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Comment l'ADN fonctionne-t-il encore après recombinaison ?

Comment l'ADN fonctionne-t-il encore après recombinaison ?


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Si vous prenez deux programmes informatiques et échangez des pièces au hasard de chacun d'eux. Le résultat ne fonctionnera pas. Ce ne sera que des ordures. Si vous prenez deux romans et que vous échangez des chapitres au hasard, le résultat sera également un déchet.

Comment se fait-il que l'ADN (ce qui est infiniment plus compliqué) puisse être combiné, certains du père et d'autres de la mère et pourtant cela fonctionne toujours d'une manière ou d'une autre ?

Pouvez-vous donner un exemple simple ?


La recombinaison d'ADN homologue n'échange pas de pièces au hasard dans le sens où deux morceaux d'ADN peuvent échanger des places. La recombinaison de l'ADN est aléatoire dans le sens où elle peut ou non se produire. En fait, la recombinaison homologue de l'ADN est hautement spécifique et sa spécificité en fait un excellent outil pour étudier la génétique dans des organismes comme la levure en échangeant un gène d'intérêt avec quelque chose d'autre.

Dans votre exemple de recombinaison méiotique entre les chromatides sœurs, vous pouvez échanger de l'ADN entre différents allèles. Les allèles sont des gènes qui codent pour une protéine ayant la même fonction générale, mais ont une certaine variabilité dans la séquence qui leur confère des propriétés légèrement différentes. La raison pour laquelle il ne se produit qu'entre allèles est que la recombinaison homologue nécessite des régions de homologie, dans une expérience de laboratoire, cela peut se produire avec une longueur de 20 à 40 paires de bases et la faible probabilité qu'une séquence de 20 paires de bases se trouve ailleurs dans le génome est la raison pour laquelle vous n'obtenez pas un mélange chaotique de gènes que vous avez suggéré arriverait.


Il faut toujours faire attention à ne pas pousser une analogie plus loin qu'elle ne peut le supporter, mais puisque vous avez commencé ces analogies, je vais les suivre et vous expliquer la petite erreur que vous avez commise dans leurs représentations.

Les deux livres ne sont pas aussi différents que vous le pensez. Vous ne collez pas le début de la Case de l'oncle Tom avec la fin de Harry Potter mais seulement le début de Harry Potter avec la fin d'un autre Harry Potter dans lequel Serdaigle est renommé Eagleclaw.

De plus, contrairement aux livres, il n'y a pas de cadre de lecture du début à la fin pour l'ensemble du chromosome. Il n'y a que des gènes placés au hasard le long des chromosomes. La réalité est que le placement n'est en fait pas si aléatoire, mais le supposer peut vous donner une idée de pourquoi il peut souvent être bon de recombiner deux chromosomes et de se retrouver avec des chromosomes toujours fonctionnels.

Pour l'analogie avec le programme informatique, ce serait comme échanger des fichiers entre les branches d'un même projet (merci @IronSean pour son commentaire).


Pouvez-vous donner un Facile Exemple?

Oui. Une mère est une base de code complète du système d'exploitation Android, qui démarre avec un fond bleu foncé et où la langue initiale est définie sur l'anglais (États-Unis).

Un père est une base de code complète d'Android OS, qui démarre avec un arrière-plan vert foncé et où la langue initiale est définie sur l'anglais (Royaume-Uni).

En dehors de cela, leurs bases de code sont exactement identiques ligne à ligne. Recombinaison : chaque ligne de code a une chance d'être échangée contre la ligne de code à la même position.

Un enfant peut avoir un fond vert foncé et anglais (US) et cela fonctionnera presque parfaitement.

Vous surestimez grossièrement à quel point les humains sont différents les uns des autres. (Vous êtes partial parce que tu sont un humain.) Toute espèce est un groupe d'individus presque identiques. Si les bases de code ne sont pas très identiques, oui, le résultat sera du foutoir, à la fois en programmation et en biologie. Exactement la même chose que d'essayer de recombiner l'ADN de lapin avec l'ADN de fourmi.

Le lapin et la fourmi sont considérés comme des espèces différentes non pas parce qu'ils ont une apparence différente ; mais car les bases de code après recombinaison ne fonctionnent pas du tout.

(Une autre chose - les bases de code au fil des générations ont évolué des "modèles de programmation" qui les ont rendus beaucoup plus tolérants aux problèmes qui se produisent généralement pendant la recombinaison. Un type de programmation très très défensif, qui est vraiment laid et presque impossible pour un humain à lire ou à comprendre.)


La langue anglaise compte 26 lettres qui peuvent être réarrangées en combinaisons de longueurs ouvertes, donnant une variabilité colossale. Selon l'Oxford English Dictionary, il y a environ 170 000 mots actuellement utilisés.

Les langages de programmation sont basés de manière très lâche sur les structures du langage humain. Bien que le pool de "mots" soit beaucoup plus petit, ils sont également ouverts dans le sens où le programmeur est libre de créer des mots ou des noms de fonctions.

Les deux sont également séquentiels - si vous faites autre chose que de les suivre dans l'ordre dans lequel ils ont été conçus pour fonctionner, vous obtiendrez du charabia.

Bien que l'ADN puisse être compris comme un langage, il est beaucoup plus simple que vos autres exemples. Il a quatre lettres et tous ses mots sont longs de 3 lettres. Cela vous donne un maximum de 64 mots. En fait, la nature n'utilise que 21 de ces mots, et il y a beaucoup de redondance intégrée.

Un "livre" au sens de l'ADN est un seul gène. La longueur d'un gène varie énormément mais la moyenne est d'environ 480 "mots". Bien que l'ADN d'un livre doive être lu de manière séquentielle, ce n'est pas le cas de tous les « livres » d'un chromosome ou d'un génome. Tant que chaque "livre" est lu dans l'ordre, les "livres" eux-mêmes peuvent être lus individuellement et ont toujours un sens.

Donc: tout ce que la recombinaison doit faire est de s'assurer que la combinaison se produit dans une pause entre deux "livres", et tout fonctionnera bien. Comme @ user40949 mentionné ci-dessus, il existe des processus pour garantir que la recombinaison se produit effectivement dans des régions spécifiques entre les "livres". Et même si ce n'était pas le cas, un échec n'invaliderait qu'un seul "livre".


La structure génomique, la structure des gènes et la structure de la culture humaine sont assez plastiques, et lorsque certaines parties sont perturbées, il y a généralement une capacité excédentaire quelque part qui maintient le système en fonctionnement.

  1. Les histoires, les livres, les contes, les chansons, etc. sont à la fois modifiables et recombinables. Du jeu de société du "téléphone" à la création de nouvelles œuvres d'art, des sections d'une œuvre sont remplacées intentionnellement ou par accident soit par des contributions originales, soit par des pièces d'autres œuvres. Ces nouvelles œuvres sont ensuite sélectionnées pour leur adéquation à l'usage auquel elles sont destinées par le créateur ou par d'autres mécanismes sociaux. Les seuls que vous observez ne sont pas des échecs complets selon ces critères. C'est une assez bonne analogie pour le type de recombinaison dont vous parlez.

  2. Si un événement de recombinaison génétique finit par produire un gène qui ne remplit plus sa fonction d'origine, c'est généralement OK et l'organisme aura un autre moyen de survivre. Il peut même être plus en forme (toujours dans un contexte particulier) sans le gène de travail. Le gène non fonctionnel peut acquérir une nouvelle fonction (par recombinaison ou mutation ultérieure) au fil des générations. [un de mes articles où nous montrons que de nombreux gènes réduisent la forme physique https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23990803 dans des environnements particuliers]

  3. Vous pouvez absolument "réarranger un gène", quelques gènes quand même, et que cela ait du sens. Un exemple : de nombreux gènes peuvent être « circulairement permutés », le début (N-terminal) de la protéine peut être déplacé vers différentes positions. [un de mes papiers où nous faisons ça : https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12149462]


Recombinaison spécifique au site

Recombinaison spécifique au site, aussi connu sous le nom recombinaison spécifique au site conservatrice, est un type de recombinaison génétique dans laquelle un échange de brins d'ADN a lieu entre des segments possédant au moins un certain degré d'homologie de séquence. [1] [2] [3] Les enzymes connues sous le nom de recombinases spécifiques au site (SSR) effectuent des réarrangements de segments d'ADN en reconnaissant et en se liant à de courtes séquences d'ADN spécifiques (sites), au niveau desquelles elles clivent le squelette de l'ADN, échangent les deux ADN hélices impliquées et rejoignent les brins d'ADN. Dans certains cas, la présence d'une enzyme recombinase et des sites de recombinaison est suffisante pour que la réaction se déroule dans d'autres systèmes, un certain nombre de protéines accessoires et/ou de sites accessoires sont nécessaires. De nombreuses stratégies de modification du génome, parmi lesquelles l'échange de cassettes induit par recombinase (RMCE), une approche avancée pour l'introduction ciblée d'unités de transcription dans des loci génomiques prédéterminés, reposent sur les SSR.

Les systèmes de recombinaison spécifiques au site sont hautement spécifiques, rapides et efficaces, même face à des génomes eucaryotes complexes. [4] Ils sont employés naturellement dans une variété de processus cellulaires, y compris la réplication du génome bactérien, la différenciation et la pathogenèse, et le mouvement des éléments génétiques mobiles. [5] Pour les mêmes raisons, ils présentent une base potentielle pour le développement d'outils de génie génétique. [6]

Les sites de recombinaison ont généralement une longueur comprise entre 30 et 200 nucléotides et consistent en deux motifs avec une symétrie de répétition inversée partielle, auxquels la recombinase se lie, et qui flanquent une séquence de croisement centrale au niveau de laquelle la recombinaison a lieu. Les paires de sites entre lesquels se produit la recombinaison sont généralement identiques, mais il existe des exceptions (par exemple attP et attB de la intégrase). [7]


Contenu

Des études menées en 1981 par Sternberg et Hamilton ont démontré que le bactériophage « P1 » avait un système de recombinaison spécifique à un site unique. Des fragments EcoRI du génome du bactériophage P1 ont été générés et clonés dans des vecteurs lambda. Un fragment EcoRI de 6,5 kb (fragment 7) s'est avéré permettre des événements de recombinaison efficaces. [5] Le mécanisme de ces événements de recombinaison était connu pour être unique car ils se produisaient en l'absence de protéines bactériennes RecA et RecBCD. Les composants de ce système de recombinaison ont été élucidés à l'aide d'études de mutagenèse par délétion. Ces études ont montré qu'un produit du gène P1 et un site de recombinaison étaient tous deux nécessaires pour que des événements de recombinaison efficaces se produisent. Le produit du gène P1 a été nommé Cré (caus combinaison) et le site de recombinaison a été nommé loxP (voilacus de croisement (X) plus de, P1). [5] La protéine Cre a été purifiée en 1983 et s'est avérée être une protéine de 35 000 Da. [2] Aucun cofacteurs à haute énergie tels que l'ATP ou les protéines accessoires n'est requis pour l'activité recombinase de la protéine purifiée. [2] Les premières études ont également démontré que Cre se lie à des séquences d'ADN non spécifiques tout en ayant une affinité 20 fois plus élevée pour les séquences loxP et les résultats des premières études d'empreinte ADN ont également suggéré que les molécules de Cre se lient aux sites loxP en tant que dimères. [2]

Membres de la famille de la tyrosine recombinase [3]
S. cerevisiae Flp recombinase
Recombinase bactérienne XerC
Recombinase bactérienne XerD
protéine intégrase
Protéine intégrase HP1

La recombinase Cre se compose de 343 acides aminés qui forment deux domaines distincts. Le domaine amino terminal englobe les résidus 20 à 129 et ce domaine contient 5 segments hélicoïdaux alpha liés par une série de boucles courtes. Les hélices A et E sont impliquées dans la formation du tétramère de recombinase avec la région terminale C de l'hélice E connue pour former des contacts avec le domaine terminal C des sous-unités adjacentes. Les hélices B et D forment des contacts directs avec le sillon principal de l'ADN loxP. On pense que ces deux hélices établissent trois contacts directs avec des bases d'ADN au site loxP. Le domaine carboxy-terminal de l'enzyme se compose des acides aminés 132 à 341 et il abrite le site actif de l'enzyme. La structure globale de ce domaine partage une grande ressemblance structurelle avec le domaine catalytique d'autres enzymes de la même famille telles que la λ intégrase et la HP1 intégrase. Ce domaine est principalement de structure hélicoïdale avec 9 hélices distinctes (F−N). L'hélice terminale (N) dépasse du corps principal du domaine carboxy et cette hélice est réputée jouer un rôle dans la médiation des interactions avec d'autres sous-unités. Les structures cristallines démontrent que cette hélice N terminale enfouit sa surface hydrophobe dans une poche acceptrice d'une sous-unité Cre adjacente. [6]

L'effet de la structure à deux domaines est de former une pince en forme de C qui saisit l'ADN des côtés opposés. [3]

Site actif Modifier

Le site actif de l'enzyme Cre se compose des résidus de triade catalytique conservés Arg 173, His 289, Arg 292 ainsi que des résidus nucléophiles conservés Tyr 324 et Trp 315. Contrairement à certaines enzymes recombinases telles que la recombinase Flp, Cre ne forme pas un site actif entre des sous-unités séparées et tous les résidus qui contribuent au site actif se trouvent sur une seule sous-unité. Par conséquent, lorsque deux molécules Cre se lient à un seul site loxP, deux sites actifs sont présents. La recombinaison médiée par Cre nécessite la formation d'une synapse dans laquelle deux complexes Cre-LoxP s'associent pour former ce que l'on appelle le tétramère synaptique dans lequel 4 sites actifs distincts sont présents. [6] Tyr 324 agit comme un nucléophile pour former une liaison covalente 3'-phosphotyrosine avec le substrat d'ADN. Le phosphate scissile (phosphate ciblé pour l'attaque nucléophile au site de clivage) est coordonné par les chaînes latérales des 3 résidus d'acides aminés de la triade catalytique (Arg 173, His 289 & Trp 315). L'azote indole du tryptophane 315 forme également une liaison hydrogène avec ce phosphate scissile. (n.b A L'histidine occupe ce site chez d'autres membres de la famille des tyrosines recombinases et remplit la même fonction). Cette réaction clive l'ADN et libère un groupe hydroxyle 5'. Ce processus se produit dans le site actif de deux des quatre sous-unités de recombinase présentes au niveau du tétramère synaptique. Si les groupes hydroxyle 5' attaquent la liaison 3'-phosphotyrosine, une paire de brins d'ADN s'échangera pour former un intermédiaire de jonction Holliday. [3]

Rôle dans le bactériophage P1 Modifier

La recombinase Cre joue un rôle important dans le cycle de vie du bactériophage P1. Lors de l'infection d'une cellule, le système Cre-loxP est utilisé pour provoquer la circularisation de l'ADN P1. En plus de cela, Cre est également utilisé pour résoudre l'ADN P1 lysogène dimère qui se forme pendant la division cellulaire du phage. [7]

Utilisation dans la recherche Modifier

La simplicité et la robustesse des systèmes Cre-loxP ont permis aux scientifiques d'exploiter l'enzyme Cre afin de manipuler l'ADN à la fois in vivo et in vitro. Voir la recombinaison Cre-Lox pour plus de détails. L'enzyme Cre peut être exprimée dans de nombreux organismes différents tels que les plantes, les bactéries, les mammifères, les levures. En 1992, Cre a été exprimé et s'est avéré fonctionnel chez une souris hôte. [8] [9] Les régions promotrices peuvent être manipulées pour permettre un contrôle temporel précis de l'expression de l'enzyme Cre (par exemple, le régulateur chimérique sensible au RU486 GLVP). [10] Comme l'enzyme a un substrat d'ADN spécifique de 34 pb, le génome de l'organisme devrait avoir une longueur de 10 à 18 pb pour qu'il y ait une occurrence probable d'un site loxP. Comme les génomes des mammifères sont en moyenne de l'ordre de 3 × 10 9 pb, il y a une très faible chance de trouver un site loxP endogène. [1] Pour que Cre soit fonctionnel chez un hôte étranger, des sites loxP exogènes doivent être conçus. Cela permet un contrôle précis de l'activité de l'enzyme Cre dans les organismes d'essai.

