire

Un autre élément de la structure des protéines est plus difficile à catégoriser car il incorpore des éléments de structure secondaire et tertiaire. Appelées structure supersecondaire (ou motifs structuraux), ces structures contiennent plusieurs composants de structure secondaires proches disposés de manière spécifique et qui apparaissent dans plusieurs protéines. Puisqu'il existe de nombreuses façons de fabriquer des structures secondaires à partir de différentes structures primaires, des motifs similaires peuvent également provenir de différentes séquences primaires. Un exemple de motif structurel est illustré à la figure 2.37.

Structure tertiaire

Figure 2.38 - Pliage d'une chaîne polypeptidique

Les protéines se distinguent les unes des autres par la séquence d'acides aminés qui les composent. La séquence d'acides aminés d'une protéine détermine la forme de la protéine, car les propriétés chimiques de chaque acide aminé sont des forces qui donnent lieu à des interactions intermoléculaires pour commencer à créer des structures secondaires, telles que des hélices &alpha et des brins &beta. La séquence définit également des tours et des bobines aléatoires qui jouent un rôle important dans le processus de repliement des protéines.

La forme étant essentielle à la fonction des protéines, la séquence d'acides aminés donne naissance à toutes les propriétés d'une protéine. Au fur et à mesure que la synthèse des protéines progresse, les composants individuels de la structure secondaire commencent à interagir les uns avec les autres, donnant lieu à des replis qui rapprochent les acides aminés qui ne sont pas proches les uns des autres dans la structure primaire (figure 2.38). Au niveau tertiaire de la structure, les interactions entre les groupes R des acides aminés dans la protéine, ainsi qu'entre le squelette polypeptidique et les groupes latéraux d'acides aminés jouent un rôle dans le repliement.

Protéines globulaires

Figure 2.39 - Dépliement (dénaturation) d'une protéine Wikipédia

Le pliage donne naissance à des formes 3D distinctes dans les protéines non fibreuses. Ces protéines sont appelées globulaires.Une protéine globulaire est stabilisée par les mêmes forces qui conduisent à sa formation. Ceux-ci incluent les interactions ioniques, les liaisons hydrogène, les forces hydrophobes, les liaisons ioniques, les liaisons disulfure et les liaisons métalliques. Des traitements tels que la chaleur, les changements de pH, les détergents, l'urée et le mercaptoéthanol dominent les forces stabilisatrices et provoquent le déploiement d'une protéine, perdant sa structure et (généralement) sa fonction (figure 2.39). La capacité de la chaleur et des détergents à dénaturer les protéines est la raison pour laquelle nous cuisinons nos aliments et nous lavons les mains avant de manger - de tels traitements dénaturent les protéines des micro-organismes sur nos mains. Les organismes qui vivent dans des environnements à haute température (plus de 50 °C) ont des protéines avec des changements dans les forces stabilisatrices - des liaisons hydrogène supplémentaires, des ponts salins supplémentaires (interactions ioniques) et la compacité peuvent tous jouer un rôle pour empêcher ces protéines de se déployer.

Forces de stabilisation des protéines

Avant de considérer le processus de repliement, considérons certaines des forces qui aident à stabiliser les protéines.

Liaisons hydrogène

Figure 2.40 - Liaisons hydrogène (traits pointillés) entre deux molécules d'acide acétique

Les liaisons hydrogène résultent d'hydrogènes partiellement chargés trouvés dans les liaisons covalentes. Cela se produit lorsque l'atome auquel l'hydrogène est lié a une plus grande électronégativité que l'hydrogène lui-même, ce qui entraîne une charge positive partielle de l'hydrogène car il n'est pas capable de retenir les électrons près de lui (figure 2.40).

L'hydrogène partiellement chargé de cette manière est attiré par les atomes, tels que l'oxygène et l'azote qui ont des charges négatives partielles, en raison d'une plus grande électronégativité et donc de la proximité des électrons. Les hydrogènes partiellement chargés positivement sont appelés donneurs, tandis que les atomes partiellement négatifs vers lesquels ils sont attirés sont appelés accepteurs. (Voir Figure 1.30).

Figure 2.41 - Liaison hydrogène dans l'eau liquide Wikipédia

Les liaisons hydrogène individuelles sont beaucoup plus faibles qu'une liaison covalente, mais collectivement, elles peuvent exercer des forces puissantes. Considérons l'eau liquide, qui contient un nombre énorme de liaisons hydrogène (figure 2.41). Ces forces aident l'eau à rester liquide à température ambiante. D'autres molécules dépourvues de liaisons hydrogène de poids moléculaire égal ou supérieur à celui de l'eau, telles que le méthane ou le dioxyde de carbone, sont des gaz à la même température. Ainsi, les interactions intermoléculaires entre les molécules d'eau aident à « retenir » l'eau ensemble et à rester liquide. Notamment, ce n'est qu'en élevant la température de l'eau à ébullition que les forces de liaison hydrogène sont surmontées, permettant à l'eau de devenir entièrement gazeuse.

Les liaisons hydrogène sont des forces importantes dans les biopolymères qui incluent l'ADN, les protéines et la cellulose. Tous ces polymères perdent leurs structures natives lors de l'ébullition. Les liaisons hydrogène entre les acides aminés qui sont proches les uns des autres dans la structure primaire peuvent donner lieu à des structures répétitives régulières, telles que des hélices ou des plis, dans les protéines (structure secondaire).

Interactions ioniques

Les interactions ioniques sont des forces importantes stabilisant la structure de la protéine qui résultent de l'ionisation des groupes R dans les acides aminés comprenant une protéine. Ceux-ci comprennent les acides aminés carboxyles (ICI), les acides aminés aminés ainsi que le sulfhydryle de la cystéine et parfois l'hydroxyle de la tyrosine.

Forces hydrophobes

Les forces hydrophobes stabilisent la structure des protéines à la suite d'interactions qui favorisent l'exclusion de l'eau. Les acides aminés non polaires (généralement présents à l'intérieur des protéines) favorisent l'association les uns avec les autres et cela a pour effet d'exclure l'eau. L'eau exclue a une entropie plus élevée que l'eau interagissant avec les chaînes latérales hydrophobes. En effet, l'eau s'aligne très régulièrement et selon un schéma distinct lorsqu'elle interagit avec des molécules hydrophobes.

Lorsque l'eau est empêchée d'avoir ce genre d'interactions, elle est beaucoup plus désordonnée qu'elle ne le serait si elle pouvait s'associer aux régions hydrophobes. C'est en partie pour cette raison que les acides aminés hydrophobes se trouvent à l'intérieur des protéines - ils peuvent donc exclure l'eau et augmenter l'entropie.

Liaisons disulfure

Figure 2.42 - Formation d'une liaison disulfure

Les liaisons disulfure, qui se forment lorsque deux chaînes latérales sulfhydryle de la cystéine sont rapprochées, relient de manière covalente différentes régions protéiques et peuvent donner une grande force à la structure globale (figures 2.42 et 2.43). Une ode à la structure des protéines par Kevin Ahern Les vingt petits acides aminés A définissent une protéine de plusieurs façons arrive quand une protéine se plie Mais les chaînes pliées sont carrément effrayantes Une fois assemblées au quaternaire Ce sont des merveilles de la nature, c'est sûr Créer des problèmes, faire des remèdes Un imbécile peut façonner des poèmes peptidiques Mais les protéines proviennent des ribosoèmes Ces résidus joints de cystéine sont parfois appelés cystine. Les liaisons disulfure sont les plus fortes des forces stabilisant la structure des protéines.

Figure 2.43 - Cystine - Deux cystéines reliées par une liaison disulfure

forces de van der Waals

Les forces de van der Waals sont un terme utilisé pour décrire diverses interactions faibles, y compris celles causées par l'attraction entre une molécule polaire et un dipôle transitoire, ou entre deux dipôles temporaires. Les forces de van der Waals sont dynamiques en raison de la nature fluctuante de l'attraction, et sont généralement faibles par rapport aux liaisons covalentes, mais peuvent, sur de très courtes distances, être importantes.

Modifications post-traductionnelles

Les modifications post-traductionnelles peuvent également entraîner la formation de liaisons covalentes stabilisant les protéines. L'hydroxylation de la lysine et de la proline dans les brins de collagène peut entraîner la réticulation de ces groupes et les liaisons covalentes résultantes aident à renforcer et à stabiliser le collagène.