Indépendamment, Joe Z. Tsien a été le pionnier de l'utilisation du système Cre-loxP pour la recherche en neurosciences afin de réaliser une manipulation génétique spécifique à un type de cellule et à une région dans le cerveau adulte où des centaines de types de neurones distincts peuvent exister et où presque tous les neurones du cerveau adulte sont à l'état post-mitotique. Tsien et ses collègues ont démontré que la recombinaison médiée par Cre peut se produire dans les neurones pyramidaux post-mitotiques du cerveau antérieur de la souris adulte. [11] La démonstration claire de son utilité dans la définition précise de la relation complexe entre des cellules/circuits spécifiques et des comportements pour la recherche sur le cerveau, [12] a encouragé le NIH à lancer le NIH Blueprint for Neuroscience Research Cre-driver mouse projects au début de 2000. [13] [14] À ce jour, les projets Cre du NIH Blueprint for Neuroscience Research ont créé plusieurs centaines de lignées de souris pilotes Cre qui sont actuellement utilisées par la communauté mondiale des neurosciences.

Ces dernières années, la recombinase Cre a été améliorée avec la conversion en codons mammifères préférés, la suppression des sites d'épissage cryptiques signalés, un codon stop altéré et une teneur réduite en CpG pour réduire le risque de silence épigénétique chez les mammifères. [15] Un certain nombre de mutants avec une précision améliorée ont également été identifiés. [16]


Processus d'ADN recombinant

Les scientifiques utilisent régulièrement l'ADN recombinant pour ajouter des traits à certaines espèces de bactéries ou produire des organismes qui ont des traits supplémentaires. Il existe un processus de base pour obtenir de l'ADN recombinant dans les cellules, bien que la méthode exacte varie en fonction de l'organisme spécifique.

En général, la première partie du processus comprend la création d'un plasmide qui contient la séquence d'ADN qui sera ajoutée à un organisme. L'organisme le plus simple auquel ajouter de l'ADN recombinant est une bactérie. Les cellules bactériennes se reproduisent rapidement, ce qui laisse de nombreuses chances à l'ADN recombinant d'entrer dans une cellule et de proliférer.

Après avoir créé un plasmide contenant l'ADN recombinant, il doit être ajouté aux cellules. Pour ce faire, les cellules sont généralement chauffées au point que leurs membranes cellulaires deviennent plus perméables. Certaines cellules mourront, mais le plasmide réussira à pénétrer dans certaines des cellules bactériennes présentes.

Le processus final de création d'organismes avec de l'ADN recombinant consiste à permettre aux cellules de se refroidir et de se développer. Souvent, le plasmide introduit possède également un gène qui permet à la bactérie de survivre aux traitements antibiotiques. Lors de la croissance des bactéries transformées, un antibiotique est introduit. Toutes les bactéries qui survivent sont celles qui ont été transformées avec de l'ADN recombinant. Ils ont maintenant le plasmide, qui comprend à la fois l'ADN recombinant et un gène de résistance aux antibiotiques.