Modèles pliants

Deux modèles populaires de repliement des protéines sont actuellement à l'étude. Dans le premier (modèle de collision de diffusion), un événement de nucléation commence le processus, suivi de la formation de la structure secondaire. Les collisions entre les structures secondaires (comme dans l'épingle &beta de la figure 2.37) permettent au pliage de commencer. En revanche, dans le modèle de nucléation-condensation, les structures secondaire et tertiaire se forment ensemble.

Le repliement des protéines se produit assez rapidement (0,1 à 1 000 secondes) et peut se produire pendant la synthèse - l'extrémité aminée d'une protéine peut commencer à se replier avant même que l'extrémité carboxyle ne soit formée, bien que ce ne soit pas toujours le cas.

Processus de pliage

Figure 2.44 Modèle énergétique de l'entonnoir pliable de Wikipédia pliable

Le repliement des protéines est supposé se produire dans un paysage énergétique "d'entonnoir de repliement" dans lequel un état natif de protéine repliée correspond à l'énergie libre minimale possible dans les conditions du milieu (généralement un solvant aqueux) dans lequel la protéine est dissoute. Comme le montre le diagramme (figure 2.44), l'entonnoir d'énergie a de nombreux minima locaux (creux) dans lesquels une protéine de repliement peut être piégée lorsqu'elle se déplace vers le bas de la parcelle d'énergie. D'autres facteurs, tels que la température, les champs électriques/magnétiques et les considérations spatiales jouent probablement un rôle.

Si des forces externes affectent les minima d'énergie locaux pendant le pliage, le processus et le produit final peuvent être influencés. Comme la vitesse d'une voiture sur une route affectera la sécurité du voyage, les considérations énergétiques influencent et guident également le processus de repliement, ce qui entraîne des protéines entièrement fonctionnelles et correctement repliées dans certains cas et des "erreurs" mal repliées dans d'autres.

Être coincé

Au fur et à mesure que le processus de repliement progresse vers un minimum d'énergie (en bas de l'entonnoir sur la figure 2.44), une protéine peut se retrouver dans l'un des minima locaux et ne pas atteindre l'état replié final. Bien que l'état replié soit, en général, plus organisé et ait donc une entropie réduite que l'état déplié, il existe deux forces qui surmontent la diminution de l'entropie et font avancer le processus.

Le premier est l'ampleur de la diminution de l'énergie comme le montre le graphique. Puisque &DeltaG = &DeltaH -T&DeltaS, une diminution de &DeltaH peut surmonter un &DeltaS négatif pour rendre &DeltaG négatif et faire avancer le processus de pliage. Des conditions énergétiques favorables (diminuées) surviennent avec la formation de liaisons ioniques, de liaisons hydrogène, de liaisons disulfure et de liaisons métalliques pendant le processus de repliement. De plus, l'effet hydrophobe augmente l'entropie en permettant aux acides aminés hydrophobes à l'intérieur d'une protéine repliée d'exclure l'eau, contrant ainsi l'impact de l'ordre de la structure de la protéine en rendant le &DeltaS moins négatif.

Prédiction de structure

Les programmes informatiques sont très bons pour prédire la structure secondaire uniquement sur la base de la séquence d'acides aminés, mais ont du mal à déterminer la structure tertiaire en utilisant les mêmes informations. Cela est en partie dû au fait que les structures secondaires ont des points de stabilisation répétés basés sur la géométrie et que toute structure secondaire régulière (par exemple, &alpha-hélice) varie très peu d'une à l'autre. Les structures pliées, cependant, ont un nombre énorme de structures possibles comme le montre Levinthal&rsquos Paradox.

Spectroscopie

En raison de notre incapacité à prédire avec précision la structure tertiaire basée sur la séquence d'acides aminés, les structures des protéines sont en fait déterminées à l'aide de techniques de spectroscopie. Dans ces approches, les protéines sont soumises à diverses formes de rayonnement électromagnétique et la manière dont elles interagissent avec le rayonnement permet aux chercheurs de déterminer les coordonnées atomiques à une résolution d'Angstrom à partir des densités d'électrons (voir cristallographie aux rayons X) et comment les spins des noyaux interagissent (voir RMN).

Paradoxe de Levinthal

À la fin des années 1960, Cyrus Levinthal a souligné l'ampleur de la complexité du problème de repliement des protéines. Il a souligné que pour une protéine avec 100 acides aminés, elle aurait 99 liaisons peptidiques et 198 considérations pour les angles &phi et &psi. Si chacun d'entre eux n'avait que trois conformations, cela donnerait 3198 pliages différents possibles ou 2,95x1094.

Même en accordant un laps de temps raisonnable (une nanoseconde) pour que chaque pli possible se produise, il faudrait plus de temps que l'âge de l'univers pour tous les échantillonner, ce qui signifie clairement que le processus de pliage ne se produit pas par un échantillonnage aléatoire séquentiel et que les tentatives de détermination de la structure des protéines par échantillonnage aléatoire étaient vouées à l'échec. Levinthal a donc proposé que le repliement se produise par un processus séquentiel qui commence par un événement de nucléation qui guide le processus rapidement et n'est pas sans rappeler le processus en entonnoir illustré à la figure 2.44.

Maladies du mauvais repliement des protéines

Figure 2.45 - Mauvais repliement de la protéine PRPc normale induite par PRPsc Image de Penelope Irving

Le bon repliement des protéines est essentiel à leur fonction. Il s'ensuit alors qu'un mauvais repliement des protéines (également appelé protéopathie) pourrait avoir des conséquences. Dans certains cas, cela peut simplement entraîner une protéine inactive. Le mauvais repliement des protéines joue également un rôle dans de nombreuses maladies, telles que la maladie de la vache folle, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et la maladie de CreutzfeldJakob. De nombreuses maladies mal repliées, mais pas toutes, affectent le tissu cérébral.

Figure 2.46 - Les vaches atteintes de la maladie de la vache folle perdent leur capacité de se tenir debout

Dépôts insolubles

Les protéines mal repliées forment généralement des agrégats appelés amyloïdes qui sont nocifs pour les tissus qui les contiennent car ils passent de solubles à insolubles dans l'eau et forment des dépôts. Le processus par lequel se produit un mauvais repliement (figure 2.45) n'est pas tout à fait clair, mais dans de nombreux cas, il a été démontré qu'une protéine "mal repliée" peut induire le même mauvais repliement dans d'autres copies de la même protéine. Ces protéines de graines sont connues sous le nom de prions et elles agissent comme des agents infectieux, entraînant la propagation de maladies. La liste des maladies humaines liées au mauvais repliement des protéines est longue et continue de s'allonger. Un lien Wikipédia est ICI.

Figure 2.47 - Amylose diffuse dans un vaisseau sanguin (points rouges) Wikipédia

Les prions sont des particules de protéines infectieuses qui provoquent des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), dont la plus connue est la maladie de la vache folle. D'autres manifestations comprennent la maladie, la tremblante du mouton et des maladies humaines, telles que la maladie de CreutzfeldtJakob (MCJ), l'insomnie familiale fatale et le kuru. La protéine impliquée dans ces maladies est une protéine membranaire appelée PrP. La PrP est codée dans le génome de nombreux organismes et se trouve dans la plupart des cellules du corps. PrPc est le nom donné à la structure de la PrP qui est normale et non associée à la maladie. PrPSc est le nom donné à une forme mal repliée de la même protéine, qui est associée au développement des symptômes de la maladie (Figure 2.45).

La PrPSc mal repliée est associée aux maladies EST et agit comme une particule infectieuse. Une troisième forme de PrP, appelée PrPres, peut être trouvée dans les EST, mais n'est pas infectieuse. Le &lsquores&rsquo de PrPres indique qu'il est résistant aux protéases. Il convient de noter que les trois formes de PrP ont la même séquence d'acides aminés et ne diffèrent les unes des autres que par la manière dont les chaînes polypeptidiques sont repliées. La forme de PrP la plus dangereusement mal repliée est la PrPSc, en raison de sa capacité à agir comme un agent infectieux - une protéine de graine qui peut induire un mauvais repliement de la PrPc, la convertissant ainsi en PrPSc.

Figure 2.48 - Un modèle de propagation des prions Wikipedia

La fonction de PrPc est inconnue. Les souris dépourvues du gène PrP ne présentent pas d'anomalies majeures. Ils semblent présenter des problèmes de mémoire à long terme, suggérant une fonction pour PrPc. Stanley Prusiner, qui a découvert les prions et inventé le terme, a reçu le prix Nobel de médecine en 1997 pour ses travaux. Je pense que si j'avais la chance d'être sur une protéine constituant un prion, je le tordrais et pour l'amour de Dieu, l'empêche de faire des erreurs de pli

Les amyloïdes sont une collection d'agrégats de protéines mal repliés que l'on trouve dans le corps humain. Du fait de leur mauvais repliement, ils sont insolubles et contribuent à une vingtaine de maladies humaines dont d'importantes neurologiques impliquant des prions. Les maladies comprennent (protéine affectée entre parenthèses) - la maladie d'Alzheimer (amyloïde et bêta), la maladie de Parkinson (et alpha-synucléine), la maladie de Huntington (huntingtin), la polyarthrite rhumatoïde (sérum amyloïde A), l'insomnie familiale mortelle (PrPSc) et autres.

La séquence d'acides aminés joue un rôle dans l'amyloïdogenèse. Les polypeptides riches en glutamine sont courants dans la levure et les prions humains. Les répétitions de trinucléotides sont importantes dans la maladie de Huntington. Lorsque la séquence n'est pas un facteur, l'association hydrophobe entre les feuillets & peut jouer un rôle.

Figure 2.49 - Huntingtine

Amyloïde & bêta fait référence à des ensembles de petites protéines (36-43 acides aminés) qui semblent jouer un rôle dans la maladie d'Alzheimer. (La protéine Tau est l'autre facteur.) Ils sont, en fait, les principaux composants des plaques amyloïdes trouvées dans le cerveau des patients souffrant de la maladie et résultent du clivage protéolytique d'une glycoprotéine précurseur amyloïde plus grande appelée protéine précurseur amyloïde, une membrane intégrale protéine des cellules nerveuses dont la fonction n'est pas connue. Deux protéases, la &beta-secretase et la &gamma-secretase remplissent cette fonction. Les protéines amyloïdes et bêta sont mal repliées et semblent induire un mauvais repliement d'autres protéines et ainsi précipiter et former l'amyloïde caractéristique de la maladie. Les plaques sont toxiques pour les cellules nerveuses et provoquent la démence caractéristique de la maladie.

On pense que l'agrégation des protéines amyloïdes et bêta au cours d'un mauvais repliement conduit à la génération d'espèces réactives de l'oxygène et que c'est le moyen par lequel les neurones sont endommagés. On ne sait pas quelle est la fonction réelle de l'amyloïde & bêta. Des mutations autosomiques dominantes dans la protéine conduisent à l'apparition précoce de la maladie, mais cela ne se produit que dans 10 % des cas. Les stratégies de traitement de la maladie comprennent l'inhibition des sécrétases qui génèrent les fragments peptidiques à partir de la protéine précurseur amyloïde.

La Huntingtine est le gène central de la maladie de Huntington. La protéine fabriquée à partir de celle-ci est riche en glutamine, avec 6 à 35 de ces résidus sous sa forme de type sauvage. Dans la maladie de Huntington, ce gène est muté, augmentant le nombre de glutamines dans la protéine mutante entre 36 et 250. La taille de la protéine varie avec le nombre de glutamines dans la protéine mutante, mais la protéine de type sauvage a plus de 3100 amino acides et un poids moléculaire d'environ 350 000 Da. Sa fonction précise n'est pas connue, mais la huntingtine se trouve dans les cellules nerveuses, avec le niveau le plus élevé dans le cerveau. On pense qu'il pourrait jouer un rôle dans le transport, la signalisation et la protection contre l'apoptose. La huntingtine est également nécessaire au développement embryonnaire précoce. Au sein de la cellule, la huntingtine est localisée principalement dans les microtubules et les vésicules.

Répétition trinucléotidique

Le gène de la huntingtine contient de nombreuses copies de la séquence CAG (appelées répétitions trinucléotidiques), qui codent pour les nombreuses glutamines de la protéine. La maladie de Huntington survient lorsque des copies supplémentaires de la séquence CAG sont générées lorsque l'ADN du gène est copié. L'expansion de séquences répétées peut se produire en raison du glissement de la polymérase par rapport à la matrice d'ADN pendant la réplication. En conséquence, de multiples copies supplémentaires de la répétition trinucléotidique peuvent être réalisées, résultant en des protéines avec des nombres variables de résidus glutamine. Jusqu'à 35 répétitions peuvent être tolérées sans problème. Le nombre de répétitions peut augmenter au cours de la vie d'une personne, cependant, par le même mécanisme. Les individus avec 36-40 répétitions commencent à montrer des signes de la maladie et s'il y en a plus de 40, la maladie sera présente.

Chaperons moléculaires

L'importance du bon repliement des protéines est mise en évidence par les maladies associées aux protéines mal repliées, il n'est donc pas surprenant que les cellules dépensent de l'énergie pour faciliter le bon repliement des protéines. Les cellules utilisent deux classes de protéines connues sous le nom de chaperons moléculaires, pour faciliter un tel repliement dans les cellules. Les chaperons moléculaires sont de deux sortes, les chaperons et les chaperonins. Un exemple de la première catégorie est la classe de protéines Hsp70. Hsp signifie « protéine de choc thermique », sur la base du fait que ces protéines ont d'abord été observées en grande quantité dans des cellules qui avaient été brièvement soumises à des températures élevées. Les hsp ont pour fonction d'assister les cellules dans les stress résultant d'un choc thermique et d'une exposition à des conditions oxydantes ou à des métaux lourds toxiques, tels que le cadmium et le mercure. Cependant, ils jouent également un rôle important dans des conditions normales, où ils aident au bon repliement des polypeptides en empêchant les interactions aberrantes qui pourraient conduire à un mauvais repliement ou à une agrégation. Les protéines Hsp70 se trouvent dans presque toutes les cellules et utilisent l'hydrolyse de l'ATP pour stimuler les changements structurels dans la forme du chaperon pour permettre la liaison des protéines substrats. Le domaine de liaison de Hsp70s contient une structure de tonneau qui s'enroule autour de la chaîne polypeptidique du substrat et a une affinité pour les chaînes latérales hydrophobes d'acides aminés. Comme le montre la figure 2.50, Hsp70 se lie aux polypeptides lorsqu'ils émergent des ribosomes au cours de la synthèse des protéines. La liaison du substrat stimule l'hydrolyse de l'ATP et ceci est facilité par une autre protéine de choc thermique connue sous le nom de Hsp40.L'hydrolyse de l'ATP amène la Hsp70 à adopter une conformation fermée qui aide à protéger les résidus hydrophobes exposés et à empêcher l'agrégation ou un mauvais repliement local.

Une fois la synthèse protéique terminée, l'ADP est libéré et remplacé par l'ATP, ce qui entraîne la libération de la protéine substrat, qui permet ensuite au polypeptide complet de se replier correctement.

Figure 2.50 - Action de Hsp70 (bleu) pour faciliter le bon repliement d'une protéine (orange) Image d'Aleia Kim

En choc thermique

En période de choc thermique ou de stress oxydatif, les protéines Hsp70 se lient aux régions hydrophobes dépliées des protéines pour les empêcher de même de s'agréger et de leur permettre de se replier correctement. Lorsque les protéines sont endommagées, Hsp70 recrute des enzymes qui ubiquitinent la protéine endommagée pour les cibler en vue de leur destruction dans les protéasomes. Ainsi, les protéines Hsp70 jouent un rôle important en garantissant non seulement que les protéines sont correctement repliées, mais que les protéines endommagées ou non fonctionnelles sont éliminées par dégradation dans le protéasome.

Chaperonins

Une deuxième classe de protéines impliquées dans l'assistance à d'autres protéines pour se replier correctement est appelée chaperonines. Il existe deux catégories principales de chaperonines - la classe I (présente dans les bactéries, les chloroplastes et les mitochondries) et la classe II (présente dans le cytosol des eucaryotes et des archaebactéries). Les chaperonines les mieux étudiées sont les protéines complexes GroEL/GroES présentes dans les bactéries (Figure 2.51).