Partie 2 : Détails de la réparation de l'ADN dans la levure bourgeonnante

a00:00:06.01 Bonjour. Je suis Jim Haber. Je suis professeur à l'Université Brandeis et directeur du Rosenstiel basic
00:00:11.13 centre des sciences médicales. Dans une vidéo précédente j'ai parlé plus généralement des mécanismes
00:00:18.13 de la réparation des cassures double brin et comment les cellules doivent le faire essentiellement à chaque division cellulaire afin d'empêcher que leur chromosome ne se réarrange.
00:00:29.00 Dans l'exposé que je veux donner maintenant, je veux étendre cela pour examiner beaucoup plus en détail moléculaire ce qui se passe dans la réparation d'un
00:00:40.04 rupture double brin. Encore une fois ce travail est fait avec l'organisme modèle saccharomyces cerevisiae, levure bourgeonnante,
00:00:48.19 et encore je dirai que les mécanismes de réparation que nous étudions sont très
00:00:55.01 fortement évolutivement conservé et ont donc quelque chose à voir avec ce
00:00:59.20 nous connaissons les chromosomes humains et comment ils sont réparés. Dans la dernière vidéo,
00:01:07.10 J'ai introduit deux mécanismes différents qui peuvent être utilisés pour réparer les cassures double brin.
00:01:14.15 L'un de ces mécanismes, appelé réplication induite par la rupture, est une manière dont une extrémité du double brin se brise
00:01:22.17 envahit la séquence homologue, met en place un soi-disant déplacement ou boucle D, puis remplit cette boucle D avec à la fois le premier et le retard
00: 01: 32,26 brins d'ADN polymérases, permettant à la fourche de réplication unidirectionnelle de descendre l'ADN et cela s'avère être un élément important
00: 01: 43.04 mécanisme pour redémarrer les fourches de réplication de l'ADN brisées et aussi apparemment dans le maintien des télomères des cellules de levure et des cellules cancéreuses humaines
00:01:55.16 dans les situations où l'enzyme télomérase n'a pas été réactivée. Le deuxième mécanisme est un mécanisme de conversion génique
00:02:06.06 et en particulier j'ai parlé d'un mécanisme appelé mécanisme de conversion génique à double jonction Holliday et ici les extrémités du
00: 02: 16.19 les cassures double brin sont toutes deux traitées de la même manière que cela se produirait dans la réplication induite par les cassures par des exonucléases qui rongent l'ADN,
00:02:26.15 mais maintenant les deux extrémités de la cassure double brin peuvent envahir le locus donneur, les deux extrémités 3' des régions simple brin
00:02:37.13 peut initier une nouvelle synthèse d'ADN de sorte que vous obtenez une ligne bleue ici qui est la nouvelle synthèse d'ADN ici et encore ici et la nouvelle synthèse d'ADN
00:02:49.09 permet effectivement la formation d'une structure intermédiaire contenant non pas une mais deux jonctions Holliday. Ces structures symétriques peuvent être sollicitées
00:03:02.12 par des résolvases ou déroulé par une autre paire d'enzymes appelée hélicase et topoisomérase pour produire soit un non-croisement
00:03:12.07 résultats ou résultats croisés associés à la réparation de cette rupture double brin. Maintenant, je vais compliquer les choses en vous disant que bien que
00:03:24.10 c'est un mécanisme important de conversion génique et c'est apparemment le principal mécanisme de conversion génique dans le
00:03:33.16 réparation des cassures double brin générées dans les cellules en méiose
00:03:37.11 ce n'est pas non plus le seul mécanisme de conversion génique dans les cellules somatiques ou dans les cellules méiotiques.
00: 03: 44.13 Il existe un deuxième mécanisme connexe de réparation des cassures double brin appelé recuit de brin dépendant de la synthèse
00:03:52.08 et ce mécanisme partage de nombreuses caractéristiques de ces deux mécanismes précédents que j'ai générés, mais a ses propres caractéristiques spéciales.
00:04:00.08 Encore une fois, l'ADN est d'abord mâché par des exonucléases pour générer des régions simple brin qui attireront la protéine recombinase Rad51
00:04:14.02 et permettre la formation d'une boucle de déplacement exactement de la même manière que nous avons examiné auparavant, bien qu'ici, pour des raisons qui ne le sont pas
00:04:24.01 tout à fait évident pour nous, il est plus probable que l'une ou l'autre extrémité envahisse plutôt que les deux extrémités envahissent simultanément et maintenant cette extrémité
00:04:35.08 qui est envahi met en place une nouvelle réplication de l'ADN qui commencera à se copier
00:04:41.24 les séquences qui sont dans la région qui doit être réparée, mais la synthèse d'ADN
00:04:48.05 qui est effectué dans ce processus est différent de ce qui se passe dans le cadre de la réplication normale de l'ADN. Dans la réplication normale de l'ADN,
00:04:56.21 nous nous attendons à voir une réplication semi-conservative c'est-à-dire que le nouvel ADN est associé à sa matrice et reste associé à sa matrice
00: 05: 08.29 mais dans l'annelage de brin dépendant de la synthèse, il apparaît que l'ADN nouvellement synthétisé est déroulé de la matrice de la manière dont nous pensons normalement à l'ARN
00:05:19.25 est déroulé de l'ADN pendant la transcription et cet ADN déroulé finira par s'hybrider avec l'autre extrémité de ce processus
00:05:27.09 pour produire maintenant deux brins nouvellement synthétisés et la réparation de cette cassure double brin et ce qui distingue ce mécanisme
00:05:38.07 par rapport à la réplication induite par la rupture est que pratiquement tous les résultats seront sans croisement. Ainsi, ce mécanisme de synthèse
00:05:50.17 le recuit de brin dépendant est un mécanisme plus conservateur dans les cellules somatiques car il empêche les croisements qui peuvent conduire à
00:06:00.24 perte d'hétérozygotie et préserve l'information génétique d'origine des deux côtés de la cassure double brin. Maintenant, la façon dont nous avons appris à connaître
00:06:14.01 une grande partie des détails de ce processus est en étudiant dans la levure bourgeonnante un exemple particulier d'une cassure double brin programmée
00:06:23.29 qui conduit à un résultat particulier que nous pouvons étudier en détail. Ceci est connu sous le nom de changement de type d'accouplement chez la levure en herbe et j'ai besoin
00:06:34.29 pour vous présenter les fonctionnalités de ce système. Il y a un locus sur l'un des seize chromosomes de saccharomyces connu sous le nom de
00:06:46.15 locus de type d'accouplement et il s'avère que le type d'accouplement peut exister chez les deux sexes. Il peut être appelé type d'accouplement a ou type d'accouplement alpha
00:06:55.22 et ce qui distingue ces deux allèles de ce gène, c'est qu'ils sont codés par des séquences d'ADN complètement différentes.
00:07:04.18 Ici illustrées en rouge sont les séquences qui contrôlent le type d'accouplement a et le a1
00:07:10.19 produit génique de cette région est impliqué dans la régulation des cellules d'un type d'accouplement.
00:07:16.15 En revanche, les cellules matalpha ont une paire de cadres de lecture ouverts qui sont dans des séquences bleues, complètement différentes des rouges,
00:07:24.24 et encodent deux cadres de lecture ouverts qui, ensemble, permettent aux cellules d'avoir l'identité d'être des cellules alpha. C'est donc vraiment remarquable
00:07:34.08 car il s'avère que dans la nature, les cellules sont capables de passer de a à alpha ou d'alpha à a aussi souvent que chaque division cellulaire
00:07:45.14 et ce n'est pas comme n'importe quel processus de mutation auquel nous pensons normalement où vous changez une paire de bases d'un A à un T ou inversement.
00:07:53.22 Ici, nous remplaçons des morceaux entiers d'ADN par de l'ADN qui doit provenir d'ailleurs dans la cellule et c'est effectivement le cas parce que
00:08:03.24 sur le même chromosome que le locus de type sexuel, il y a en fait deux séquences donneuses, l'une appelée HML qui porte normalement le bleu
00:08:14.21 ou des séquences alpha, et un deuxième locus donneur qui est appelé HMR et HMR porte normalement la séquence rouge ou a. Dans certaines expériences
00:08:27.06 Je vais parler du fait que nous changeons l'identité de ces séquences du rouge au bleu et que les mécanismes dont je parle n'ont vraiment pas
00:08:34.22 beaucoup à voir avec si nous utilisons des séquences rouges ou des séquences bleues. Pour que ce système fonctionne, il doit y avoir un moyen de stimuler
00:08:44.09 le remplacement de ces séquences rouges par des séquences bleues ou vice versa. Cela est effectué par une enzyme spécifique au site appelée endonucléase HO.
00: 08: 55.13 Le HO représente un processus appelé homothallisme qui est le processus sous-jacent par lequel ces cellules passent et qui est un processus
00: 09: 03.09 par lequel une cellule peut commencer avec un type d'accouplement et produire des cellules du type d'accouplement opposé et c'est quelque chose qui en fait
00:09:10.05 se produit dans un certain nombre de champignons différents, bien que le mécanisme précis par lequel cela se produit ne soit pas le même dans tous ces organismes.
00:09:18.26 Dans l'organisme que nous étudions, saccharomyces cerevisiae, il y a une enzyme HO qui va se scinder dans le locus MAT - en fait juste à la jonction
00:09:29.27 entre la séquence rouge et les séquences identiques en a et alpha et cette cassure chromosomique faite par cette enzyme
00:09:39.05 conduit au remplacement des séquences rouges par les séquences bleues et ces séquences bleues
00:09:44.24 doivent être copiés d'ailleurs, donc comme je dis qu'il y a un donateur.
00:09:49.15 Le donateur est intéressant en soi. Le donneur n'est pas exprimé même si le donneur a exactement les mêmes séquences qui sont
00:10:03.28 exprimé au locus MAT, à la position du donneur, entouré d'une séquence dite 'E' et d'une autre séquence dite 'I' pour le
00:10:13.20 noms imaginatifs 'Essentiel' et 'Important' ces séquences interagissent
00:10:19.23 avec une histone désacétylase connue sous le nom de Sir2 qui est capable d'éliminer l'acétylé
00:10:30.16 résidus sur les queues N-terminales des histones H3 et H4 et conduisent au positionnement des nucléosomes dans cette région
00:10:40.06 d'une manière qui fait taire l'expression soit de HML soit de HMR de sorte que ces régions,
00:10:49.01 bien qu'ils aient des gènes intacts, ne sont pas exprimés. Ils sont hétérochromatiques.
00:10:56.04 En plus de cela, il y a un nucléosome particulier qui se trouve ici et qui empêche l'endonucléase HO
00:11:06.10 de scinder ce site. C'est exactement le même site que l'endounclease HO peut cliver ici et HMR
00:11:13.13 a un site qui est exactement le même que celui qui sera clivé
00:11:16.13 au locus MAT mais ils ne sont pas clivés car il y a des nucléosomes assis sur ces sites qui les empêchent d'être les deux
00:11:25.26 transcrit et clivé par la nucléase. Cela signifie que ces deux régions hétérochromatiques sont des matrices pour réparer la cassure double brin
00:11:33.25 mais eux-mêmes ne sont pas exprimés sous forme de gènes. L'un des mystères de ce processus et quelque chose que nous n'avons vraiment pas
00: 11: 40.25 comprendre en détail est si l'endonucléase HO ne peut pas couper ce site,
00:11:47.09 comment les extrémités de la cassure double brin peuvent-elles envahir la même région, forcer l'ouverture de l'ADN,
00:11:52.29 et commencer à copier l'ADN dans cette région ? Car c'est ce qui doit arriver pour réparer les séquences rouges avec les séquences bleues,
00:12:00.20 et j'en dirai un peu plus à ce sujet au fur et à mesure. La manière dont nous avons pu étudier ce processus dans un formidable
00:12:09.16 le détail provient d'une avancée réalisée par le laboratoire d'Ira Herskowitz qui a placé le gène HO sous le contrôle d'un promoteur inductible.
00:12:19.03 Donc, en ajoutant simplement le sucre galactose au milieu, nous pouvons activer l'expression
00:12:25.09 de l'endonucléase HO, il s'avère que le contrôle est extrêmement
00:12:29.10 serré pour qu'il n'y ait pratiquement pas d'endonucléase HO produite en l'absence de galactose, mais dès que nous activons le galactose
00:12:36.24 maintenant l'endonucléase HO peut être exprimée, et elle est suffisamment exprimée pour que pratiquement chaque cellule
00:12:43.00 dans la population subit la même cassure double brin
00:12:45.27 en même temps et cela nous a permis ensuite de suivre au niveau de l'ADN ce qui arrivait à l'ADN pendant le synchrone
00:12:54.12 remplacement de, dans ce cas, une séquence par des séquences alpha. Il y a une vingtaine d'années, mon laboratoire a d'abord pu suivre ce qui se passait
00:13:06.22 pendant ce processus de réparation de cassure double brin. Montré ici est une tache du sud. L'idée est que nous regardons un fragment d'ADN
00:13:15.24 qui vient du locus MAT et sonde avec une sonde juste à la fin des séquences MAT. On commence avec des séquences qui sont en MATa
00:13:24.18 puis nous allumons l'endonucléase HO et en vingt minutes, pratiquement toutes les séquences MATa sont coupées en un peu plus petit
00:13:33.11 fragment de restriction par l'action de l'endonucléase HO qui est montré ici et puis dans ce qui est étonnamment long les cellules remplacent
00:13:44.04 les séquences a par séquences alpha et ainsi, en utilisant des Southern blots, nous pouvons facilement voir le début et la fin de cette
00:13:55.05 et comme je vais vous le montrer, beaucoup d'étapes intermédiaires dans le processus. Le premier message à retenir de ce genre d'analyse
00:14:04.08 est que ce processus de réparation est étonnamment lent. Les cellules de levure ont un temps de division dans les conditions que nous utilisons de moins de trois heures
00:14:14.16 - deux heures et demie - et pourtant il faut au moins une heure aux cellules entre le moment où elles font une cassure double brin jusqu'au moment où l'on voit le produit de réparation
00:14:23.14 et juste pour vous rappeler que nous pouvons facilement voir que le produit de réparation est différent du produit de départ car les sites de restriction dans le bleu
00:14:31.01 les séquences sont différentes et nous voyons donc un fragment différent. Donc, ce que nous aimerions comprendre en détail, c'est où sont les étapes lentes
00:14:42.10 dans ce processus et il s'avère que ce n'est pas une étape lente, ce sont plusieurs étapes lentes. Regardons simplement le début de ce processus plus en détail.
00:14:54.05 Nous avons déjà parlé de cela dans la première conférence dont j'ai parlé et brièvement au début. Après il y a une cassure double brin
00:15:01.19 fait alors il y a ces deux exonucléases qui peuvent mâcher l'ADN pour générer des brins simples d'ADN. Les simples brins d'ADN
00:15:10.19 vont à la plate-forme pour la formation du filament Rad51, et le filament Rad51 va maintenant chercher l'espace afin de trouver des séquences
00:15:21.10 qui sont identiques avec lesquels il peut catalyser la première étape de la réparation
00:15:26.08 processus qui est l'échange de paires de bases entre l'ADN simple brin
00:15:30.15 au locus MAT et la même région dans le locus donneur, dans ce cas HML. Je vous rappelle que HML c'est dans ce cas 200 kilobases
00:15:41.09 sur le même chromosome, donc cette recherche est considérablement plus difficile que de rechercher une chromatide sœur qui va être très
00:15:49.11 très proche à proximité lors de la réplication. Maintenant, cette molécule brisée doit rechercher sur un chromosome entier ou dans certains cas si nous nous moquons
00:15:58.11 avec le système, recherchant d'autres chromosomes pour trouver ces séquences et générer cette première étape du processus de réparation. Alors comment savons-nous
00:16:11.05 ces choses que je viens de dire ? Eh bien, je vais vous montrer comment nous connaissons ces choses dans ce système. En 1990 Charles Blanc
00:16:20.00 qui était stagiaire postdoctoral dans mon laboratoire a compris le fait que nous pouvions voir le premier des intermédiaires de ce processus qui est l'action de ce
00: 16: 29.24 exonucléase qui descend maintenant l'ADN et si nous faisions passer l'ADN sur un Southern blot mais dans des conditions dénaturantes pour que les brins de Watson
00: 16: 40.16 et les brins de Crick ont ​​tous migré en tant que molécules uniques, ce que Charles a montré était le fait qu'au fur et à mesure que l'exonucléase progressait
00: 16: 48.18 en bas de l'ADN, il passerait un site de restriction, dans ce cas le StyI
00:16:53.09, et lorsque ce site est simple brin, il ne peut pas être clivé.
00:16:57.17 L'enzyme nécessite un ADN double brin pour le clivage et donc à ce stade
00: 17: 02.08 le fragment StyI qui est généré serait clivé ici et si vous sondiez
00:17:09.08 ceci avec des séquences qui sont spécifiques à ce brin, le brin qui se termine en 3', car c'est le brin 5' qui est mâché,
00:17:19.10 nous pouvions voir l'apparition de ce qui ressemble à un produit de digestion partielle. Si vous avez effectué des Southern blots et que vous n'ajoutez pas assez d'enzymes
00:17:26.09 vous verriez ce qui semble être des digestions partielles parce que vous n'auriez pas coupé ce site, vous auriez
00:17:31.23 coupe le site suivant. C'est exactement ce que nous voyons ici
00:17:34.01 mais ce n'est pas un produit de digestion partielle, c'est parce que ce site ne peut pas être clivé.
00:17:39.00 Maintenant, nous obtenons un morceau d'ADN aussi long et comme l'exonucléase continue au-delà de ce site, maintenant ce site ne peut pas
00:17:48.11 être clivé et nous obtenons un fragment aussi long et en effet
00:17:50.26 vous pouvez voir un autre fragment très faiblement ici qui est le prochain fragment dans ce processus de résection. Charles a travaillé
00:18:00.07 le fait que lorsqu'il y avait une cassure double brin, il y avait une résection étendue de 5' à 3' sur cette molécule. En route pour générer le produit
00:18:12.15 qui passe à nouveau de a à alpha dans cette configuration particulière. Cela a représenté la première reconnaissance que la façon dont le processus de recombinaison
00:18:25.24 a commencé par cette résection. Vous pouvez en fait rendre ce test plus informatif en supprimant
00:18:35.14 ces deux donateurs. Maintenant, quand nous faisons une cassure double brin,
00: 18: 38.03 le processus de résection va continuer encore et encore mais au lieu d'engager le donneur et de tout éteindre
00:18:46.09 et faire la réparation il n'y a aucun moyen de faire la réparation et il s'avère que c'est une machine de résection très inintelligente. Il continue à mâcher.
00:18:54.14 A partir de ce genre de mesures, nous pouvons en fait dire l'apparence de ces produits de digestion partielle si nous mesurions
00:19:02.16 quand ils sont apparus, nous avons appris une autre des caractéristiques lentes de ce processus de recombinaison : la résection se produit à environ un nucléotide
00:19:12,02 par seconde, soit environ quatre kilobases par heure. C'est étonnamment lent en termes de ce que vous pourriez imaginer se produire dans le tube à essai.
00:19:21.24 C'est peut-être lent parce que les nucléases descendant l'ADN doivent non seulement mâcher l'ADN, mais il y a des nucléosomes sur le chemin
00:19:28.27 et ces nucléosomes doivent être retirés et ainsi de suite. Nous ne savons pas vraiment pourquoi ce processus est si lent. Mais ce que nous avons
00: 19: 36.14 pu apprendre et cela a été principalement le travail d'autres laboratoires: Gregory, Ira, Lorraine Symington et les laboratoires de Stephen Jackson
00:19:45.18 qu'il existe au moins deux exonucléases majeures qui sont responsables de cette digestion. L'un d'eux est une enzyme appelée Exo1 qui joue également
00: 19: 58.28 rôles dans d'autres processus de réparation tels que la réparation par excision de nucléotides et l'autre est une machine compliquée impliquant une hélicase qui se déroule
00: 20: 10.02 ADN et une endonucléase qui coupe les petites queues d'ADN qui contient une protéine appelée Sgs1 que j'ai mentionnée précédemment
00: 20: 20.21 dans la vidéo précédente est un homologue de la protéine du syndrome de Bloom Bloom qui joue de nombreux autres rôles dans la recombinaison en plus du rôle
00:20:30.16 qu'il joue ici. Donc, ce qui est illustré ici, c'est le fait que vous pouvez facilement voir l'apparition de ces produits de digestion partielle dans le type sauvage
00: 20: 38.26, mais si vous supprimez à la fois Exo1 et la protéine hélicase Sgs1, il n'y a pratiquement pas de résection et l'ADN cassé
00:20:51.16 reste dans l'espace aussi longtemps que l'expérience est réalisée. Nous savons maintenant quelque chose sur les enzymes
00:20:58.27 effectuent ce processus de résection. Une fois la résection effectuée, le but
00:21:08.00 de la prochaine étape est la formation de ce filament Rad51. In vitro
00:21:16.01 expériences - expériences réalisées en utilisant ces protéines dans le tube à essai combinées à une identification génétique d'autres
00: 21: 23.28 composants nécessaires à la recombinaison suggèrent que pour former ce filament Rad51, il a probablement été précédé par la formation
00:21:34.03 d'un filament différent qui contenait la protéine de liaison RPA ou ssDNA qui se lie d'abord à cette région. Entre autres choses, l'ADN simple brin
00: 21: 45.11 la protéine de liaison empêche l'ADN simple brin de s'apparier et de former des structures secondaires peu compliquées et donc il s'étire
00: 21: 54.09 l'ADN mais cette RPA ne peut alors elle-même être retirée de l'ADN simple brin que par l'action d'un ensemble de ce qu'on appelle médiateur
00:22:02.23 protéines, dont l'une s'appelle Rad52 et une autre paire de protéines s'appelle Rad55 et Rad57. La dernière de ces protéines, Rad55 et Rad57
00:22:15.04 , ont en fait une certaine ressemblance avec la protéine Rad51 mais ils ne peuvent pas faire le travail de Rad51. On les appelle des protéines paralogues Rad51 et elles jouent
00: 22: 26.00 un rôle fondamentalement important dans ce processus d'élimination de la protéine de liaison simple brin et de son remplacement par le filament en croissance
00:22:36.05 de Rad51. Ces protéines sont très importantes dans ce processus et encore une fois, nous le savons grâce au travail sur éprouvette, mais je vais montrer
00:22:46.19 vous que maintenant nous savons cela en regardant à l'intérieur des cellules vivantes. Je vais aussi faire une parenthèse juste pour dire que l'une des curiosités sur l'évolution
00:22:56.26 est que les cellules de levure que nous étudions n'ont pas d'autre protéine appelée BRCA2. C'est l'un des deux principaux défauts héréditaires familiaux
00:23:11.00 dans le cancer du sein et il s'avère que la protéine BRCA2 joue un rôle très similaire à Rad52 en aidant à déplacer la RPA et à mettre Rad51
00:23:23.18 à sa place. Il s'avère que saccharomyces n'a tout simplement pas cette protéine et pendant longtemps, nous avons pensé que c'était peut-être une protéine qui n'était
00:23:33.07 a évolué tardivement dans l'évolution et ne se trouverait que chez les vers ou les mouches ou chez les souris ou les humains, mais en fait d'autres levures - une levure appelée ustilago
00:23:47.24 qui, pour ceux d'entre vous le savez, est également connu sous le nom de charbon du maïs et est en fait une délicatesse mexicaine - cet organisme a un homologue BRCA2, alors nous
00:24:01.12 pense que saccharomyces vient de perdre cette fonction et a gardé Rad52 comme seul moyen de faire ce genre de réparation. Rad52
00:24:11.19 et ces protéines paralogues vont maintenant faciliter la formation de ce filament. Nous pouvons voir que cela se produit in vivo en prenant
00:24:23.04 avantage d'une technique appelée Immunoprécipitation de la chromatine. Pour ceux d'entre vous qui n'ont jamais été exposés à cela auparavant, c'est un
00:24:33.05 manière dont on peut voir quelles parties de l'ADN sont liées par une protéine particulière et les étapes de base de l'immunoprécipitation de la chromatine
00:24:40.27 sont illustrés ici. Les protéines sont liées partout où elles sont liées à l'ADN à un moment donné. Si l'on ajoute du formaldéhyde au
00:24:50.05 cellules, il réticule les protéines les unes aux autres et réticule les protéines à l'ADN. Ensuite, la chromatine - protéines et ADN combinés - est soniquée
00: 25: 02.13 et brisé en morceaux relativement petits et si l'on utilise ensuite un anticorps contre la protéine qui vous intéresse, dans ce cas
00:25:11.22 Rad51, alors vous pouvez purifier tout l'ADN associé à cette protéine particulière. Si vous avez un anticorps différent, vous pouvez purifier
00: 25: 22.28 tout l'ADN qui était associé à cette protéine ou à cette protéine mais ici nous nous intéressons à Rad51 et nous pouvons donc extraire tout l'ADN
00: 25: 31.17 qui est purifié avec cet anticorps et puis il s'avère presque comme par magie simplement
00:25:38.24 en augmentant la température, on peut inverser ces induits par le formaldéhyde
00:25:43.05 se réticule puis se débarrasse de la protéine et se retrouve avec une solution pure de toutes les molécules d'ADN qui étaient initialement associées
00:25:52.23 avec, dans ce cas, Rad51. En faisant cela, nous pouvons alors purifier et demander à quelles séquences Rad51 se lie-t-il à tout moment de ce processus de réparation ?
00:26:04.23 Nous utilisons la réaction en chaîne par polymérase pour amplifier et confirmer la présence de tout ensemble individuel de séquences. C'est ce que nous avons fait ici.
00:26:14.17 Voici à nouveau le Southern blot - celui que je vous ai montré avant - qui prend très longtemps avant que nous obtenions un produit et voici la chromatine
00:26:25.07 résultats d'immunoprécipitation. Le premier résultat que je vous montre n'est pas Rad51 mais RPA. Nous pensons que RPA se lie avant Rad51
00:26:35.11 et en effet dès qu'on voit le double brin casser à cette position, on voit un enrichissement
00: 26: 42.08 dans la quantité d'ADN qui est au locus MAT qui est abaissé
00: 26: 46.17 par l'anticorps anti-RPA et encore une fois, nous utilisons une amplification PCR pour demander si les séquences MAT sont enrichies et effectivement
00:26:58.28 dès que nous voyons la rupture, nous voyons l'apparition de RPA sur le site de rupture.
00:27:03.07 En revanche, et étonnamment, il faut dix minutes avant de voir l'apparition
00:27:10.17 de Rad51. Voici la puce Rad51 et encore une fois, nous avons immunoprécipité à l'aide de l'anticorps anti-Rad51 et nous identifions
00:27:19.10 la région en utilisant une analyse PCR de cette région et nous voyons que contrairement à la RPA qui apparaît dès que la cassure est là, il s'avère
00:27:28.20 qu'il faut environ dix minutes avant de voir l'apparition de Rad51. C'est encore une chose à laquelle nous n'avions aucune anticipation en pensant simplement
00:27:38.07 à ce sujet à partir de termes biochimiques où toutes ces choses se produisent très très rapidement dans le tube à essai. Dans la cellule vivante d'où nous avons extrait
00:27:47.15 cette information, il y a un réel décalage entre le moment où il peut faire l'une de ces étapes et le temps qu'il peut faire l'étape suivante.
00:27:53.20 Nous ne savons pas encore pourquoi. L'autre chose que nous savons en effectuant le même type d'analyse est qu'il n'y a pratiquement pas de chargement Rad51 au MAT
00:28:06.28 lieu. Permettez-moi de revenir en arrière et de dire que maintenant nous examinons cette réaction, nous demandons donc quand Rad51 se charge-t-il sur l'ADN MAT ?
00:28:15.23 Que se passe-t-il si nous faisons cela en l'absence de cette protéine Rad52 et que la réponse est rien
00:28:21.12 se produit parce que vous avez absolument besoin de Rad52 pour déplacer
00:28:25.27 RPA et mettre Rad51 sur cette molécule simple brin. En revanche, si nous éliminons l'une des protéines paralogues, Rad55,
00: 28: 34.24 ce que nous trouvons, c'est que nous pouvons éventuellement charger la protéine Rad51 sur l'ADN, mais contrairement à ce qui se passe dans les cellules de type sauvage où cela se produit à l'intérieur
00:28:44.26 une heure, cela prend beaucoup de temps avant de pouvoir le faire en l'absence du paralogue Rad55. Le paralogue Rad55 est important, la protéine Rad52
00:28:56.26 est absolument nécessaire pour la formulation de cet intermédiaire et dans ces deux cas, les cellules ne parviennent pas à effectuer la réaction de recombinaison
00:29:06.20 car ils n'ont pas de filament Rad51 fonctionnel. Cette même exigence se retrouve dans les cellules de mammifères. Ce n'est pas un travail que nous avons fait.
00:29:16.11 Ou devrais-je dire dans les cellules de vertébrés. C'est encore le remarquable système de cellules de poulet DT40 qui effectuent une recombinaison homologue
00:29:24.24 à un niveau très élevé et il a été largement étudié principalement dans le laboratoire de Shinichi Takeda où ils peuvent créer des KO
00:29:33.22 des gènes de la même manière que nous créons des knock-outs très facilement chez saccharomyces cerevisiae donc il est maintenant possible de comparer la levure
00:29:42.13 résultats et résultats vertébrés utilisant ce système particulier. Ce n'est pas en abattant les gènes par siRNA, mais en les supprimant vraiment par complète
00:29:55.00 suppressions. Encore une fois, ce que l'on voit ici dans les différents tests, c'est le fait que vous n'avez pas de formation de filament Rad51 en l'absence
00:30:05.05 d'une déficience en BRCA2 ou en l'absence de l'un des cinq paralogues que les cellules vertébrées
00:30:12.19 ont qui sont liés aux protéines Rad55 et Rad57. Celui-ci s'appelle XRCC2.
00:30:18.15 Donc, si vous irradiez des cellules avec un rayonnement gamma dans des cellules de type sauvage après un certain temps, on voit ces points lumineux.
00:30:29.06 Ceux-ci sont colorés avec un anticorps contre la protéine Rad51. Ces foyers représentent des lieux
00:30:34.15 où un filament s'est formé en assemblant Rad51 sur les sites de ruptures double brin et Rad51 ne parvient tout simplement pas à se former
00:30:43.18 en l'absence de BRCA2 et en l'absence des paralogues. Tout comme nous avons pu le voir par ChIP, il peut être vu
00:30:52.03 dans des cellules de vertébrés en utilisant cette technique un peu plus éloignée car ils ne regardent pas directement l'ADN
00:30:58.29 ou un ensemble individuel de séquences d'ADN. Cela nous a amenés à ce point où nous avons un filament. La prochaine chose que nous
00:31:09.00 voulez savoir est: comment ce filament effectue-t-il la recherche pour trouver des séquences homologues et pour effectuer cela
00:31:16.13 point d'invasion de brins ? La première question est combien de temps cela prend-il? Il s'avère que la même chromatine
00: 31: 24.02 technique d'immunoprécipitation que je vous ai montrée peut être utilisée pour déterminer quand Rad51 se lie à ces séquences
00: 31: 32.17 peut en fait être utilisé pour déterminer quand le filament Rad51 trouve les séquences donneuses et c'est fondamentalement juste illustré
00:31:40.16 ici. Une fois que vous avez croisé la protéine Rad51 à l'ADN, vous pouvez voir quand vous descendez les séquences MAT, mais quand
00: 31: 49.12 le processus d'invasion du brin se produit Rad51 au moins pendant un certain temps devrait être associé non seulement au simple brin
00:31:56.13 ADN, mais avec la séquence du donneur. C'est l'ADN double brin et l'ADN simple brin
00:32:01.19 se réunissant dans le filament afin de faire le processus d'échange de brin et donc si vous réticulez cet intermédiaire
00: 32: 08.26 avec du formaldéhyde et faire exactement le même enrichissement avec l'anticorps, vous devriez faire baisser non seulement le MAT
00:32:15.27 séquences mais les séquences donneuses aussi. Et effectivement cela s'avère être le cas. Si vous faites la même expérience
00: 32: 24.27 et maintenant utiliser une sonde non pas pour MAT mais un ensemble d'amorces PCR qui sont spécifiques pour les séquences donneuses,
00: 32: 33.20 les séquences donneuses ne sont associées à Rad51 que bien plus tard que les séquences donneuses qui étaient liées
00:32:44.26 au MAT. Cela a du sens - il faut du temps réel pour que cette recherche ait lieu - pour que le filament Rad51 cherche partout sur ce chromosome pour trouver un minuscule
00:32:55.01 petite région c'est en fait seulement une région de 320 paires de bases qui a une homologie à la fin de cette cassure double brin.
00:33:02.28 Le chromosome entier s'avère être près de 320 000 paires de bases et nous recherchons 320 de ces paires de bases
00:33:14.13 comme site d'homologie et il faut du temps réel pour que cette recherche ait lieu. Comme il est dit ici, si nous devions mettre ces donateurs
00:33:23.28 séquences sur un chromosome différent, comme nous l'avons fait, cette recherche prend encore plus de temps car elle s'avère plus facile
00:33:31.17 pour rechercher dans un chromosome que de rechercher entre les chromosomes et bien sur n'importe quel professeur de chimie que vous
00:33:40.03 vous ai déjà dit qu'une réaction intramoléculaire était plus rapide qu'une réaction bimoléculaire, mais d'y penser au
00:33:48.04 le niveau d'un chromosome entier est assez incroyable. C'est-à-dire une interaction intrachromosomique à 200 kilobases
00:33:55.24 est bien plus efficace que la recherche entre différentes molécules d'ADN. J'aimerais que nous en sachions plus sur la raison.
00:34:05.14 Nous avancions - nous sommes arrivés au point où il y a une invasion de brins - la prochaine étape de ce processus est qu'il y a
00: 34: 15.04 doit être une nouvelle synthèse d'ADN et une nouvelle synthèse d'ADN va être initiée à partir de la fin de ce seul brin ici
00: 34: 23.24 en ajoutant de l'ADN polymérase et maintenant en copiant dans cette région et comme je l'ai mentionné plus tôt, c'est différent de l'ADN normal
00:34:31.10 réplication parce que nous pensons que le brin nouvellement synthétisé est en cours d'extrusion et n'est qu'à la fin de cette
00:34:38.15 processus d'extrusion que la deuxième extrémité va pouvoir effectuer la synthèse maintenant dans le sens inverse pour remplir tout cela.
00:34:47.20 Au cours de ce processus, il doit également y avoir un écrêtage de ces séquences rouges et cela s'avère être fait
00:34:56.00 par un ensemble de protéines dont les protéines Rad1 et Rad10 dont le travail normal est de couper l'ADN lors de la réparation des photodimères.
00:35:07.29 Ici recruté pour couper ces queues non homologues et il s'avère que cela est également reconnu par deux protéines
00: 35: 17.12 qui ont normalement un rôle dans la reconnaissance de l'ADN mésapparié appelé MSH2 et MSH3 qui ont un rôle dans la réparation des mésappariements
00: 35: 25.16 et ils jouent également un rôle dans ce découpage mais aucune des autres protéines de réparation par excision de nucléotides
00: 35: 32.10 et aucune des autres protéines de la réparation des mésappariements n'est impliquée dans ce processus, c'est donc une nouvelle petite machine qui est assemblée
00:35:39.14 sur des composants de deux autres processus importants de réparation de l'ADN et qui permet l'élimination de ces séquences rouges.
00:35:47.19 La prochaine chose sur laquelle nous voulons nous concentrer est le lancement d'une nouvelle synthèse d'ADN. Comment voit-on cela ?
00:35:58.29 Eh bien, nous voyons qu'en utilisant un autre test vraiment sympa qui a également été développé par Charles White en 1990 et c'est un
00: 36: 08.05 réaction en chaîne par polymérase, donc ce que Charles a compris, c'est que si vous mettez une amorce dans HML juste à gauche du partage
00: 36: 17.26 séquences essentiellement les séquences alpha qui vont être ajoutées à cela dans ce processus de réparation et une autre amorce de PCR
00: 36: 27.29 qui est ici au locus MAT, ces deux amorces sont initialement distantes de 200 kilobases et donc pas d'amplification mais une fois
00: 36: 39.15 l'invasion des brins a eu lieu et vous autorisez cinquante paires de bases de nouvelle synthèse d'ADN à partir de l'extrémité 3', maintenant il y a un covalent
00:36:49.04 morceau d'ADN qui rejoint cette amorce et cette amorce et vous obtenez un produit PCR que vous pouvez doser. Nous pouvons mesurer maintenant,
00:36:58.19 ici par immunoprécipitation de la chromatine, ici le jeu synaptique par immunoprécipitation de la chromatine, et puis par ce même
00:37:07.03 un test PCR intelligent, nous pouvons voir l'apparence de ce nouveau produit et ce que je vais vous montrer, c'est essentiellement que
00:37:17.20 ces deux étapes sont en elles-mêmes des étapes lentes. La recherche, affinée en prenant plus de points, ne dure pas une demi-heure
00:37:26.07 comme je vous l'ai montré pour la première fois, mais environ 15 minutes. Mais il faut alors encore 15 ou 20 minutes avant de voir l'apparition
00: 37: 32.29 de la nouvelle synthèse d'ADN, et pourquoi cela devrait prendre autant de temps pour assembler la machinerie de réparation de l'ADN, la machinerie de réplication
00:37:41.14 à cette fin est une autre des choses que nous devons encore étudier C'est un travail non publié d'un étudiant diplômé
00:37:50.28 dans mon labo nommé Wade Hicks. Fondamentalement, Wade a juste pris beaucoup plus de points pour effectuer ce test et il se répète
00: 37: 59.22 ce que je viens de dire : nous pouvons voir la cinétique de la protéine Rad51 à l'extrémité cassée de la molécule d'ADN au MAT,
00:38:08.07 nous pouvons voir l'apparition - et il s'avère que c'est environ 15 minutes plus tard - de la protéine Rad51 au niveau de la séquence du donneur HML,
00: 38: 17.08 et puis nous devons attendre encore longtemps avant de voir le début d'une nouvelle synthèse d'ADN par cette PCR
00:38:23.16 réaction que je viens de vous montrer. Ce sont toutes des étapes lentes dans ce processus et nous ne sommes même pas arrivés à la fin parce que,
00: 38: 31.18 si je reviens juste en arrière, cette étape ici est l'étape pour commencer ce processus, mais cela prend 15 minutes ou plus
00: 38: 42.16 peut-être plus longtemps avant d'arriver à la toute fin de ce processus et d'avoir terminé toute la copie et le nettoyage
00:38:48.01 étapes pour passer de MATa à MATalpha. Je n'ai pas grand-chose à dire sur cette approche mais je veux juste vous montrer
00 : 38 : 59.28
00:39:07.15 de changement de type d'accouplement en regardant. Ici, nous avons emprunté la technologie qui a d'abord été développée par John Sedat
00: 39: 17.04 laboratoire de Wallace Marshall et Aaron Straight et Andrew Belmont dans lequel on peut marquer des emplacements individuels sur les chromosomes
00:39:28.21 et on le fait en insérant des tableaux des séquences d'opérateurs Lac. Il s'agit de l'opérateur de l'opéron Lactose
00:39:37.01 de bactéries - par ex. coli - puis lui lier une protéine de fusion entre la protéine répresseur Lac qui est fusionnée au vert
00:39:45.20 protéine fluorescente et cela créera une marque verte à un moment donné dans la cellule. Ici juste à côté du donneur HML.
00:39:53.15 Par le même genre d'approche, on peut mettre un ensemble différent de séquences - l'opérateur pour le système inductible à la tétracycline
00: 40: 02.18 - et le répresseur Tet lié à celui-ci est maintenant fusionné dans ce cas à la protéine fluorescente rouge, nous avons donc deux points
00:40:10.00 un rouge et un vert et la question est que font-ils quand vous allumez l'endonucléase HO ? Ce peu informatif
00:40:19.20 un petit film dit simplement que nous pouvons réellement faire ce que je veux appeler des mesures de molécules uniques. C'est un
00:40:28.01 chromosome dans une cellule observant comment ces séquences s'assemblent, restent ensemble et se séparent pendant le processus de réparation.
00:40:35.19 Les données que je vais vous montrer qui se trouvent sur cette diapositive ont en fait été recueillies plus tôt dans des cellules fixes - parce que nous ne sommes pas
00:40:44.03 terminé avec l'analyse des cellules vivantes - en utilisant deux points verts mais le principe est exactement le même. La première chose est que j'ai dit
00: 40: 52.08 vous que MAT va se recombiner avec HML pour remplacer une séquence par alpha et une question serait " sont-ce
00:40:59.13 séquences déjà ensemble avant que le processus de réparation n'ait lieu ?' et la réponse est non car dans presque toutes les cellules
00:41:06.24 nous voyons deux taches. Ce que montre ce graphique, c'est quelle fraction des cellules n'a qu'une seule tache et nous voyons une tache lorsque le
00:41:14.19 deux points verts se rejoignent et ils ne sont plus résolubles car ils sont trop proches l'un de l'autre et donc seulement
00:41:20.28 une très petite fraction de cellules a une tache au début mais dès que nous allumons l'endonucléase HO la fraction
00:41:28.16 des cellules avec un point montent et montent. Cela reflète le fait qu'ils se réunissent
00:41:33.13 pour effectuer ce processus de réparation. Ils restent ensemble pendant un certain temps nécessaire pour faire la réparation, puis ils viennent
00: 41: 40.13 à part et nous pouvons donc voir maintenant essentiellement tout ce processus dans les cellules fixes et maintenant dans les cellules vivantes pendant qu'ils effectuent ce processus
00:41:51.17 non perturbé par aucun de ces autres mécanismes. Nous n'utilisons pas l'immunoprécipitation de la chromatine, nous n'utilisons pas
00:41:57.12 PCR, nous ne faisons qu'observer et pourtant cela nous en dit long sur ce processus. Une chose qu'il nous a dit est la fonction de
00:42:08.02 une autre protéine incapable d'effectuer la réparation. C'est un autre des gènes dits Rad. Tous ces gènes Rad étaient
00:42:17.01 identifiés initialement parce qu'ils sont sensibles aux rayons X. Donc Rad52, Rad51 et Rad55, et Rad57, et d'autres étaient tous
00: 42: 28.11 identifié parce que les cellules n'ont pas réussi à réparer correctement les cassures double brin causées par les rayonnements ionisants des rayons X et l'un de ceux-ci
00:42:35.19 protéines était Rad54. Rad54 ne peut pas non plus effectuer l'achèvement de la commutation de type d'accouplement ou d'autres doubles
00:42:44.21 événements induits par une rupture de brin. Mais son défaut est différent du Rad55, ou du Rad57, ou du Rad52 car il charge le Rad51
00:42:54.13 protéines très bien - il n'y a pas de défaut dans le chargement de Rad51 sur les extrémités de la cassure double brin - et il peut le faire
00:43:02.11 processus d'invasion des brins très bien que nous pouvons voir ici car il peut mettre ces taches ensemble - les deux taches vertes ensemble -
00:43:09.29 pas de problème mais il ne peut pas terminer le processus.Et en fait, si nous analysons cela en utilisant la réaction en chaîne par polymérase du