Figure 2.51 - Vue du bas du GroEL (à gauche) et du complexe GroEL/ GroES (à droite) Wikipédia

GroEL/GroES peut ne pas être capable de défaire les protéines agrégées, mais en facilitant un repliement correct, il fournit une compétition pour un repliement incorrect en tant que processus et peut réduire ou éliminer les problèmes résultant d'un repliement incorrect. GroEL est un 14mère à double anneau avec une région hydrophobe qui peut faciliter le repliement de substrats de 15 à 60 kDa. GroES est un heptamère à anneau unique qui se lie à GroEL en présence d'ATP et fonctionne comme une couverture sur GroEL. L'hydrolyse de l'ATP par les chaperonines induit d'importants changements de conformation qui affectent la liaison des protéines substrats et leur repliement. On ne sait pas exactement comment les chaperonines replient les protéines. Les modèles passifs postulent le fonctionnement inerte du complexe chaperonine en empêchant les interactions intermoléculaires défavorables ou en imposant des restrictions sur les espaces disponibles pour le repliement. Les modèles actifs proposent que les changements structurels du complexe chaperonine induisent des changements structurels dans la protéine substrat.

Décomposition des protéines

Figure 2.52 - Protéasome 26S. Site actif affiché en rouge Wikipedia

Un autre complexe protéique qui a une fonction importante dans la dynamique de vie des protéines est le protéasome (Figure 2.52). Les protéasomes, que l'on trouve chez tous les eucaryotes et archéens, ainsi que certaines bactéries, ont pour fonction de décomposer les protéines inutiles ou endommagées par dégradation protéolytique. Les protéasomes aident à réguler la concentration de certaines protéines et à dégrader celles qui sont mal repliées. La voie de dégradation du protéasome joue un rôle important dans les processus cellulaires qui incluent la progression dans le cycle cellulaire, la modulation de l'expression des gènes et la réponse aux stress oxydatifs.

La dégradation du protéasome donne des peptides courts de sept à huit acides aminés. Les protéases à thréonine jouent un rôle important. La décomposition de ces peptides donne des acides aminés individuels, facilitant ainsi leur recyclage dans les cellules. Les protéines sont ciblées pour la dégradation dans les protéasomes eucaryotes par fixation à de multiples copies d'une petite protéine appelée ubiquitine (8,5 kDa - 76 acides aminés). L'enzyme catalysant la réaction est connue sous le nom d'ubiquitine ligase. La chaîne de polyubiquitine résultante est liée par le protéasome et la dégradation commence. L'ubiquitine a été nommée en raison de sa présence omniprésente dans les cellules eucaryotes.

Figure 2.53 - Ubiquitine (chaînes latérales de la lysine représentées en jaune) Wikipedia

L'ubiquitine (figure 2.53) est une petite protéine multifonctionnelle (8,5 kDa) présente dans les cellules eucaryotes. Il est couramment ajouté aux protéines cibles par l'action des enzymes ubiquitine ligase (E3 sur la figure 2.54). Une (ubiquitination) ou plusieurs (polyubiquitination) molécules d'ubiquitine peuvent être ajoutées. L'attachement de l'ubiquitine se fait par la chaîne latérale de l'un des sept résidus lysine différents de l'ubiquitine.

L'ajout d'ubiquitine aux protéines a de nombreux effets, dont le plus connu est de cibler la protéine pour la dégradation dans le protéasome. Le ciblage du protéasome est observé lorsque la polyubiquitination se produit au niveau des lysines n° 29 et 48. La polyubiquitination ou la monoubiquitination au niveau d'autres lysines peut entraîner une altération de la localisation cellulaire et des interactions protéine-protéine modifiées. Ce dernier peut altérer l'inflammation, le trafic endocytaire, la traduction et la réparation de l'ADN.

Figure 2.54 - Voie d'ubiquitination d'une protéine substrat cible Image de Pehr Jacobson

Dysfonctionnement de l'ubiquitine ligase

Parkin est une protéine liée à la maladie de Parkinson qui, lorsqu'elle est mutée, est liée à une forme héréditaire de la maladie appelée maladie de Parkinson juvénile autosomique récessive. La fonction de la protéine n'est pas connue, mais c'est un composant du système d'ubiquitine ligase E3 responsable du transfert d'ubiquitine de la protéine E2 à une chaîne latérale de lysine sur la protéine cible. On pense que les mutations de la parkin entraînent un dysfonctionnement du protéasome et une incapacité conséquente à décomposer les protéines nocives pour les neurones dopaminergiques. Cela entraîne la mort ou un dysfonctionnement de ces neurones, entraînant la maladie de Parkinson.

Protéines intrinsèquement désordonnées

Film 2.1 - Mouvement dynamique du cytochrome C en solution Wikipédia

Comme le montrent les nombreux exemples décrits ailleurs dans le livre, la structure 3-D des protéines est importante pour leur fonction. Mais, de plus en plus, il devient évident que toutes les protéines ne se replient pas dans une structure stable. Des études sur les protéines dites intrinsèquement désordonnées (IDP) au cours des deux dernières décennies ont montré que de nombreuses protéines sont biologiquement actives, même si elles ne parviennent pas à se replier dans des structures stables. Encore d'autres protéines présentent des régions qui restent dépliées (régions IDP) alors même que le reste du polypeptide se replie sous une forme structurée.

Les protéines intrinsèquement désordonnées et les régions désordonnées au sein des protéines sont en fait connues depuis de nombreuses années, mais ont été considérées comme une anomalie. Ce n'est que récemment, avec la réalisation que les IDP et les régions IDP sont répandues parmi les protéines eucaryotes, qu'il a été reconnu que le trouble observé est une "caractéristique, pas un bogue".

Film 2.2 SUMO-1, une protéine avec des sections intrinsèquement désordonnées Wikipedia

La comparaison des IDP montre qu'ils partagent des caractéristiques de séquence qui semblent favoriser leur état désordonné. C'est-à-dire que, tout comme certaines séquences d'acides aminés peuvent favoriser le repliement d'un polypeptide dans une structure particulière, les séquences d'acides aminés des IDP favorisent leur dépliement. Les régions IDP sont considérées comme étant faibles en résidus hydrophobes et exceptionnellement riches en résidus polaires et en proline. La présence d'un grand nombre d'acides aminés chargés dans les IDP peut inhiber le repliement par répulsion de charge, tandis que le manque de résidus hydrophobes rend difficile la formation d'un noyau hydrophobe stable, et la proline décourage la formation de structures hélicoïdales. Les différences observées entre les séquences d'acides aminés dans les IDP et les protéines structurées ont été utilisées pour concevoir des algorithmes permettant de prédire si une séquence d'acides aminés donnée sera désordonnée.

Quelle est la signification des protéines ou régions intrinsèquement désordonnées ? Le fait que cette propriété soit codée dans leurs séquences d'acides aminés suggère que leur trouble peut être lié à leur fonction. La nature flexible et mobile de certaines régions IDP peut jouer un rôle crucial dans leur fonction, permettant une transition vers une structure repliée lors de la liaison à un partenaire protéique ou en subissant une modification post-traductionnelle. Des études sur plusieurs protéines bien connues avec des régions IDP suggèrent quelques réponses. Les régions IDP peuvent améliorer la capacité de protéines telles que le répresseur lac à se déplacer le long de l'ADN pour rechercher des sites de liaison spécifiques. La flexibilité des IDP peut également être un atout dans les interactions protéine-protéine, en particulier pour les protéines connues pour interagir avec de nombreux partenaires protéiques différents.

Figure 2.55 - Dénaturation et renaturation de la ribonucléase Wikipédia

Par exemple, p53 a des régions IDP qui peuvent permettre à la protéine d'interagir avec une variété de partenaires fonctionnels. La comparaison des fonctions connues des protéines avec les prédictions de désordre dans ces protéines suggère que les IDP et les régions IDP peuvent fonctionner de manière disproportionnée dans la signalisation et la régulation, tandis que les protéines plus structurées penchent vers des rôles dans la catalyse et le transport. Il est intéressant de noter que de nombreuses protéines trouvées dans les ribosomes et les spliceosomes devraient avoir des régions IDP qui pourraient jouer un rôle dans l'assemblage correct de ces complexes. Même si les personnes déplacées n'ont pas fait l'objet d'études intensives depuis très longtemps, le peu d'informations disponibles à leur sujet suggère qu'elles jouent un rôle important et sous-estimé dans les cellules.