00: 43: 18.17 sorte que je vous ai déjà montré, la raison pour laquelle Rad54 est défectueux dans ce processus est qu'il ne peut pas effectuer l'étape suivante du processus
00: 43: 26.02 qui correspond aux 50 paires de bases de la nouvelle synthèse d'ADN que nous avons analysée par amplification en chaîne par polymérase. Alors Rad54
00: 43: 36.14 peut apparemment effectuer quelque chose comme un processus d'invasion de brin normal mais il ne fait rien dans l'invasion de brin
00: 43: 45.00 processus pour permettre à la fin de l'ADN d'être disponible pour maintenant une nouvelle synthèse d'ADN et cela a été l'un de ceux
00:43:52.21 choses que nous avons découvertes en combinant ces techniques très différentes : l'immunoprécipitation de la chromatine et cette lumière visuelle
00:44:00.20 microscopie pour en quelque sorte voir où la protéine Rad54 a vraiment un défaut. Les prochaines choses que je vais vous dire sont des choses
00:44:13.04 que nous sommes vraiment encore en train de comprendre et je vais donc vous montrer plus d'idées sur ce que nous essayons
00:44:21.11 pour apprendre que les conclusions finales parce que nous n'en avons pas fini avec ce genre d'approches. Mais une des choses
00:44:28.07 qui nous fascine vraiment, c'est le problème que j'ai mentionné au tout début : comment se fait-il que l'endonucléase HO
00:44:35.15 ne peut pas cliver les séquences des donneurs ? Apparemment à cause de la présence de ce nucléosome qui se trouve dans cette région
00: 44: 42.27 et je dirai simplement que Kirsten Weiss dans le laboratoire de Bob Simpson il y a quelques années a montré en utilisant la nucléase micrococcale
00: 44: 51.15 et d'autres techniques, elle pourrait cartographier la position exacte de tous les nucléosomes dans la région silencieuse HML et il y a donc
00:44:58.25 toute cette série de nucléosomes très positionnés dans cette région et l'un d'eux se trouve là où HO devrait pouvoir
00:45:06.24 pour couper. La question est donc : comment le filament Rad51 peut-il s'engager exactement de la même manière
00:45:13.18 afin d'initier une invasion de brins et une nouvelle synthèse d'ADN ? Et le message à retenir est que nous ne savons pas.
00:45:21.13 Voici comment nous essayons de le comprendre. Nous pouvons analyser dans quelle mesure ces nucléosomes sont positionnés en clivant
00:45:30.24 l'ADN avec la nucléase micrococcale, qui ne se scindera que dans les régions d'espacement entre les nucléosomes, et si un nucléosome
00: 45: 40.23 n'a pas bougé et est dans une position alors une paire d'amorces PCR qui fait le tour du nucléosome va amplifier un court
00:45:49.26 région de l'ADN que nous pouvons voir. Mais si ce nucléosome a été écarté, alors nous devrions voir que cela
00:45:57.21 la région n'est plus protégée et ce signal devrait tomber. Le Wade Hicks susmentionné qui avait fait le
00:46:04.26 expériences que je vous ai montré précédemment a essayé de faire ces expériences et il voit quelque chose mais pas
00:46:11.12 beaucoup et c'est qu'au fur et à mesure que l'invasion des brins a lieu et c'est la puce Rad51 montrant que ces séquences
00: 46: 19.08 se sont réunis avec le donneur, il y a un très petit changement dans la protection du nucléosome à l'endroit où
00:46:28.27 l'invasion du rivage a lieu. Ces expériences ont été réalisées dans des conditions où le processus pouvait
00: 46: 35.01 continuer et les cellules pourraient continuer et terminer le processus de réparation et peut-être si nous pouvions arrêter le processus ici avant
00: 46: 42.19 une nouvelle réplication de l'ADN avait eu lieu, nous pourrions voir un changement plus profond dans la structure du nucléosome
00:46:49.12 et c'est une question que nous aborderons à l'avenir. Puisque je viens de mentionner le fait qu'il serait bien d'arrêter le processus
00: 47: 02.11 en bloquant la réplication de l'ADN, je devrais vous parler un peu de ce que nous savons sur la façon dont la réplication de l'ADN
00:47:08.11 se déroule vraiment dans cette région. C'est clairement différent pour la réplication normale de l'ADN en ce que l'ADN nouvellement synthétisé est extrudé
00: 47: 18.05 et ensuite utilisé pour copier l'autre brin et cela prédit que tout l'ADN nouvellement synthétisé
00:47:23.19 devrait être dans le locus MAT et le donneur devrait rester inchangé et nous pensons que c'est le cas. Laissez-moi d'abord
00:47:31.21 vous montre ce que nous savons sur les protéines nécessaires à la réplication de l'ADN dans cette circonstance particulière.
00: 47: 38.18 Nous savons que la réplication de l'ADN implique normalement la protéine clamp appelée PCNA qui est nécessaire pour maintenir l'ADN
00:47:49.01 machines de réplication sur le modèle et cela s'avère être vrai, nous en avons également besoin dans cette situation. Voici une sensible au froid
00: 47: 57.11 mutation de PCNA et si nous bloquons les cellules afin qu'elles ne puissent pas faire la réplication normale de l'ADN à basse température
00:48:06.04 alors au lieu de - cela se fait également à basse température - normalement nous verrions l'apparence de ce produit
00:48:12.23 qui est maintenant le passage de MATa à MATalpha. Mais dans les cellules dépourvues de cette protéine PCNA fonctionnelle à basse température,
00:48:20.26 il n'y a pas de synthèse, ergo, vous avez besoin de PCNA pour que ce processus ait lieu. Il semble que vous ayez besoin de l'un ou l'autre
00:48:30.18 pol epsilon ou pol delta pour effectuer ce processus. Ce sont deux des trois principales polymérases de saccharomyces et je ne vais pas
00: 48: 39.15 vous montre les données mais vous n'avez pas besoin de la polymérase à brin retardé pol alpha ou de son ARN dépendant associé
00:48:47.05 étape primase mais vous avez apparemment besoin de pol epsilon ou de pol delta parce que si nous faisons le même genre d'expérience
00:48:55.25 ici en utilisant des mutations sensibles à la température, si nous avons une mutation sensible à la température de pol epsilon ou une température
00: 49: 03.23 mutation sensible de pol delta et nous les regardons à leur température non permissive ce que nous trouvons est que
00:49:10.19 dans les deux cas, nous obtenons un produit bien qu'il soit un peu plus lent et quelque peu réduit et cela soulève au moins la possibilité
00:49:19.15 que l'une ou l'autre de ces polymérases peut fonctionner. Cela ne nous dit pas tout à fait si l'un d'entre eux le fait 98% du temps
00:49:26.23 le travail, mais quand nous l'éliminons, l'autre peut prendre le relais, ou s'il partage vraiment le processus.
00:49:33.03 Nous ne savons toujours pas avec certitude quelle est la réponse. Nous avons examiné de nombreux autres composants de la réplication de l'ADN.
00:49:42.06 L'un de ceux que nous avons examinés est un complexe protéique appelé Dpb11-Sld2-Sld3. C'est un complexe nécessaire
00:49:51.29 pour le chargement des protéines hélicase et la mise en place d'une fourche de réplication d'ADN normale à une origine
00:49:59.02 de réplication et nous avons également examiné une kinase appelée Cdc7 qui est à nouveau nécessaire pour toute réplication normale de l'ADN.
00: 50: 09.23 La question est donc: avez-vous besoin de Sld2/3 et Dpb11 - avez-vous besoin de Cdc7 - pour une commutation MAT normale, ce qui n'est pas la même chose que la normale
00:50:21.04 réplication ? Pour ce faire, nous avons utilisé une astuce très astucieuse de Kevan Shokat à l'UCSF qui consiste à créer ce qu'on appelle un analogique
00:50:32.21 allèle sensible de Cdc7. L'allèle sensible à l'analogique Cdc7 a été muté de telle sorte que son
00: 50: 43.10 Site de liaison à l'ATP - c'est une kinase, il utilise l'ATP pour phosphoryler les protéines - ce site actif a été agrandi
00: 50: 50.18 d'une manière qui s'adaptera à un inhibiteur et aucune autre kinase dans la cellule n'a un site agrandi comme celui-ci, donc l'inhibiteur
00:50:58.15 inhibe spécifiquement Cdc7 sans inhiber aucune des autres kinases dans la cellule. Cela signifie que nous pouvons spécifiquement
00:51:06.09 bloquer l'action de Cdc7. Si vous regardez ici, nous avons bloqué l'action de Cdc7, ces cellules ne peuvent pas faire la réplication normale de l'ADN
00:51:15.27 car ils ont besoin de Cdc7 à cette fin, mais ils n'ont aucun problème à effectuer la commutation MAT.
00:51:21.09 Cela signifie donc que Cdc7 n'est pas requis pour la commutation MAT même s'il est requis pour la réplication normale de l'ADN. Maintenant, nous prenons ces cellules
00:51:30.28 qui sont bloqués avant d'initier la réplication de l'ADN et nous demandons : ont-ils besoin de Dpb11 ? La réponse est, apparemment,
00: 51: 40.20 oui, car en l'absence d'autre réplication d'ADN - car Cdc7 a été bloqué
00:51:46.21 - si vous éliminez Dpb11, il n'y a pas de produit. Cela nous fait valoir que Dpb11 est requis dans le processus de commutation MAT normale
00:51:57.23 ainsi que pour la réplication normale de l'ADN lorsque Cdc7 est assommé. Nous avons fait d'autres expériences pour essayer d'obtenir
00:52:05.18 une liste de toutes les protéines nécessaires à la réplication dans ces conditions et bien que je ne vous montre pas les données
00:52:13.04 pour cela, il s'avère que l'hélicase nécessaire à la réplication normale de l'ADN - qui implique les protéines MCM,
00:52:21.22 MCM2, 3, 4, 5, 6 et 7 - n'est pas non plus nécessaire pour faire le petit patch de synthèse d'ADN que nous voyons dans le changement de type d'accouplement.
00: 52: 31.22 Cela suggérerait que nous examinons un processus inhabituel qui utilise un sous-ensemble de la réparation de l'ADN
00: 52: 45.08 machines pour effectuer ce processus et soutient à nouveau que tout l'ADN nouvellement synthétisé devrait être dans le receveur
00: 52: 52.14 donc nous avons également essayé de répondre à cette question et puis c'est la question : est-ce que la commutation MAT procède vraiment par
00:53:00.22 ce mécanisme SDSA ? L'essentiel est vraiment de se poser la question : la synthèse d'ADN dans ce processus est-elle conservatrice ?
00:53:10.05 ou semi-conservateur ? Dans la réplication semi-conservative, le genre auquel nous pensons dans la réplication normale de l'ADN, le
00: 53: 21.07 l'ADN nouvellement synthétisé sera toujours associé à l'ancien brin de son modèle à partir duquel il a été copié, mais dans cette synthèse dépendant
00: 53: 32.10 mécanisme d'annelage des brins, tout l'ADN nouvellement synthétisé va se retrouver dans le receveur
00:53:38.16 lieu. Et donc la question est de savoir comment faire la différence entre ces deux ? Pour ce faire, nous avons essentiellement
00:53:44.05 a suivi une technique qui a été développée en 1958 et est parfois appelée la plus belle expérience réalisée
00: 53: 51.05 en biologie moléculaire par Meselson et Stahl dans lequel ils ont démontré que la réplication de l'ADN était en fait semi-conservatrice
00:53:59.03 et juste pour vous rappeler cette expérience classique, ils ont fait pousser les cellules en milieu lourd jusqu'à ce que tout l'ADN
00:54:07.16 était fortement marqué avec de l'azote lourd. Ils ont ensuite déplacé les cellules vers un milieu normal contenant du N14, puis ils se sont séparés
00:54:16.13 l'ADN par sa densité dans un gradient de chlorure de césium et ils ont pu montrer qu'en commençant par de lourds
00: 54: 25.29 ADN qu'après un cycle de réplication de l'ADN, que tout l'ADN était uniformément d'une même sorte, c'était lourd-léger,
00: 54: 34.19 c'est-à-dire qu'un brin était encore lourd et que le brin nouvellement synthétisé était léger et puis si cela passait par un autre tour
00: 54: 42.25 de la réplication de l'ADN, vous vous retrouveriez avec une population d'ADN lumière-lumière et une quantité égale
00:54:49.15 d'ADN lourd-léger du premier tour suivant de réplication.
00:54:53.18 Cette technique de densité permet donc de dire si l'on a ou non des semi-conservateurs
00:54:59.11 réplication ou passez-vous en un seul saut de lourd-lourd à léger-léger ? Et ainsi nous avons porté
00: 55: 06.20 sur cette expérience - Gregory Ira - qui était stagiaire postdoctoral dans le laboratoire et a maintenant un laboratoire à l'université de Baylor a modifié le MAT
00: 55: 16.12 locus ici pour des raisons techniques, nous avons dû faire un morceau d'ADN un peu plus gros que nous avons mis en place
00: 55: 23.21 de la séquence donneur normale - séquences A - et donc, lorsque cela passe en MAT, nous pouvons identifier ces séquences
00 : 55 : 32.04 et la question est : lorsque vous changez, les cellules sont cultivées dans un milieu lourd, transférées dans un milieu léger, puis
00: 55: 39.10 demandé de passer par le processus de commutation, génèrent-ils de l'ADN léger-léger ou de l'ADN lourd-léger ? ADN lourd-léger
00:55:50.18 serait la marque d'une synthèse semi-conservatrice. Nous avons réalisé cette expérience. Ce que nous obtenons, c'est que l'ADN est presque
00:56:01.21 exclusivement léger-léger, ce qui signifie qu'il est passé de lourd à complètement léger en un seul événement de commutation, ce que vous
00: 56: 09.10 s'attendrait si cela se produisait par SDSA et non ce à quoi vous vous attendriez si cela se produisait par un soi-disant
00:56:15.19 mécanisme de réplication semi-conservateur. Les séquences sont légèrement plus lourdes que light-light car une partie des séquences
00: 56: 23.25 dans le fragment que nous avons analysé ne doivent pas être remplacés pendant le processus de réparation et ils restent lourds
00: 56: 29.15 et nous n'obtenons donc pas d'ADN exactement léger, mais s'il était très léger, il aurait été sans équivoque vu au milieu
00:56:38.09 ce qui n'est pas le cas. Cela nous indique que tout l'ADN nouvellement synthétisé se trouve dans le locus receveur. La dernière série de questions que je voudrais
00:56:50.02 aimeriez-vous aborder avec la précision du processus de réplication de l'ADN ? Ce n'est pas l'ADN normal
00: 56: 56.18 processus de réplication et il n'est même pas clair que la machine normale qui surveille les erreurs de réplication fonctionne
00:57:04.22 pour travailler. La réparation des mésappariements fonctionne-t-elle dans ce contexte ? Comment la cellule sait-elle, par exemple dans cette situation, est-ce
00:57:13.25 un ancien brin et c'est un nouveau brin ? Comment la cellule définit-elle les anciens et les nouveaux brins qui sont nécessaires pour une précision
00:57:20.08 réparation d'incompatibilité dans une situation où vous ne disposez pas d'un fork de réplication complet.
00:57:25.02 Pour répondre à ces questions, nous voulions demander à quelle fréquence au cours de ce processus de commutation voyons-nous des mutations se produire au cours de ce processus ?
00:57:35.00 Pour ce faire, et encore une fois c'est un travail qui n'est pas publié mais qui pourrait bientôt être publié, nous avons dû truquer le système de type d'accouplement afin que nous puissions
00:57:47.28 suivez ces événements plus précisément. Pour ce faire nous avons remplacé les séquences du locus donneur - HMR - par une copie d'un gène uracile3
00:57:59.04 - un gène biosynthétique - qui n'était pas dérivé de saccharomyces mais d'une levure apparentée appelée kluyveromyces et il s'avère que
00:58:06.26 Je vais vous montrer que c'était une chance incroyable. Peut-être que nous avons fait cela parce que nous étions un peu paresseux parce que quelqu'un avait déjà
00:58:13.18 ces séquences mais si on ne les avait pas utilisées on ne verrait pas ce que je vais faire
00:58:17.12 pour vous dire que nous pouvons maintenant voir. La bonne chose à propos de cet arrangement est que
00: 58: 23.08 ces séquences ne sont pas exprimées car elles sont toujours soumises au même mécanisme de silence que les donneurs ont normalement et
00:58:31.26 donc les cellules sont initialement en moins d'uracile. Ensuite, nous activons HO et les cellules basculent et lorsqu'elles basculent, elles apportent les séquences du gène uracile 3
00: 58: 41.23 dans le locus MAT mais maintenant il n'y a pas de silence et ces cellules sont ura plus, mais bien sûr, cela signifiait que nous pouvions rechercher des mutants
00:58:49.29 qui n'a pas mis ura plus ici. Ils s'avèrent résistants à un médicament appelé acide 5-fluorourotique et nous pouvons donc sélectionner des cellules uracile moins qui avaient
00:59:02.04 apparus pendant le changement et confirmer que ces mutants étaient nouveaux - qu'ils n'existaient pas dans ce modèle - nous pourrions faire une autre astuce
00: 59: 13.08 et il s'est avéré qu'en ajoutant simplement du nicotinamide au milieu, le nicotinamide est un inhibiteur de l'histone désacétylase Sir2 que j'ai
00: 59: 22.03 mentionné avant et quand vous faites cela, le locus d'accouplement silencieux ne devient pas silencieux et dans ces circonstances maintenant ces séquences aussi
00: 59: 31.24 car ces séquences vont être transcrites et il s'avère que ces cellules redeviennent uracile plus parce que le donneur n'est pas
00:59:39.03 altérée c'est juste la copie du gène de l'uracile qui est entré dans le MAT est altérée. Il s'avère que lorsque nous faisons cela, nous voyons environ mille
00: 59: 50,16 fois plus le niveau de mutations par rapport à ces mêmes séquences subissant une mutagenèse juste par réplication et je vais juste résumer
01:00:00.24 pour vous ce que nous avons trouvé jusqu'à présent et je vais juste vous montrer un exemple très rapide. La multiplication par mille de la mutation
01:00:10.16 est indépendant de la réparation des mésappariements, la machinerie de réparation des mésappariements ne semble pas savoir comment fonctionner dans ce contexte, et il s'avère qu'il s'agit des deux
01:00:19.22 en fonction du pol delta ou du pol epsilon. J'ai mentionné précédemment que nous aimerions savoir si pol epsilon fonctionnait principalement ou pol delta principalement
01:00:28.02 a fonctionné et ce que nous avons trouvé intéressant, c'est que les deux fonctionnent même dans ce contexte car nous avons des mutations sujettes aux erreurs
01:00:35.26 et les deux mutations sujettes aux erreurs de pol epsilon ou pol delta modifient le taux de mutation dans ce système. La chose la plus importante je pense est
01:00:45.02 que les mutations que nous voyons ont une sorte de signature. Ils sont différents qualitativement des mutations que nous voyons dans l'ADN normal
01:00:53.10 réplication et leurs caractéristiques sont trois, ou une selon la façon dont vous la regardez. Ce sont tous des exemples de ce que nous appelons le saut de modèle ou
01:01:04.19 changement de modèle, dont le plus simple est moins un décalage d'image dans de courtes séquences de la même séquence. Ensuite, il existe des versions plus extrêmes
01:01:15.02 qu'on appelle des mutations quasi-palindromes que je vais vous montrer très brièvement, et enfin il y a des sauts étonnants entre
01:01:21.28 modèles sur différents chromosomes. Ce sont des événements que nous n'aurions jamais vus si nous avions fait ces expériences d'une manière différente.
01:01:28.18 Vous n'avez pas besoin de prêter attention aux détails de cela. Les choses au-dessus de la ligne sont des substitutions de paires de bases, donc par exemple voici un C qui
01:01:39.13 change pour un T et ils l'ont fait deux fois dans deux expériences indépendantes. Certaines d'entre elles sont des mutations absurdes, vous avez donc ce qui
01:01:49.00 être un U maintenant une terminaison UAG de cette protéine dans sa traduction. Ceux en dessous des lignes sont des suppressions ou des décalages de trame et il n'y a pas d'augmentation
01:02:01.28 mais vous avez de très nombreux cas où trois T deviennent deux T ou dans ce cas-ci, quatre C deviennent trois C. C'est un chaud
01:02:12.27 pour une raison quelconque, car cela s'est produit neuf fois après les cinquante premiers événements de quelque chose que nous avons examinés. il y en a d'autres
01:02:20.17 exemples classiques de - désolé, juste pour souligner à nouveau si vous regardez dans les mutations spontanées, seulement la moitié d'entre elles dans les séquences d'homonucléotides et elles sont toutes les deux
01:02:32.28 décalages de trame plus et décalages de trame moins. Tous ces éléments sont négatifs et ils se produisent essentiellement à une exception près dans ces passages d'homonucléotides.
01:02:42.12 Il existe également des exemples de décalage de cadre plus classiques dans lesquels apparemment l'ADN polymérase est arrivée, est arrivée à ce point,
01:02:52.13 est tombé et ré-initie la copie exactement à la même séquence mais il laisse une suppression de 65 paires de bases.
01:03:00.10 Voici un cas simple où il y a deux fois la même séquence : ATC . . . ATC et vous vous retrouvez avec une copie d'ATC.
01:03:09.14 Tous ces éléments représentent des cas où la polymérase essentiellement
01:03:12.25 doit sortir du registre puis le rétablir et faire quelques mutations. Ensuite, il y a des mutations plus compliquées
01:03:22.15 qui implique à la fois des substitutions de paires de bases et des modifications soit des ajouts soit des suppressions de la séquence et il s'avère que tout cela peut être
01:03:31.13 expliqué par ce que l'on appelle des événements de quasi-palindrome.Ils ont été vus pour la première fois par Lynn Ripley et ont été vus dans d'autres cas par