Protéines métamorphiques

Un autre groupe de protéines qui a récemment changé notre conception de la structure et de la fonction des protéines est ce qu'on appelle les protéines métamorphiques. Ces protéines sont capables de former plus d'un état replié stable à partir d'une seule séquence d'acides aminés. Bien qu'il soit vrai que les conformations repliées multiples ne soient pas exclues par les lois de la physique et de la chimie, les protéines métamorphiques sont une découverte relativement nouvelle. On savait, bien sûr, que les protéines prions étaient capables de se replier dans des structures alternatives, mais les protéines métamorphiques semblent être capables de basculer entre deux structures stables. Alors que dans certains cas, la protéine métamorphique subit ce changement en réponse à la liaison d'une autre molécule, certaines protéines peuvent accomplir cette transition par elles-mêmes. Un exemple intéressant est la molécule de signalisation, la lymphotactine. La lymphotactine a deux fonctions biologiques qui sont réalisées par ses deux conformères : une forme monomère qui se lie au récepteur de la lymphotactine et une forme dimère qui se lie à l'héparine. Il est possible que ce type de commutation soit plus répandu qu'on ne le pensait.

Repliage des protéines dénaturées

Toutes les informations relatives au repliement des protéines sont contenues dans la séquence d'acides aminés de la protéine. Il peut alors sembler curieux que la plupart des protéines ne se replient pas dans leur forme appropriée et pleinement active après avoir été +++ dénaturées et le dénaturant éliminé. Quelques-uns le font, en fait. Un bon exemple est la ribonucléase bovine (Figure 2.55). Son activité catalytique est très résistante à la chaleur et à l'urée et les tentatives de dénaturation ne fonctionnent pas très bien. Cependant, si l'on traite l'enzyme avec du &bêta-mercaptoéthanol (qui brise les liaisons disulfure) avant le traitement à l'urée et/ou le chauffage, l'activité est perdue, ce qui indique que les liaisons disulfure covalentes aident à stabiliser la structure globale de l'enzyme et lorsqu'elles sont rompues, la dénaturation peut se produisent facilement. Lorsque le mélange revient à température ambiante, une certaine activité enzymatique réapparaît avec le temps, indiquant que la ribonucléase s'est repliée dans les nouvelles conditions.

Fait intéressant, la renaturation se produira au maximum si une infime quantité de &beta-mercaptoéthanol est laissée dans la solution pendant le processus. La raison en est que le &beta-mercaptoéthanol permet la réduction (et la rupture) des liaisons disulfure accidentelles et incorrectes pendant le processus de pliage. Sans cela, ces liaisons disulfure empêcheront la formation de plis appropriés.

Dénaturation irréversible

Cependant, la plupart des enzymes ne se comportent pas comme la ribonucléase bovine. Une fois dénaturée, leur activité ne peut pas être récupérée de manière significative Il n'y a pas beaucoup de façons d'inactiver la RNase Elle est stable à chaud ou à froid Parce que les disulfures tiennent fermement Si vous souhaitez le faire caler Utilisez une mesure de mercaptoéthanol chaud. Cela peut sembler contredire l'idée que l'information de repliement soit inhérente à la séquence d'acides aminés dans la protéine. Ce ne est pas.

La plupart des enzymes ne se replient pas correctement après dénaturation pour deux raisons. Premièrement, un repliement normal peut se produire lors de la fabrication des protéines. Les interactions entre les acides aminés au début de la synthèse ne sont pas "confondues" par les interactions avec les acides aminés plus tard dans la synthèse car ces acides aminés ne sont pas présents au démarrage du processus.

Rôle des chaperonins

Dans d'autres cas, le processus de repliement de certaines protéines dans la cellule reposait sur l'action des protéines chaperonines (voir ICI). En l'absence de chaperonines, des interactions pouvant entraîner un mauvais repliement se produisent, empêchant ainsi un bon repliement. Ainsi, le repliement précoce et l'assistance de chaperonines éliminent certaines interactions potentielles de « repliement erroné » qui peuvent se produire si la séquence entière était présente au début du repliement.

Structure quaternaire

Un quatrième niveau de structure protéique est celui de la structure quaternaire. Il fait référence à des structures résultant d'interactions entre plusieurs polypeptides. Les unités peuvent être des copies multiples identiques ou peuvent être des chaînes polypeptidiques différentes. L'hémoglobine adulte est un bon exemple de protéine à structure quaternaire, composée de deux chaînes identiques appelées &alpha et de deux chaînes identiques appelées &beta.

Bien que les chaînes &alpha soient très similaires aux chaînes &bêta, elles ne sont pas identiques. Les chaînes &alpha et &beta sont toutes deux liées à la chaîne polypeptidique unique dans la protéine apparentée appelée myoglobine. La myoglobine et l'hémoglobine ont une similitude dans la liaison de l'oxygène, mais leur comportement envers la molécule diffère considérablement. Notamment, les sous-unités multiples de l'hémoglobine (avec structure quaternaire) par rapport à la sous-unité unique de la myoglobine (sans structure quaternaire) donnent lieu à ces différences.


Conclusion

Le conflit supposé entre les points de vue classique et nouveau peut être résolu en réalisant qu'ils touchent à des parties différentes mais également essentielles du mécanisme de pliage. L'expérience en laboratoire est capable de discerner le comportement moléculaire macroscopique, mais elle est aveugle au comportement de recherche microscopique au niveau des acides aminés thermiquement conduit qui a été le domaine de l'analyse théorique. La recherche multipiste microscopique désordonnée envisagée dans le nouveau modèle de vue paradigmatique décrit la recherche au niveau des acides aminés de l'étape initiale pour former des structures de plis coopératifs de type natif, mais pas l'état natif final. L'expérience affiche un comportement macroscopique émergent basé sur les plions qui fournit le guidage structurel et le biais d'énergie libre pour la formation ordonnée par étapes d'intermédiaires discrets de type natif dans une voie de pliage qui mène à l'état natif.

Le repliement en unités modérément petites et coopératives séparément peut être nécessaire pour que les protéines se replient. Une taille de pas beaucoup plus grande serait confrontée au problème de l'échelle de temps de Levinthal. Des pas beaucoup plus petits ne peuvent pas assembler le biais énergétique requis par le critère de Zwanzig pour un repliement rapide. Ainsi, comme précédemment pour la vue microscopique, il se peut qu'il n'y ait pas d'autre choix viable. Un repliement efficace pourrait bien nécessiter des voies de repliement des protéines basées sur le repliement. Cependant, ici une contrainte connexe entre. Étant donné que les intermédiaires de repliement essentiels reproduisent étroitement la structure native, comme ils le doivent peut-être dans une séquence de voie raisonnable, il semble que la même exigence ait réciproquement façonné la nature basée sur le repliement de la structure de la protéine native. En ce qui concerne le repliement basé sur le foldon et la structure native basée sur le foldon, il semble que chacun nécessite l'autre, et que la biologie basée sur les protéines peut nécessiter les deux.


Biologie 171

À la fin de cette section, vous serez en mesure d'effectuer les opérations suivantes :

  • Lister les composants du système endomembranaire
  • Reconnaître la relation entre le système endomembranaire et ses fonctions

Le système endomembranaire (endo = "à l'intérieur") est un groupe de membranes et d'organites ((Figure)) dans les cellules eucaryotes qui travaillent ensemble pour modifier, emballer et transporter les lipides et les protéines. Il comprend l'enveloppe nucléaire, les lysosomes et les vésicules, que nous avons déjà mentionnés, et le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi, que nous aborderons bientôt. Bien que pas techniquement dans la cellule, la membrane plasmique est incluse dans le système endomembranaire car, comme vous le verrez, elle interagit avec les autres organites endomembranaires. Le système endomembranaire ne comprend ni les mitochondries ni les membranes chloroplastiques.


Si une protéine membranaire périphérique était synthétisée dans la lumière (à l'intérieur) du RE, se retrouverait-elle à l'intérieur ou à l'extérieur de la membrane plasmique ?

Le réticulum endoplasmique

Le réticulum endoplasmique (RE) ((Figure)) est une série de sacs et de tubules membraneux interconnectés qui modifient collectivement les protéines et synthétisent les lipides. Cependant, ces deux fonctions ont lieu dans des zones distinctes du RE : le RE brut et le RE lisse, respectivement.

Nous appelons la partie creuse des tubules du RE la lumière ou l'espace cisternal. La membrane ER’s, qui est une bicouche phospholipidique enrobée de protéines, est continue avec l'enveloppe nucléaire.

Urgence rugueuse

Les scientifiques ont nommé le réticulum endoplasmique rugueux (RER) ainsi parce que les ribosomes attachés à sa surface cytoplasmique lui donnent un aspect clouté lorsqu'on le regarde au microscope électronique ((Figure)).