01:03:40.09 Le laboratoire de Jeffrey Strathern, mais ici, ce qui se passe, c'est que le morceau d'ADN nouvellement synthétisé semble tomber, il s'auto-hybride, ou bien il commence à se copier
01:03:56.00 du brin déplacé et nous ne pouvons pas dire lequel est lequel. Mais dans tous les cas, il commence à se copier, puis il inverse cela et
01:04:07.02 revient à ce qu'il aurait dû faire et au cours de cela, cela conduit simultanément à des substitutions et des insertions de paires de bases
01:04:15.10 dans la séquence d'ADN, qui sont tous paramétrés. Ils sont calqués sur ces quasi-palindromes et encore une fois ceux-ci sont très très rares dans
01:04:24.04 mutations spontanées. Et puis finalement, en analysant ces séquences, nous avons découvert que parfois les séquences du MAT avaient des séquences
01:04:34.25 ici en rouge qui ne vient pas du tout du gène Kluyveromyces. Il s'avère qu'ils proviennent du gène uracil3 mais c'est le gène uracil3 qui
01:04:44.06 Saccharomyces a normalement et il est situé sur un chromosome complètement différent, sur le chromosome cinq, et non au locus HMR
01:04:52.21 sur le chromosome 3. Cela représente un cas où la matrice - l'ADN nouvellement synthétisé - va se dissocier de la matrice, tomber,
01:05:02.04 puis trouver un partenaire qui s'avère n'être identique qu'à 73% au niveau de la séquence d'ADN, et commencer à copier les séquences de cet étranger
01:05:11.01 emplacement, et après avoir fait cela, il va maintenant devoir se dissocier une deuxième fois et retourner au lieu pour finir
01:05:19.24 car c'est la seule façon de récupérer cet événement au MAT. Ce sont des événements vraiment remarquables et inattendus dans lesquels il y a des
01:05:27.15 saut de ce produit nouvellement synthétisé d'un chromosome à l'autre afin de récupérer des séquences afin d'enfin finir le
01:05:37.20 événement de réparation de l'ADN et ce n'est certainement rien que nous ayons jamais vu dans les événements spontanés. La raison pour laquelle ces événements sont de certains
01:05:47.02 l'intérêt est que récemment le laboratoire de Jim Lupski à Baylor s'est beaucoup intéressé à ce qu'on appelle les variations du nombre de copies dans diverses maladies humaines
01:05:56.22 et ces variations du nombre de copies semblent impliquer des cas où la machinerie de réplication de l'ADN arrête de copier, comme il se doit, ainsi que
01:06:05.11 de cette façon, tombe, puis revient en arrière et copie certaines séquences, retombe, copie d'autres séquences, retombe et copie certaines
01:06:14.20 d'autres séquences très éloignées les unes des autres. Tous les carrefours impliqués dans ces événements ont un très petit
01:06:23.26 nombre de paires de bases - microhomologie - et c'est exactement ce que nous avons vu dans le cas que je vous ai montré dans le cas MAT où nous obtenons
01:06:32.05 saute à nouveau de Kluyveromyces uracil3 à saccharomyces uracil3 en utilisant un très petit nombre de paires de bases à la jonction afin de revenir en arrière
01:06:42.04 et ainsi de suite et nous sommes donc très intéressés de comprendre comment ces événements se produisent parce que nous pensons que nous avons maintenant un système modèle à étudier
01:06:51.03 ces événements médiés par microhomologie, qu'ils soient une réplication induite par une rupture, comme le pense le laboratoire de Luskpi, ou qu'il s'agisse d'événements SDSA
01:07:00.09 comme nous l'imaginons, c'est quelque chose que nous devrons régler, mais nous pouvons maintenant utiliser ce système Saccharomyces comme moyen de les examiner
01:07:08.10 sortes de sauts de gabarit surprenants qui semblent se produire pendant le processus de réparation. Encore une fois pour résumer cette partie,
01:07:18.12 ce que nous voyons, c'est qu'il y a un taux de mutation très élevé associé à la réparation de l'ADN et que ces événements de réparation de l'ADN ont une sorte de
01:07:27.07 nouvelle signature qui nous dit que le processus de réparation de l'ADN est beaucoup moins processif que le processus normal de réplication de l'ADN. Enfin, je suis
01:07:40.13 je vais dire quelques mots sur la façon dont nous pouvons étendre ce système hors du contexte MAT pour poser des questions dans un contexte plus large et le
01:07:50.16 La première chose que nous avons faite est simplement de retirer les séquences du donneur et d'utiliser une autre copie de MAT mais sur un autre chromosome comme donneur.
01:08:00.23 Alors maintenant, il n'y a plus de silence. Cela n'implique pas HML ou HMR c'est juste une autre copie de MAT et comme je l'avais mentionné dans le précédent
01:08:09.29 conférence il s'est avéré qu'il y avait une série de différences de sites de restriction entre le donneur et le receveur de sorte que si la réparation se produit
01:08:18.12 entre la rupture faite au MAT et le donneur sur un chromosome différent et si ceux-ci sont ensuite associés à un croisement nous obtiendrons une nouvelle paire
01:08:27.27 de fragments de restriction, dont l'un est montré ici, ce qui nous indique que certains croisements de temps sont produits au cours de cette
01:08:37.04 processus de réparation de cassure double brin. Comme cela a été montré ou déduit des cellules de mammifères, si vous enlevez la protéine de Bloom
01:08:50.25 qui s'appelle Sgs1 ou Topoisomérase 3, alors on devrait pouvoir empêcher les doubles jonctions Holliday d'être soi-disant dissoutes et il devrait
01:09:02.27 pour être une augmentation des produits croisés et en effet c'est ce que nous voyons si nous supprimons Sgs1 ou Top3 ou le double mutant il y a un important
01:09:13.28 augmentation de ces produits croisés. Ce que cela signifie, nous pensons, c'est que Sgs1 et Top3 impliquent parfois un mécanisme de réparation
01:09:25.07 qui n'est pas SDSA mais l'autre mécanisme que j'ai mentionné, le double mécanisme de réparation de jonction Holliday parce que ce mécanisme
01:09:32.19 peut conduire à des croisements et ces croisements sont vaincus si l'hélicase Sgs1 et sa topoisomérase associée dissolvent ces intermédiaires
01:09:45.11 en les déroulant de manière à ce qu'ils se trouvent normalement en tant que produits non croisés. Si on enlève Sgs1 ou si on enlève Top3
01:09:54.25 maintenant, ce que nous voyons, c'est qu'il y a une augmentation des croisements et cela nous dit qu'au moins une partie du temps, la réparation n'est pas effectuée par SDSA
01:10:04.11 mais par une sorte de double mécanisme de jonction Holliday. C'est ce que je viens de vous montrer mais on peut aller un peu plus loin car là
01:10:16.00 sont d'autres hélicases en plus de Sgs1 qui jouent un rôle dans la réparation et nous avons donc réexaminé tout cela. Une grande partie de ce travail a été effectué soit par
01:10:27.27 Greg Ira quand il était dans mon labo ou plus tard quand il était dans son labo à Baylor. Ici ce qu'on voit c'est qu'il y a deux autres hélicases
01:10:37.28 qui modifie également le rapport entre les croisements et les non-croisements. Une hélicase connue sous le nom de Mph1 si nous l'assommons a également pour effet de considérablement
01:10:48.12 en augmentant le niveau de croisements et si nous créons un double mutant avec Sgs1 et Mph1, le niveau de croisement augmente encore plus.
01:10:57.17 Ensuite, il y a une autre de ces protéines appelée Srs2 qui semble également changer le rapport entre les croisements et les non-croisés mais en fait
01:11:08.09 avec Srs2 ce que nous avons découvert, c'est que c'est une conclusion trompeuse car Srs2 n'augmente pas le nombre de produits
01:11:19.08 qui sont en fait des croisements mais cela détruit d'une manière que nous ne comprenons pas - l'absence de Srs2 détruit la capacité de récupérer
01:11:28.07 de nombreux produits non croisés de la cellule. Ainsi, l'efficacité totale de la réparation est bien inférieure à la fraction de ces événements qui sont associés
01:11:37.27 avec les croisements reste constant et donc il y a apparemment une augmentation des croisements mais c'est vraiment pour une raison différente.
01:11:45.05 Si nous prenons toutes ces conclusions ensemble, nous pouvons commencer à avoir une idée de ce que font ces trois hélicases et nous donner une bien meilleure idée
01:11:55.20 image vraiment de ce qui se passe lorsque la cellule subit une rupture double brin. Ce que nous pensons maintenant, c'est qu'il y a une cassure double brin,
01:12:02.23 il commence à être influencé par les exonucléases et même par Rad51 et il commence à faire une sorte de processus d'échange de brins mais là
01:12:13.23 doit être une décision : va-t-il emprunter la double voie de jonction Holliday, ou va-t-il emprunter cette voie SDSA.
01:12:23.11 Il semble que Mph1 joue un rôle essentiel en décidant que ce sera une situation instable
01:12:30.13 D-loop où vous allez dérouler l'ADN nouvellement synthétisé
01:12:34.19 au fur et à mesure et que cela va conduire les choses dans cette voie. Lorsque vous enlevez Mph1, les choses suivent cette voie et les croisements augmentent.
01:12:45.11 Si vous éliminez Sgs1, les choses suivent déjà cette voie, mais elles ne peuvent plus être résolues en tant que non-croisements et
01:12:53.05 les croisements augmentent encore plus mais si vous éliminez Srs2, les cellules sont engagées dans cette voie - la plupart d'entre elles - celles qui descendent
01:13:03.18 cette voie va encore mener à des croisements mais maintenant les gars
01:13:07.07 qui commencent à suivre cette voie meurent pour la plupart et nous ne savons pas pourquoi ils meurent.
01:13:12.11 Quelque part au cours de ce processus, ils n'ont pas réussi à terminer le processus et nous ne les récupérons pas en tant que produits de réparation
01:13:21.10 mais nous ne savons pas encore comment cela se passe. Enfin, il y a une compétition entre
01:13:32.06 deux mécanismes de conversion génique différents, entre la double jonction Holliday
01:13:39.10 mécanisme et SDSA maintenant je vais vous dire qu'il y a enfin une compétition entre les mécanismes de conversion génique
01:13:46.04 et réplication induite par rupture. Vraiment, toutes ces choses se produisent dans la cellule en même temps et la cellule doit avoir un moyen de décider
01:13:54.02 laquelle de ces choses il devrait faire à un moment donné.
01:13:56.28 Donc, la différence entre la conversion génique et la réplication induite par rupture est clairement que
01:14:02.16 dans ce cas les deux extrémités engagent le même gabarit et font un petit patch
01:14:06.10 de la nouvelle synthèse d'ADN alors que la réplication induite par la rupture
01:14:09.28 une extrémité s'engage et commence à synthétiser et l'autre extrémité pour une raison quelconque ne s'implique pas. Nous avons découvert,
01:14:19.26 et cela deviendra important dans la façon dont je peux vous montrer la différence, que ces événements, les événements de réplication induite par une rupture dépendent de la
01:14:29.08 sous-unité pol delta non essentielle appelée Pol32. Ces événements, les événements de SDSA, ne le font pas. Suvi Jain qui était un étudiant diplômé du laboratoire a décidé
01:14:40.12 pour mettre en place un test sur la façon dont la cellule connaît vraiment la différence entre la conversion génique et la réplication induite par rupture et les tripes de base
01:14:50.18 de cette expérience sont présentés ici. Elle a mis en place une rupture à l'intérieur d'un gène appelé Leu2 sur le chromosome cinq et elle a fourni un modèle
01:15:00.26 pour cela comme un autre gène Leu2 sur le chromosome trois et donc, lorsque la rupture est faite, il peut l'utiliser comme modèle pour effectuer la conversion génique et réparer
01:15:11.27 cette cassure et cela ne change pas l'arrangement de tous les marqueurs de ce chromosome. La version extrême opposée
01:15:19.19 de ceci est qu'après la rupture, elle ne peut trouver une homologie que d'un côté de la rupture et donc maintenant la cellule n'a aucun moyen de faire la conversion génique
01:15:29.24 il ne peut faire que la réplication induite par rupture et par conséquent, vous copiez toutes les séquences sur le modèle à partir d'ici jusqu'à la fin
01:15:39.13 et vous perdez également toutes les séquences qui étaient à l'autre extrémité du chromosome cassé parce qu'il n'y a aucun endroit où aller et nous
01:15:47.07 a évidemment mis en place cela d'une manière où ces séquences étaient superflues. À la fin de la réplication induite par la rupture, vous disposez de deux copies de ces
01:15:55.06 séquences et aucune copie de ces séquences alors que dans la conversion génique, il y a une copie de chacune et il y a eu un petit patch
01:16:02.12 de la nouvelle synthèse d'ADN. Suvi a posé une question très intéressante à savoir à quel moment la machinerie d'invasion des brins perd de vue le fait
01:16:12.26 que les deux extrémités essaient toutes les deux de travailler sur le même modèle. Ici . . . est un cas où les extrémités du gabarit sont très proches les unes des autres
01:16:28.17 et elle a donc commencé à écarter les extrémités de plus en plus en ajoutant plus de séquences d'ADN
01:16:33.19 entre les séquences LE et U2 et a demandé comment cela affecterait-il la façon dont ces cellules se répareraient ?
01:16:41.05 La première chose qu'elle a découvert était que la viabilité continuait de baisser
01:16:45.14 vers le niveau que nous voyons avec la réplication induite par la rupture alors que ces séquences devenaient de plus en plus éloignées et la deuxième chose
01:16:53.06 qu'elle a trouvé était que de plus en plus les résultats de cette réparation étaient que les séquences
01:17:00.28 ici qui sont marqués par la résistance à l'hygromycine sont perdus.
01:17:04.24 Ce sont les séquences que nous pouvons perdre et elles sont perdues parce que les cellules passent de plus en plus à la conversion génique
01:17:11.24 réparation vers la réplication induite par la rupture. Lorsque Suvi a ensuite examiné cela davantage en faisant de la cinétique en regardant quand était la nouvelle synthèse
01:17:22.24 commençant et encore c'est l'un de ces tests dans lesquels elle ne regarde pas l'achèvement du processus mais seulement quand voyez-vous le premier
01:17:31.06 50 nucléotides de nouvelle synthèse et donc il y a une amorce PCR dans ce petit espace, il y a une amorce PCR de l'autre côté de LE et une fois qu'ils
01:17:41.09 réunissez-vous, vous avez une invasion de brins et le début d'une nouvelle synthèse d'ADN, c'est ce qui est mesuré en bas.
01:17:47.18 Les résultats sont étonnamment frappants. . . même lorsqu'il y a un écart de 1,2 kb entre ces séquences, la cinétique de ce processus est assez rapide
01:18:01.21 et très complet, mais si vous éloignez les séquences, la cinétique change complètement. Ce n'est pas seulement que l'efficacité diminue,
01:18:11.03 ils sont lents à démarrer et ils ont une cinétique complètement différente qui suggère qu'ils ont changé de mécanisme.
01:18:18.11 Nous savons que ce processus cinétique lent est caractéristique de la réplication induite par la rupture et pour le montrer encore plus, Suvi a frappé
01:18:27.01 le gène Pol32 dans ces constructions et ce que vous voyez est au moment où vous atteignez 2,5 Ko
01:18:33.26 ou même 1.2ko, ces événements deviennent de plus en plus et puis finalement
01:18:40.13 complètement dépendant de Pol32 que nous considérons comme une indication qu'à ce stade, les cellules effectuent principalement une conversion génique à l'aide du SDSA
01:18:51.07 mais à mesure que l'écart entre ces extrémités s'agrandit, il y a une sorte de perte de compréhension
01:18:58.17 des deux extrémités l'une par rapport à l'autre et chaque extrémité commence alors à se comporter comme si c'était la seule extrémité et chaque extrémité commence à faire une réplication induite par la rupture
01:19:07.22 qui est un processus lent et dépendant de Pol32. Cela a conduit Suvi à l'idée qu'il existe quelque chose appelé un
01:19:16.27 Point de contrôle d'exécution de recombinaison, que la cellule dispose en fait d'un mécanisme pour décider si
01:19:23.17 ou non, les deux extrémités de l'invasion de brins se produisent toutes les deux sur le même
01:19:28.15 modèle assez rapproché, et je ne vous l'ai pas montré, dans le bon sens. Elle a en fait retourné certaines séquences
01:19:36.08 et a montré qu'ils pouvaient envahir mais ils pointaient dans le mauvais sens. La cellule ne sait pas que c'est approprié pour faire la conversion génique.
01:19:45.20 Lorsque les extrémités sont rapprochées et engagent le même gabarit, tout va relativement vite. Quand ils sont éloignés l'un de l'autre,
01:19:52.27 c'est comme si chaque extrémité était complètement indépendante. Il n'y a aucune communication entre les deux extrémités et la réparation passe par cet autre mécanisme.
01:20:02.11 Nous pensons que cela doit avoir quelque chose à voir avec la signalisation en raison de la façon dont vous agrandissez cette boucle d'invasion afin que le
01:20:11.08 l'autre extrémité peut être engagée à partir de la même structure mais nous ne l'avons pas prouvé à ce stade.
01:20:16.11 Pourquoi est-ce important ? Nous pensons que cela est important pour que la cellule évite certains
01:20:24.07 de ces réarrangements chromosomiques caractéristiques des cellules où de mauvaises choses se produisent.
01:20:30.22 L'idée serait que si vous faites une pause dans une séquence répétée, chacune de ces deux extrémités pourrait indépendamment aller chercher
01:20:40.09 pour un partenaire et si cette fin va à ce partenaire, mais cette fin va à ce partenaire, ils vont commencer à faire deux réplications induites par pause
01:20:50.01 événements qui conduiraient à beaucoup d'instabilité chromosomique et de réarrangements chromosomiques. La cellule a en effet intégré un poste de contrôle,
01:20:58.20 une manière de ralentir ce processus pour dire " êtes-vous sûr qu'il est impossible de faire une invasion pour que les deux extrémités soient sur le même
01:21:06.06 modèle sur lequel le reste de l'événement se déroule de manière relativement opportune ?" Ce point de contrôle de recombinaison est un moyen d'empêcher
01:21:15.07 une réplication induite par une pause lorsqu'il s'agit d'une mauvaise solution à un problème autrement soluble. Mais bien sûr, s'il n'y a pas de solution au problème,
01:21:24.08 faire une réplication induite par rupture est mieux que de ne rien faire et c'est ce que la cellule fait alors. C'est un peu un résumé de l'endroit où nous en sommes
01:21:35.00 termes de connaissance d'une cassure double brin spécifique et comment elle est réparée. Pauses faites par HO. Mais il y a beaucoup de questions,
01:21:42.27 dont certains sont illustrés ici. On ne comprend vraiment pas comment s'effectue la recherche par le filament Rad51. Ce qui se produit
01:21:50.23 à l'intérieur de ce petit filament pour faire cet échange de brins ? Comment s'alignent-ils correctement pour trouver ces séquences ? Par exemple, si le Rad51
01:22:01.20 filament lié à l'ADN et resté étroitement lié à l'ADN et juste scanné de haut en bas, il manquerait toutes les homologies qui étaient
01:22:08.09 dans l'orientation opposée. Il faut pouvoir monter, chercher, échouer, tomber, reprendre une autre orientation pour réessayer, et on ne sait rien
01:22:17.29 sur la façon dont ce processus se déroule réellement. Nous ne comprenons vraiment pas pourquoi cela prend autant de temps pour la machine de réplication
01:22:26.09 pour se rassembler aux points où la nouvelle synthèse d'ADN va avoir lieu. Dans la conversion génique, cela prend vingt minutes. Apparemment en pause induite
01:22:35.23 la réplication prend plusieurs heures et la question est "qu'est-ce qu'il fait pendant ce temps et pourquoi est-ce si lent ?" Nous ne connaissons vraiment pas le
01:22:43.07 réponse à cela. Nous ne comprenons pas encore du tout comment l'invasion de brins peut avoir lieu dans le contexte de nucléosomes positionnés mais évidemment
01:22:53.18 c'est le cas et encore plus mystérieux est de comprendre, une fois la réparation de l'ADN terminée, comment la chromatine est rétablie, comment sont les nucléosomes
01:23:03.28 remis aux endroits où la réparation de l'ADN a eu lieu ? C'est un autre de ces mystères que nous n'avons vraiment pas été en mesure de résoudre bien que
01:23:14.24 Je dirai que nous avons un article récent publié qui soutient que les chaperons de chromatine AsfI et CafI jouent un rôle important dans
01:23:25.09 rétablir cette chromatine mais les détails que nous ne connaissons pas. Ensuite, il y a la question de savoir si la réplication ne nécessite pas les hélicases MCM,
01:23:35.23 comment l'ADN est-il ouvert pour réparation ? Il doit y avoir un autre hélicase mais nous ne savons pas ce que c'est. Et enfin, si tout
01:23:45.09 cela se produit pendant que la cellule envoie des alarmes et dit "il y a des dommages ici" et empêche les cellules de suivre le cycle cellulaire
01:23:54.02 ce qui est le cas, comment cette signalisation est-elle désactivée à la fin du processus afin que les cellules puissent reprendre la progression du cycle cellulaire
01:24:02.10 et nous savons qu'il ne suffit pas d'avoir des morceaux d'ADN complets. Il y a un vrai mécanisme qui désactive les dommages à l'ADN
01:24:12.01 checkpoint mais ce sera le sujet d'une autre conférence et cette conférence, je pense, est terminée. Merci beaucoup.

  • Partie 1 : Mécanismes de réparation de l'ADN par recombinaison

Quels événements ont précédé l'expérience ?

Vous pouvez également entendre Matt Meselson décrire l'expérience Meselson-Stahl dans la vidéo 1.

Vidéo 1 Matt Meselson décrit son expérience avec Frank Stahl sur la réplication de l'ADN.

Le matériel génétique des cellules eucaryotes est organisé sous la forme de chromosomes, chacun étant une seule molécule d'ADN linéaire à double brin (Figure 1). La plupart des procaryotes (bactéries) ont un seul chromosome circulaire (Figure 1). Toutes les formes de vie doivent répliquer leur ADN et, à l'exception des recombinaisons et des mutations peu fréquentes, transmettre des copies identiques de leur matériel génétique à leur descendance. (Voir aussi la vidéo du tableau blanc sur le suivi de votre ADN.)

Figure 1 Organisation de l'ADN sous forme de longs chromosomes linéaires ou circulaires chez les eucaryotes et les procaryotes, respectivement.

Sur la base de leur modèle pour la structure de l'ADN, Watson et Crick ont ​​proposé que l'ADN se réplique d'une manière "semi-conservatrice" (Figure 2). Dans ce modèle, les deux brins de la double hélice d'ADN se déroulent et se séparent, et chaque brin "parent" sert de matrice pour la synthèse d'un nouveau brin "fille". L'appariement de bases Watson-Crick (voir le Narrative on DNA Structure by Vale ) de l'adénine avec la thymine et de la guanine avec la cytosine garantit que, à l'exception de rares erreurs de copie, mutations, l'information de la molécule d'ADN double brin d'origine est préservée pendant la synthèse des brins filles. Dans le modèle semi-conservateur, chaque cellule fille de la première génération hériterait d'un des brins d'ADN d'origine du parent et d'un brin d'ADN récemment synthétisé. Dans la deuxième génération, deux des petites-filles seraient composées de tout l'ADN nouvellement synthétisé et deux petites-filles auraient un ADN hybride (un brin parental et un brin nouvellement synthétisé).

Figure 2 Le modèle semi-conservateur pour la réplication de l'ADN.

Alors que (alerte spoiler) le modèle semi-conservateur s'est avéré correct, c'était loin d'être gagné d'avance. Avant notre expérience, plusieurs scientifiques de premier plan ont remis en question le modèle semi-conservateur (voir Dig Deeper 1 pour plus d'informations sur leurs réserves) et ont proposé des modèles alternatifs discutés ci-dessous.

Question de l'explorateur : selon vous, quels sont les avantages et les inconvénients de ce modèle ?

Réponse : La beauté de ce modèle est qu'il fournit une explication claire de la façon dont un brin fille est fabriqué à partir du brin modèle (Figure 3). Cependant, le modèle nécessite que les deux longs brins d'ADN parentaux se déroulent pour devenir des matrices monocaténaires. Cela a été considéré comme une faiblesse par de nombreux scientifiques à l'époque (voir Dig Deeper 1 pour plus d'informations).

Figure 3 Un modèle pour la réplication de l'ADN proposé par Watson et Crick. Le déroulement de l'ADN crée des modèles simple brin (violet) et de nouveaux peuplements (sarcelle) peuvent être créés à partir des modèles grâce à l'appariement de bases Watson-Crick.

Le déroulement de l'hélice d'ADN et l'empêchement des fils et des fils parentaux de s'emmêler ont posé des problèmes au modèle semi-conservateur dans l'esprit de nombreux scientifiques. En conséquence, d'autres modèles de réplication de l'ADN ont été imaginés. L'un était un modèle de « réplication conservatrice » (Figure 4). Dans ce modèle, la double hélice parentale forme un modèle pour une toute nouvelle double hélice. Les deux brins d'origine restent ensemble, aucun déroulement ne se produit et l'ADN fille est formé à partir d'ADN nouvellement synthétisé. Dans ce modèle, dans la première génération, un ADN fille hériterait de la double hélice d'ADN d'origine de l'ADN parent et l'autre ADN fille hériterait de la double hélice d'ADN nouvellement synthétisée. Dans la deuxième génération, l'une des quatre petites-filles aurait l'ADN parental d'origine et les trois autres petites-filles seraient toutes composées d'ADN nouvellement synthétisé. Alors que la réplication conservatrice était une possibilité logique, elle n'a été élaborée par aucun mécanisme spécifique.

Figure 4 Le modèle conservateur pour la réplication de l'ADN.

Question de l'explorateur : selon vous, quels sont les avantages et les inconvénients de ce modèle ?

Réponse : Ce modèle n'appelait pas au déroulement des brins d'ADN, comme dans le modèle semi-conservateur, résolvant ainsi le problème du déroulement de l'ADN. Cependant, il n'était pas clair comment la machine à copier lirait les informations sur la séquence nucléotidique enfouies dans le noyau de la double hélice d'ADN.

Une troisième possibilité était un modèle proposé par Max Delbrück (appelé plus tard "Dispersive Replication") ( Figure 5 ). Delbrück doutait que les deux brins de la double hélice puissent être déroulés ou séparés pour subir une réplication semi-conservatrice et a plutôt suggéré que les brins d'ADN se cassaient à chaque demi-tour de l'hélice pendant la réplication (discuté plus en profondeur ci-dessous et dans Dig Deeper 1 ). Selon le modèle de réplication dispersive de Delbrück, chaque hélice de l'ADN répliqué consiste en une alternance d'ADN parental et d'ADN fille. Contrairement aux deux autres modèles, la descendance des générations suivantes serait indiscernable en ce qui concerne leurs compositions d'ADN parental et nouvellement synthétisé.

Figure 5 Le modèle dispersif pour la réplication de l'ADN. Après un cycle de réplication de l'ADN, chaque brin est un hybride d'ADN ancien et nouvellement synthétisé. Voir aussi Creuser plus profondément 1 .

Question de l'explorateur : Quels sont selon vous les avantages et les inconvénients de ce modèle ?

Réponse : La fragmentation créerait des modèles plus courts pour la réplication, ce qui minimiserait les problèmes de déroulement ou de démêlage rencontrés par une très longue molécule d'ADN. Cependant, le réassemblage des fragments à nouveau dans le chromosome intact pourrait être problématique, surtout si les cassures se produisent à chaque demi-tour de l'hélice.

Question de l'explorateur : dans la première génération, quel(s) modèle(s) prédisent que les deux cellules filles recevront des quantités approximativement égales de l'ADN d'origine et de l'ADN nouvellement synthétisé ?

Réponse : Le modèle semi-conservateur et le modèle dispersif. Cependant, des différences dans la composition des filles apparaissent dans la deuxième génération dans les deux modèles.

Matt et Frank ont ​​découvert les modèles de réplication de l'ADN avant leur première rencontre au cours de physiologie du laboratoire de biologie marine dans les circonstances décrites ci-dessous.

En 1953, alors que j'étais étudiant diplômé du grand chimiste Linus Pauling, je suis allé voir Max Delbrück, physicien et fondateur du "groupe des phages" qui s'était profondément intéressé à la génétique et aux fondements de la vie (Max Delbrück, et son travail avec Salvador Luria, est présenté dans le Narrative on Mutations de Koshland). Je voulais savoir quels problèmes de biologie il considérait comme les plus importants et quels conseils il pourrait me donner pour me lancer dans la biologie. Presque aussitôt que je me suis assis dans son bureau, il m'a demandé ce que je pensais des deux articles de Watson et Crick qui avaient été publiés dans Nature plus tôt cette année-là. J'ai avoué que je n'en avais jamais entendu parler.

Exaspéré, Delbrück m'a lancé un petit tas de réimpressions des papiers Watson-Crick et m'a crié « Sortez et ne revenez pas avant de les avoir lus ». Ce que j'ai entendu, c'est "reviens". C'est ce que j'ai fait, mais seulement après avoir lu les journaux.

Quand je suis revenu, Delbrück a dit qu'il ne croyait pas au mécanisme semi-conservateur de réplication de l'ADN proposé par Watson et Crick. Max avait imaginé que si la réplication est semi-conservatrice, les deux duplex filles s'enrouleraient l'un autour de l'autre au fur et à mesure que les deux chaînes de la molécule mère se dérouleraient. Pour contourner le problème supposé du démêlage des molécules filles, il a proposé un modèle dans lequel des ruptures sont faites pour éviter l'emboîtement lors de la séparation, puis réunies (voir Figure DD1 dans Dig Deeper 1 ). Ce mécanisme nécessitait la rotation de seulement de courtes longueurs d'ADN duplex, après quoi les chaînes seraient réunies. Dans le processus de ralliement, des sections de la nouvelle chaîne seraient fusionnées avec des sections de l'ancienne chaîne, faisant des quatre chaînes des mosaïques d'ADN nouveau et ancien. Delbrück, en 1954, a publié un article qui remettait en question le modèle Watson-Crick et a présenté ce nouveau modèle (appelé plus tard « réplication dispersive » comme le montre la figure 5 et Dig Deeper 1 ). À certains égards, l'idée de Delbrück était en avance sur son temps. Les cassures transitoires sont maintenant connues pour être faites par une enzyme appelée topoisomérase, mais d'une manière qui laisse les chaînes individuelles du duplex parent intactes (voir Dig Deeper 1 ).

En plus des réserves et du modèle de Max, plusieurs autres scientifiques ont également posé leurs propres préoccupations et solutions au "problème de déroulement" ou des alternatives à la structure de l'ADN Watson-Crick elle-même (voir Dig Deeper 1 ).