Les ribosomes transfèrent leurs protéines nouvellement synthétisées dans la lumière du RER où ils subissent des modifications structurelles, telles que le repliement ou l'acquisition de chaînes latérales. Ces protéines modifiées s'intègrent dans les membranes cellulaires - les membranes ER ou ER ou d'autres organites. Les protéines peuvent également sécréter à partir de la cellule (telles que les hormones protéiques, les enzymes). Le RER fabrique également des phospholipides pour les membranes cellulaires.

Si les phospholipides ou les protéines modifiées ne sont pas destinés à rester dans le RER, ils atteindront leur destination via des vésicules de transport qui bourgeonnent à partir de la membrane du RER ((Figure)).

Puisque le RER est engagé dans la modification des protéines (telles que les enzymes, par exemple) qui sécrètent à partir de la cellule, vous auriez raison de supposer que le RER est abondant dans les cellules qui sécrètent des protéines. C'est le cas par exemple des cellules hépatiques.

RE lisse

Le réticulum endoplasmique lisse (SER) est en continuité avec le RER mais a peu ou pas de ribosomes sur sa surface cytoplasmique ((Figure)). Les fonctions SER comprennent la synthèse des glucides, des lipides et des hormones stéroïdes, la détoxification des médicaments et des poisons et le stockage des ions calcium.

Dans les cellules musculaires, un SER spécialisé, le réticulum sarcoplasmique, est responsable du stockage des ions calcium nécessaires au déclenchement des contractions coordonnées des cellules musculaires.

Cardiologue Les maladies cardiaques sont la principale cause de décès aux États-Unis. Cela est principalement dû à notre mode de vie sédentaire et à nos régimes alimentaires riches en graisses trans.

L'insuffisance cardiaque n'est qu'une des nombreuses maladies cardiaques invalidantes. L'insuffisance cardiaque ne signifie pas que le cœur a cessé de fonctionner. Cela signifie plutôt que le cœur ne peut pas pomper avec une force suffisante pour transporter le sang oxygéné vers tous les organes vitaux. Si elle n'est pas traitée, l'insuffisance cardiaque peut entraîner une insuffisance rénale et d'autres défaillances d'organes.

Le tissu musculaire cardiaque comprend la paroi du cœur. L'insuffisance cardiaque survient lorsque les cellules du muscle cardiaque et le réticule endoplasmique ne fonctionnent pas correctement.En conséquence, un nombre insuffisant d'ions calcium sont disponibles pour déclencher une force contractile suffisante.

Les cardiologues (cardi- = « coeur » -ologue = « celui qui étudie ») sont des médecins spécialisés dans le traitement des maladies cardiaques, y compris l'insuffisance cardiaque. Les cardiologues peuvent diagnostiquer l'insuffisance cardiaque via un examen physique, les résultats d'un électrocardiogramme (ECG, un test qui mesure l'activité électrique du cœur), une radiographie pulmonaire pour voir si le cœur est hypertrophié et d'autres tests. Si le cardiologue diagnostique une insuffisance cardiaque, il prescrira généralement des médicaments appropriés et recommandera une consommation réduite de sel de table et un programme d'exercice supervisé.

L'appareil de Golgi

Nous avons déjà mentionné que les vésicules peuvent bourgeonner à partir du RE et transporter leur contenu ailleurs, mais où vont les vésicules ? Avant d'atteindre leur destination finale, les lipides ou protéines contenus dans les vésicules de transport ont encore besoin d'être triés, conditionnés et étiquetés pour se retrouver au bon endroit. Le tri, le marquage, l'emballage et la distribution des lipides et des protéines ont lieu dans l'appareil de Golgi (également appelé corps de Golgi), une série de membranes aplaties ((Figure)).


Nous appelons l'appareil de Golgi’ le cis visage. Le côté opposé est le trans visage. Les vésicules de transport qui se sont formées à partir du RE se rendent au cis visage, fusionner avec lui et vider leur contenu dans la lumière de l'appareil de Golgi. Au fur et à mesure que les protéines et les lipides traversent l'appareil de Golgi, ils subissent d'autres modifications qui leur permettent d'être triés. La modification la plus fréquente est l'ajout de chaînes de molécules de sucre courtes. Ces protéines et lipides nouvellement modifiés sont ensuite marqués avec des groupes phosphate ou d'autres petites molécules afin de voyager vers leurs destinations appropriées.

Enfin, les protéines modifiées et marquées sont emballées dans des vésicules de sécrétion qui bourgeonnent à partir du Golgi’s trans visage. Alors que certaines de ces vésicules déposent leur contenu dans d'autres parties de la cellule où elles seront utilisées, d'autres vésicules de sécrétion fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu à l'extérieur de la cellule.

Dans un autre exemple de forme suivant la fonction, les cellules qui s'engagent dans une grande activité sécrétoire (telles que les cellules des glandes salivaires qui sécrètent des enzymes digestives ou des cellules du système immunitaire qui sécrètent des anticorps) ont une abondance de Golgi.

Dans les cellules végétales, l'appareil de Golgi a le rôle supplémentaire de synthétiser des polysaccharides, dont certains sont incorporés dans la paroi cellulaire et d'autres utilisés par d'autres parties de la cellule.

Généticien De nombreuses maladies résultent de mutations génétiques qui empêchent la synthèse de protéines critiques. Une de ces maladies est la maladie de Lowe (ou syndrome oculo-cérébrorénal, car elle affecte les yeux, le cerveau et les reins). Dans la maladie de Lowe, il existe un déficit en une enzyme localisée dans l'appareil de Golgi. Les enfants atteints de la maladie de Lowe naissent avec des cataractes, développent généralement une maladie rénale après la première année de vie et peuvent avoir des capacités mentales altérées.

Une mutation sur le chromosome X provoque la maladie de Lowe. Le chromosome X est l'un des deux chromosomes sexuels humains, car ces chromosomes déterminent le sexe d'une personne. Les femelles possèdent deux chromosomes X tandis que les mâles possèdent un chromosome X et un chromosome Y. Chez les femmes, les gènes d'un seul des deux chromosomes X sont exprimés. Les femmes porteuses du gène de la maladie de Lowe sur l'un de leurs chromosomes X sont porteuses et ne présentent pas de symptômes de la maladie. Cependant, les mâles n'ont qu'un seul chromosome X et les gènes de ce chromosome sont toujours exprimés. Par conséquent, les hommes auront toujours la maladie de Lowe si leur chromosome X porte le gène de la maladie de Lowe. Les généticiens ont identifié l'emplacement du gène muté, ainsi que de nombreux autres emplacements de mutation qui provoquent des maladies génétiques. Grâce aux tests prénatals, une femme peut découvrir si le fœtus qu'elle porte peut être atteint d'une des nombreuses maladies génétiques.

Les généticiens analysent les résultats des tests génétiques prénataux et peuvent conseiller les femmes enceintes sur les options disponibles. Ils peuvent également mener des recherches génétiques qui mènent à de nouveaux médicaments ou aliments, ou effectuer des analyses d'ADN pour des enquêtes médico-légales.

Lysosomes

En plus de leur rôle de composant digestif et d'installation de recyclage des organites des cellules animales, les lysosomes font partie du système endomembranaire. Les lysosomes utilisent également leurs enzymes hydrolytiques pour détruire les agents pathogènes (organismes pathogènes) qui pourraient pénétrer dans la cellule. Un bon exemple de cela se produit dans les macrophages, un groupe de globules blancs qui font partie du système immunitaire de votre corps. Dans un processus que les scientifiques appellent phagocytose ou endocytose, une section de la membrane plasmique des macrophages s'invagine (se replie) et engloutit un agent pathogène. La section invaginée, avec l'agent pathogène à l'intérieur, se pince ensuite de la membrane plasmique et devient une vésicule. La vésicule fusionne avec un lysosome. Les enzymes hydrolytiques du lysosome détruisent ensuite l'agent pathogène ((Figure)).


Résumé de la section

Le système endomembranaire comprend l'enveloppe nucléaire, les lysosomes, les vésicules, le RE et l'appareil de Golgi, ainsi que la membrane plasmique. Ces composants cellulaires travaillent ensemble pour modifier, emballer, étiqueter et transporter les protéines et les lipides qui forment les membranes.

Le RER modifie les protéines et synthétise les phospholipides dans les membranes cellulaires. Le SER synthétise les glucides, les lipides et les hormones stéroïdes, participe à la détoxification des médicaments et des poisons et stocke les ions calcium. Le tri, le marquage, l'emballage et la distribution des lipides et des protéines ont lieu dans l'appareil de Golgi. Les membranes RER et Golgi naissantes créent des lysosomes. Les lysosomes digèrent les macromolécules, recyclent les organites usés et détruisent les agents pathogènes.

Connexions artistiques

(Figure) Si une protéine membranaire périphérique était synthétisée dans la lumière (à l'intérieur) du RE, se retrouverait-elle à l'intérieur ou à l'extérieur de la membrane plasmique ?

(Figure) Il finirait à l'extérieur. Une fois que la vésicule a traversé l'appareil de Golgi et fusionné avec la membrane plasmique, elle se retourne.

Réponse libre

Dans le contexte de la biologie cellulaire, qu'entendons-nous par la forme suit la fonction ? Quels sont au moins deux exemples de ce concept ?

« La forme suit la fonction » fait référence à l'idée que la fonction d'une partie du corps dicte la forme de cette partie du corps. Par exemple, comparez votre bras à l'aile d'une chauve-souris. Alors que les os des deux correspondent, les parties remplissent des fonctions différentes dans chaque organisme et leurs formes se sont adaptées pour suivre cette fonction.

À votre avis, la membrane nucléaire fait-elle partie du système endomembranaire ? Pourquoi ou pourquoi pas? Défendez votre réponse.

Étant donné que la surface externe de la membrane nucléaire est continue avec le réticulum endoplasmique rugueux, qui fait partie du système endomembranaire, il est alors correct de dire qu'il fait partie du système.

Glossaire


Discussion

Il est connu que les liens sont cruciaux dans de nombreux processus biologiques, par exemple, dans la réplication de l'ADN, et leur description correcte nécessite des outils de la théorie des nœuds. La découverte de nœuds, de nœuds coulants et de lassos dans les protéines a déjà changé notre vision de la complexité des protéines. Dans cet article, nous avons montré que cette complexité est encore plus impliquée, et en dehors des nœuds, la biologie a également conçu des liens stables au sein de chaînes monoprotéiques. Nous avons décrit la structure de ces liens, ainsi que leur évolution possible et leur signification biologique. Les liens topologiques sont formés par des boucles covalentes à base de disulfure, et nous avons identifié trois types de liens dans les protéines : les liens de Hopf positifs et négatifs et le lien de Salomon. La topologie des liaisons induit une stabilisation supplémentaire et cet effet est indépendant de la stabilisation apportée par les ponts disulfures seuls. Ceci est particulièrement important, car toutes les protéines ayant des liens opèrent à l'extérieur de la cellule. De plus, la stabilité induite par la topologie fournit un outil puissant supplémentaire pour les biotechnologistes dans la conception de nouveaux peptides extra-stables, comme suggéré précédemment pour les nœuds moléculaires (33).

Malgré une faible similitude séquentielle, toutes les protéines avec le lien Hopf positif sont des protéines de liaison aux glucides, ce qui indique qu'elles ont un ancêtre commun. Les premières protéines de liaison Hopf positives doivent avoir eu lieu dans les premières cellules eucaryotes, avant de diviser l'arbre de vie en animaux, plantes et champignons, car le même motif topologique peut être trouvé dans tous ces règnes de la vie. Ceci, d'autre part, indique que les contraintes topologiques peuvent permettre une grande variabilité séquentielle. En fait, le seul fragment conservé est situé au cœur de la région de liaison, c'est-à-dire au voisinage des cystéines fermant la première et ouvrant la deuxième boucle covalente (trouvée par Clustal O Annexe SI, fig. S10). Ceci, à son tour, explique pourquoi il n'y a aucun signe de duplication de gènes dans les protéines avec des liens Salomon, bien qu'en principe le lien Salomon puisse être obtenu par une duplication de certaines parties de la structure de lien de Hopf et malgré une propension similaire de lien Salomon protéines aux glucides.

Le repliement des protéines avec des liens est une autre énigme intéressante. Dans ce travail, nous avons franchi une étape dans l'explication des voies possibles de repliement de la plus petite protéine de liaison Hopf TdPI. Néanmoins, il est toujours surprenant que dans nos deux simulations et expériences, dans des conditions oxydantes (dans lesquelles cette protéine sécrétée devrait se replier), la TdPI se replie vers un état non natif, qui est censé être une structure topologiquement triviale. Cependant, nos résultats peuvent également étayer les théories du repliement des protéines nouées dans lesquelles l'enfilage d'une chaîne à travers une boucle torsadée est connue pour être l'étape limitante du repliement. En particulier, nous avons montré que la boucle constituée de 17 résidus est probablement trop petite pour permettre l'enfilage. D'autre part, la boucle constituée de 27 résidus est suffisamment grande pour permettre l'enfilage avec le mécanisme du nœud coulant, qui a été proposé plus tôt pour résoudre le problème d'enfilage dans le cas des protéines nouées (26). Ce résultat montre que l'analyse du repliement des protéines avec des liens ou des lassos complexes peut fournir des indices importants sur les processus de repliement des protéines enchevêtrées.

Un autre problème abordé dans cet article est la possibilité de formation de liens brunniens dans les protéines. Bien que nous n'ayons identifié aucun lien de ce type dans l'APB, nous avons trouvé un cas intéressant de lactoperoxydase de chèvre, qui remplit l'une des exigences géométriques du lien brunnien. Il semble également que la géométrie de cette protéine soit corrélée à son processus de dépliement en deux étapes. Cela montre, en général, à quel point la topologie peut être influente et que l'étude des effets topologiques dans les protéines peut fournir beaucoup d'informations sur les corrélations entre la structure, la fonction et les propriétés.

Concluons par une remarque selon laquelle, de la même manière que les différents types d'intrication utilisés, par exemple en science des matériaux, le même concept peut être utilisé en biologie pour doter les protéines de propriétés spéciales. Nos méthodes décrites dans ce travail peuvent être utilisées pour identifier et analyser les propriétés des chaînes protéiques liées et des structures encore plus complexes, par exemple, des liens macromoléculaires dans les capsides virales, dont les structures commenceront à être disponibles sur la base de la méthode EM.

Les protéines avec des liens sont collectées dans la base de données LinkProt (34).


Pourquoi le repliement des protéines ne dépend-il pas de l'ordre dans lequel elles sont synthétisées ? - La biologie

Perturber la bonne conformation d'une protéine affecte non seulement son bon fonctionnement, mais peut la rendre sensible à l'agrégation
avec d'autres protéines qui peuvent également perturber leur fonction. Les protéines mal repliées dans une cellule peuvent avoir diverses conséquences, y compris des maladies gravement invalidantes, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la maladie de Huntington et même la maladie de la vache folle.
Pour cette raison, les cellules ont développé une variété de mécanismes pour assurer le bon repliement et le maintien de leurs protéines.

Chaperons moléculaires : une classe spéciale de protéines qui favorisent le bon repliement d'autres protéines. Certains fonctionnent pour aider au bon repliement des protéines au fur et à mesure qu'elles sont produites, tandis que d'autres aident à séquestrer et replier les protéines qui se sont dépliées. Les chaperons sont souvent appelés protéines de choc thermique (hsp) en raison de leur expression accrue à des températures élevées dans la cellule.

Structure:
GroEL est composé de deux sous-unités de 57 kDa sous la forme d'anneaux à sept chaînons qui sont empilés dos à dos. Chaque sous-unité
forme une structure en forme de U qui contient trois domaines :

1. Le domaine équatorial : contient les sites de liaison des nucléotides et les contacts inter-sous-unités. C'est une forme bien ordonnée et largement hélicoïdale.
2. Le domaine apical : est impliqué dans la liaison polypeptidique et contient les sites de liaison pour GroES.
3. Le domaine intermédiaire : relie l'équateur et un
domaines picaux.

Cycle de réaction :
1. Les acides aminés hydrophobes du domaine apical dans un GroEL "ouvert" capturent des protéines substrats non natives.
2. L'ATP se lie au domaine équatorial d'un anneau chargé de protéines et induit un changement de conformation dans GroEL.
3. GroES est alors capable de se lier au domaine apical, ce qui libère le substrat non natif dans la cavité.
- Le complexe est maintenant dans sa conformation "cis".
4. L'ATP est hydrolysé au sein du complexe cis, ce qui conduit à la liaison de l'ATP à l'autre anneau trans GroEL (inoccupé).
- Le deuxième événement de liaison à l'ATP libère GroES du complexe et la protéine substrat dans la cellule.


Lodish Fig. 3-11a

La question reste de savoir si GroEL/GroES est un inhibiteur d'agrégation passif simplement en séquestrant le substrat protéique, ou si les changements de conformation du complexe induits par l'hydrolyse de l'ATP jouent un rôle plus actif dans le repliement du substrat. Cette question a été étudiée par Lin et al. dans leur article Nature 2008 : &ldquoGroEL stimule le repliement des protéines par un dépliement forcé&rdquo,
Lin et al. Nature Structural and Molecular Biology, mars 2008

Dans leur article de 2004, Lin et Rye ont établi des conditions pour étudier RuBisCo dans lesquelles :
- RuBisCo ne se replie pas lors de la dénaturation, ou ne devient pas actif (tel que testé par des tests d'activité)
- Le monomère ne s'agrège pas, et est dans un "état piégé cinétiquement"
- Concentration de 100 nM à 4 degrés Celsius dans un tampon de faible force ionique.

Labellisation de RuBisCo :


Aedans(454) : donneur F(58) : accepteur

Études de liaison :
Termes:
Puce ADP : complexe GroEL lié à GroES et ADP
ApoGroEL : Just GroEL comlex (utilisé dans les études de liaison précédentes du substrat RuBisCo)

Lin et al. déterminé que :
1. Il y avait une différence de FRET lors de la liaison du substrat à l'anneau trans de la balle ADP par rapport à l'anneau apoGroEL.
- Cela a été mis en évidence par l'extinction de la fluorescence du donneur (B.)
- Ceci indiquait une différence de conformation du substrat protéique.

2. Trouvé un dépliement "passif" de protéines substrats liées à l'anneau apoGroEL.
- Cependant, ce déroulement s'est produit beaucoup plus lentement que le cycle de réaction fonctionnel de GroEL.
3. Il y a moins de dépliage "passif" du substrat lié à l'anneau trans-balle ADP.
- Confirmé cela avec des études de digestion des protéases.
- Cependant, c'est le complexe le plus physiologiquement pertinent.
- Alors est-ce un niveau d'efficacité maximale, ou seulement la première étape du cycle de réaction ?

Pour tester la pertinence physiologique, ils ont ajouté de l'ATP à la réaction de balle ADP et ont surveillé le FRET

Lors de l'ajout d'ATP, ils ont trouvé:
- Une première expansion de conformation rapide et forcée
du substrat
- puis une phase de compactage plus lente
- Manifeste dans la figure b


- La figure c indique que la cinétique de la phase de compactage dépend de la concentration en GroES, c'est-à-dire qu'elle dépend de
le mécanisme de séquestration du complexe.
- Alors que la phase d'expansion est indépendante de la concentration en GroES.

Conclu, il y a deux phases de Déploiement :
- Déploiement passif lent en raison de la liaison du substrat à l'anneau trans de la chambre GroEL (de la première expérience de liaison)
- Dépliage rapide piloté par ATP grâce au changement de conformation de la chambre GroEL.


Le déploiement rapide ne dépend pas de GroES :
- Un excès d'un variant GroEL à un seul anneau, SR1, a été utilisé comme piège GroES.
- SR1 est incapable de se lier au substrat et de catalyser une réaction de dépliement, mais est capable de se lier et de séquestrer GroES pour déterminer la dépendance de la réaction sur la séquestration du substrat.
- Ils ont déterminé que le déploiement rapide suivi par FRET s'est produit sans la présence du capuchon GroES, et pas la phase de compactage subséquente.
- Cela indique que la phase d'expansion rapide dépend du changement de conformation de GroEL induit par la liaison à l'ATP.


""Chaperonins as protein-folding machines", Bhutani et al. Current Science Vol. 83 No. 11 Dec. 2002


Protéases hyperthermophiles de type subtilisine de Thermococcus kodakarensis

Ryo Uehara , . Yuichi Koga , dans Biotechnologie des enzymes microbiennes , 2017

4.3.9 Expériences de protéolyse par impulsions Tk-subtilisine

La détermination de la stabilité des protéines et de la cinétique de repliement sont des procédures essentielles pour étudier la structure et l'énergétique des protéines. La spectroscopie optique, telle que CD et fluorescence, a été classiquement utilisée pour caractériser les propriétés chimiques et thermiques de dépliement/repliement des protéines, pour évaluer les valeurs de stabilité ΔG et pour déterminer kF et kvous valeurs pour les réactions de repliement. La méthode de protéolyse pulsée a récemment été développée pour prendre des mesures thermodynamiques de la stabilité/du repliement des protéines et pour la détermination des voies de repliement/dépliement sans instrumentation biophysique ( Okada et al., 2012 Park et Marqusee 2005 ). La protéolyse pulsée est conçue pour digérer uniquement les régions dépliées d'un mélange de protéines repliées et dépliées à l'aide d'une protéase dans un temps d'incubation très court. Après protéolyse, la fraction de protéine repliée par rapport au produit digéré est déterminée par SDS-PAGE. La méthode est simple et peut être appliquée à des systèmes à haut débit ou pour mesurer la stabilité/le repliement d'une protéine non purifiée. Cependant, des protéases chimiquement et thermiquement stables sont nécessaires, car les réactions de protéolyse sont souvent effectuées dans des conditions qui déplieraient la plupart des protéines.

La Tk-subtilisine conserve une stabilité et une activité élevées à des températures élevées ainsi qu'en présence de dénaturants chimiques. Nous avons examiné la voie de développement de la ribonucléase H2 à partir de T. kodakarensis (Tk-RNase H2) en utilisant la protéolyse pulsée avec la Tk-subtilisine ( Okada et al., 2012 ). La Tk-subtilisine conserve son activité dans le GdnHCl hautement concentré. La Tk-RNase H2 se déploie dans cette situation. Les produits de dégradation de la protéolyse pulsée de la Tk-subtilisine de la Tk-RNase H2 au cours de son dépliement ont été détectés avec la tricine-SDS-PAGE (Fig. 4.10). La bande intacte de Tk-RNase H2 et plusieurs produits de clivage ont été observés. La bande intacte a été réduite de plus de la moitié, et la présence de bandes représentant des fragments de 20 et 22 kDa s'est développée à des moments précoces. Cependant, la quantité de protéine intacte et des fragments de 20 et 22 kDa était inférieure à ce temps d'incubation précoce de 0,5 min, qu'elle ne l'était à des temps d'incubation intermédiaires de 2 à 16 min. Ces bandes ont progressivement disparu, puis un fragment de chaîne légère de 9 kDa est apparu (fragment 9) au cours du temps.A 120 min, seules les bandes faibles de la protéine intacte et du fragment 9 ont été observées. La protéolyse pulsée utilisant la Tk-subtilisine nous a permis de détecter les intermédiaires de dépliement d'une protéine hyperthermophile. C'est exceptionnel. Les intermédiaires ont été examinés plus avant et identifiés par séquençage N-terminal, spectrométrie de masse et ingénierie des protéines. Nous avons constaté que l'état natif de la Tk-RNase H2 (état N) se transforme en un IUNE-état, qui est digéré par la Tk-subtilisine au début du développement. le jeUNE-l'état passe à deux formes intermédiaires, le IB-état et moiC-état, et le jeB-state est digéré par la Tk-subtilisine dans la région C-terminale, mais le IC-state est une forme résistante à la Tk-subtilisine. Ces états se déroulent progressivement à travers le I-Etat. Ces résultats montrent que la protéolyse pulsée par la protéase super-stable, la Tk-subtilisine, est une stratégie appropriée et un outil efficace pour analyser la structure intermédiaire des protéines.

Graphique 4.10 . Protéolyse d'impulsions Tk-subtilisine dans le déroulement cinétique de la Tk-RNase H2. La piste b représente la Tk-RNase H2 (112 ug). La Tk-RNase H2 a été dépliée en ajoutant 4 M de GdnHCl. À chaque instant (0,5 à 120 min et toute la nuit), l'échantillon a été distribué dans des tubes et la protéolyse a été réalisée en ajoutant de la Tk-subtilisine (10 g) et en incubant pendant 45 s. La protéolyse a été désactivée en ajoutant 10 % de TCA et les produits ont été quantifiés à l'aide de tricine-SDS-PAGE. Les bandes correspondant à la Tk-subtilisine, la Tk-RNase H2 et les produits de clivage sont indiqués.


Voir la vidéo: Kiloa Proteiinivanukkaita (Novembre 2022).