Ce que j'ai compris de mes conversations avec Max et d'autres, c'est que tout le monde ne croyait pas au modèle de réplication de l'ADN de Watson et Crick. Ce n'était qu'une hypothèse sans aucune preuve expérimentale pour la soutenir. La clé pour résoudre ce problème était de suivre l'ADN parental dans la descendance. Mais comment?

Je travaillais sur quelque chose de très différent pour ma thèse de doctorat avec Linus Pauling, mais plus tôt cette année-là, j'ai eu l'idée de marquer des molécules de protéines avec du deutérium, un isotope lourd (2H) d'hydrogène (1H) et de les séparer des molécules de protéines non marquées dans une centrifugeuse en fonction de leur densité comme moyen de résoudre un problème tout à fait différent (voir Dig Deeper 2 ). Après cette deuxième rencontre avec Max, il m'est venu à l'esprit que le marquage de densité et la séparation centrifuge pourraient être utilisés pour résoudre le problème de réplication de l'ADN. Quand j'ai dit cela à Pauling, il m'a exhorté à faire d'abord ma cristallographie aux rayons X. Et quand j'ai proposé l'approche densité à Watson, un de ces soirs d'attente pour dîner à l'Athenaeum, il m'a dit que je devrais aller en Suède pour le faire – où l'ultracentrifugeuse avait été inventée (ce que je n'ai jamais fait).

Mon point d'entrée dans la réflexion sur la réplication de l'ADN est venu lorsque j'essayais de comprendre comment les bactériophages (virus qui infectent les bactéries) échangeaient des morceaux d'ADN entre eux. Ce processus d'échange d'ADN entre les chromosomes est appelé recombinaison (voir la vidéo du tableau blanc sur les expériences de Morgan et Sturtevant). Quand ce processus de recombinaison s'est-il produit ? Cela s'est-il produit lorsque l'ADN se réplique? Ou peut-être que la recombinaison était un événement qui a stimulé la réplication de l'ADN ? Mon intuition était que les processus de recombinaison et de réplication étaient en quelque sorte liés. Cependant, on en savait peu sur les mécanismes de la réplication ou de la recombinaison de l'ADN à l'époque. De plus, je ne savais pas comment poursuivre ces questions en 1954. Mes idées d'expériences étaient boiteuses et auraient conduit à des données non interprétables.

Comme beaucoup de questions intéressantes en biologie, il faut souvent être patient jusqu'à ce que la bonne idée ou la bonne technologie émerge qui permette d'y répondre correctement. En 1954, ma prise de conscience d'un lien possible entre la réplication et la recombinaison a suscité mon intérêt pour la première conversation sur le gin tonic avec Matt. Cependant, il a fallu plusieurs décennies avant que je sois sûr que, dans le bactériophage, la réplication et la recombinaison de l'ADN, dans une large mesure, dépendaient l'une de l'autre. Les expériences convaincantes étaient basées sur des variantes d'une technique mise au point par Matt et Jean Weigle à Caltech. Dans cette méthode, les phages parentaux marqués par densité et génétiquement marqués infectent les mêmes bactéries. Les densités et la constitution génétique des phages descendants sont déterminées par un essai biologique des gouttes individuelles recueillies à partir d'un gradient de densité.


PHAGES DE TYPE T4 (MYOVIRIDAE)

Réplication et recombinaison de l'ADN In Vivo

La réplication et la recombinaison de l'ADN sont étroitement imbriquées, suivant plusieurs voies redondantes différentes. Les phages T-even ont fourni la première et la plus convaincante preuve de la réplication de l'ADN dépendante de la recombinaison. Des modes alternatifs redondants de réplication et de recombinaison garantissent que les deux processus fonctionnent dans de nombreuses conditions différentes et à différents stades de développement. Les interrelations connues sont représentées schématiquement sur la figure 3 .

Le(s) premier(s) cycle(s) de réplication de l'ADN sont initiés à partir d'une ou plusieurs origines potentielles. En raison de la permutation circulaire des extrémités chromosomiques (Fig. 3e), dans chaque chromosome individuel, toute origine est située à différentes distances des extrémités. Dans la plupart des chromosomes, une seule origine est utilisée, peut-être en raison de l'abondance limitée des composants réplisomes. Différentes origines partagent l'exigence de transcription à partir de promoteurs précoces ou intermédiaires, générant de grands transcrits qui peuvent servir d'amorces pour diriger la synthèse d'ADN de brin sur l'un des nombreux sites situés à environ 1 kb en aval du promoteur. Cependant, chacune des quatre origines qui ont été étudiées de près a une séquence et une structure globale différentes, vraisemblablement liées à l'utilisation préférée dans différentes conditions. Trois origines (UN F et g) nécessitent une transcription à partir des promoteurs intermédiaires, oriE dépend d'un promoteur précoce. La figure 3f représente l'initiation à partir d'une origine générique arbitraire.

Le passage de ?? 70 -transcription pré-réplicative dépendante en T4 ?? La transcription tardive dépendante de gp55 inhibe l'initiation à partir de ces origines, soit par défaut (parce que l'ARN polymérase ne reconnaît plus les promoteurs d'origine), soit parce que la ou les protéines tardives, par ex. La protéine UvsW empêche activement les transcrits de servir d'amorces pour la synthèse de l'ADN, ou pour les deux raisons.

La réplication ultérieure de l'ADN est initiée à partir d'intermédiaires de recombinaison homologue (figure 3g, i). Les intermédiaires de recombinaison sont principalement formés par invasion d'une extrémité simple brin dans la région homologue d'une autre molécule (ou à l'autre extrémité de la même molécule). Lorsque les chromosomes T4 sont brisés par des dommages causés par les radiations ou par certaines nucléases, les terminaisons simple brin des cassures internes peuvent initier une recombinaison de la même manière que les extrémités naturelles des chromosomes infectants. C'est l'une des principales raisons des effets recombinogènes des dommages causés par les radiations.

Les intermédiaires de recombinaison peuvent initier la réplication à partir des extrémités 3' du brin simple envahissant (recombinaison joint-copie, Fig. 3g ), ou, après une coupe endonucléolytique à la jonction d'une extrémité 3' dans le brin envahi (joint-coupe- recombinaison de copie, Fig. 3i). Le mode jointure-copie peut démarrer dès qu'un point de croissance a atteint sa fin. Le mode jointure-coupe-copie nécessite une coupe endonucléolytique supplémentaire, qui dépend probablement d'une ou plusieurs protéines tardives, et donc survient plus tardivement. Ce mode peut contourner l'exigence de primase ou de topoisomérase dans la réplication de l'ADN T4 et peut être utilisé lorsque ces enzymes sont limitantes, par ex. tard dans l'infection. En fin de compte, les réitérations de ces processus génèrent un réseau concatémère hautement ramifié dans lequel aucun chromosome individuel ne peut être distingué.

Bien entendu, toutes les jonctions de recombinaison n'ont pas besoin d'être converties en fourches de réplication. Une certaine recombinaison T4 peut se produire, quoique avec retard, lorsque la réplication de l'ADN est inhibée. Les micrographies électroniques de ces intermédiaires d'ADN T4 ont fourni la première preuve convaincante de l'importance de la migration des branches dans la recombinaison homologue. Dans ces conditions, aucune descendance viable n'est produite, car aucun concatémère pouvant être conditionné n'est formé, il y a peu ou pas de transcription tardive et il n'y a pas de têtes à remplir.


Top 5 des applications de la technologie de l'ADN recombinant en médecine

Cet article met en lumière les cinq principales applications de la technologie de l'ADN recombinant en médecine.

Les cinq principales applications sont : (1) le diagnostic des maladies génétiques (2) le typage de l'ADN (empreintes digitales de l'ADN) (3) la thérapie génique (4) la technologie de l'ADN recombinant dans la synthèse de l'insuline humaine et (5) le vaccin contre l'hépatite B.

Application # 1. Diagnostic des maladies génétiques :

La plupart d'entre nous ne subissent aucun effet nocif de nos gènes défectueux car nous portons deux copies de presque tous les gènes, l'un dérivé de notre mère et l'autre de notre père. Les seules exceptions à cette règle sont les gènes trouvés sur les chromosomes sexuels masculins. Les mâles ont un chromosome X et un chromosome Y, le premier de la mère et le second du père, de sorte que chaque cellule n'a qu'une seule copie des gènes sur ces chromosomes.

Dans la majorité des cas, un seul gène normal suffit pour éviter tous les symptômes de la maladie. Si le gène potentiellement nocif est récessif, alors son homologue normal effectuera toutes les tâches assignées aux deux. Ce n'est que si nous héritons des deux copies du même gène récessif de nos parents que nous développerons une maladie. En revanche, si le gène est dominant, lui seul peut produire la maladie, même si son homologue est normal. Il est clair que seuls les enfants d'un parent atteint de la maladie peuvent être touchés, et alors en moyenne seulement la moitié des enfants seront touchés.

La chorée de Huntington, une maladie grave du système nerveux, qui ne devient apparente qu'à l'âge adulte, est un exemple de maladie génétique dominante. Enfin, il y a les maladies génétiques liées au chromosome X. Comme les hommes n'ont qu'une seule copie des gènes de ce chromosome, il n'y en a pas d'autres disponibles pour remplir la fonction du gène défectueux. Des exemples de telles maladies sont la dystrophie musculaire de Duchenne et, peut-être la plus connue de toutes, l'hémophilie.

La reine Victoria était porteuse du gène défectueux responsable de l'hémophilie et, par son intermédiaire, il a été transmis aux familles royales de Russie, d'Espagne et de Prusse. Les coupures et ecchymoses mineures, qui ne feraient que peu de mal à la plupart des gens, peuvent s'avérer mortelles pour les hémophiles, qui manquent des protéines (facteurs VIII et IX) impliquées dans la coagulation du sang, qui sont codées par les gènes défectueux. Malheureusement, avant que ces protéines ne soient disponibles par génie génétique, les hémophiles étaient traités avec des protéines isolées du sang humain.

Une partie de ce sang a été contaminée par le virus du sida et a eu des conséquences tragiques pour de nombreux hémophiles. L'utilisation de protéines génétiquement modifiées dans des applications thérapeutiques, plutôt que de produits sanguins, permettra d'éviter ces problèmes à l'avenir. Tous les gènes défectueux ne produisent pas nécessairement des effets néfastes, car l'environnement dans lequel le gène opère est également important. Un exemple classique de maladie génétique ayant un effet bénéfique sur la survie est illustré par la relation entre la drépanocytose et le paludisme. Seuls les individus possédant deux copies du gène de la drépanocytose, qui produit une protéine sanguine défectueuse, souffrent de la maladie.

Ceux qui ont un gène drépanocytaire et un gène normal ne sont pas affectés et, plus important encore, sont capables de résister à l'infection par les parasites du paludisme. L'avantage évident, dans ce cas, d'avoir un gène défectueux explique pourquoi ce gène est courant dans les populations des régions du monde où le paludisme est endémique. Le diagnostic de maladie héréditaire au niveau génétique permet à l'individu de déterminer s'il est à risque.L'analyse de l'ADN peut être utilisée pour l'identification des porteurs de troubles héréditaires, pour le diagnostic prénatal de maladies génétiques graves et pour un diagnostic précoce avant l'apparition des symptômes.

De nos jours, ces tests sont au niveau de l'ADN et sont définitifs pour déterminer l'existence de mutations génétiques spécifiques, contrairement aux tests génétiques précédents qui étaient basés sur des tests biochimiques qui déterminaient la présence ou l'absence d'un produit génique.

L'anémie falciforme:

L'anémie falciforme est une maladie génétique qui est le résultat d'un seul changement de nucléotide dans le codon des sixièmes acides aminés de la chaîne β de la molécule d'hémoglobine (de la valine à l'acide glutamique). Dans cette maladie, la forme des globules rouges devient irrégulière (en forme de faucille). Les effets biologiques de cette altération génétique sont une anémie sévère et des dommages progressifs au cœur, aux poumons, au cerveau, aux articulations et aux principaux systèmes organiques. L'anémie est causée par l'incapacité de l'hémoglobine mutée à transporter suffisamment d'oxygène.

L'espérance de vie des homozygotes S/S est assez courte. Les individus hétérozygotes A/S (porteurs génétiques) ont des globules rouges de forme normale et aucun symptôme à moins qu'ils ne soient soumis à des conditions extrêmes, où il y a un faible apport d'oxygène comme à haute altitude, ou des températures extrêmes. Si les deux parents sont hétérozygotes (A/S) alors 25% des enfants sont (S/S) homozygotes.

L'un des systèmes de test pour identifier les individus souffrant d'anémie falciforme est le suivant :

Il est connu que la modification d'un seul nucléotide dans le gène de la 0-globine provoque l'anémie falciforme. Dans la maladie, le site d'endonucléase de restriction Cvn I présent dans le gène est diminué (Fig. 19.1). Cette enzyme de restriction reconnaît la séquence CCTGAGG et clive l'ADN entre le C et le T. Dans le gène normal, la séquence d'ADN est CCTGAGG, Génotype alors que, dans le gène drépanocytaire, la séquence est de taille (pb) AA AS SS CCTGTGG. Cette différence constitue la base du test de diagnostic de l'ADN.

Après l'ajout de deux séquences d'amorces qui flanquent le site Cvnl, une petite quantité d'ADN échantillon peut être amplifiée par PCR. L'ADN amplifié est digéré avec CvnI, et les produits de clivage sont séparés par électrophorèse sur gel et visualisés par coloration au bromure d'éthidium de l'ADN dans le gel. Si le site Cvnl intact est présent, alors un ensemble spécifique de fragments d'ADN est observé et si le site Cvnl est absent, un profil différent de fragment d'ADN se produit. Par cette procédure, la constitution génétique d'une personne testée peut être déterminée (Fig. 19.2).

La procédure PCR/OLA:

Toutes les maladies génétiques ne produisent pas de défaut dans le site de restriction, elles n'ont donc pas pu être déterminées facilement comme dans le cas de la drépanocytose. Pour de telles maladies, d'autres stratégies sont nécessaires pour détecter le changement d'un seul nucléotide. L'une des procédures utilisées est la PCR combinée à un test de ligature d'oligonucléotides (OLA). Pour comprendre la procédure PCR/OLA, supposons que dans un gène normal à un site spécifique (disons 127e nucléotide) la paire de nucléotides est AT et dans la forme mutante la paire de nucléotides à ce site est G-C. Maintenant, deux oligonucléotides d'ADN sont synthétisés qui ont une longueur de 20 pb et leur séquence nucléotidique est complémentaire de l'ADN.

La première sonde (oligonucléotide) X a une longueur de 20 pb et est synthétisée de telle manière que ses séquences de nucléotides soient complémentaires du côté adjacent du 127e nucléotide, y compris le 127e nucléotide (c'est-à-dire que sa dernière base est à l'extrémité 3 & 8242, à la position 127). L'autre sonde Y commence à l'extrémité 5 & 8242 est à nouveau longue de 20 pb et ses nucléotides sont complémentaires de l'autre côté immédiatement adjacent du 127e nucléotide, l'excluant. Lorsque ces deux sondes sont hybridées avec un ADN cible (amplifié par PCR) ayant une séquence normale, le nucléotide à l'extrémité 3 & 8242 de la sonde X paires de bases avec le 127e nucléotide de l'ADN cible et la sonde Y est aligné de telle manière que son 5 & L'extrémité #8242 se trouve à côté de l'extrémité 3′ de la sonde X.

L'ajout d'ADN ligase à la réaction joint de manière covalente les sondes X et Y. Lorsque ces deux sondes sont hybridées avec un gène mutant dans lequel le nucléotide en position 127 est modifié en G-C. Le nucléotide à l'extrémité 3 & 8242 de la sonde X qui est ‘A’ ne correspond pas et n'est pas capable de s'apparier avec le 127e nucléotide dans la séquence d'ADN cible. La sonde Y est cependant parfaitement alignée. Dans ce cas, l'ADN ligase ne peut pas joindre la sonde X et la sonde Y en raison du désalignement d'un seul nucléotide.

Après cette procédure, les produits de ligature sont déterminés par l'utilisation de deux sondes indicatrices, la sonde X est marquée à son extrémité 5 à la biotine et la sonde Y est marquée à son extrémité 3 à la digoxigénine (indicateur de liaison aux anticorps). Ces molécules aident à identifier le produit ligaturé. L'échantillon dans lequel le produit de ligature est vu, cela signifie qu'il porte la séquence de gènes normale et l'échantillon dans lequel le produit de ligature n'est pas vu, ils ont la séquence de gène défectueuse.

Dans l'ensemble, le système PCR/OLA est rapide, sensible et hautement spécifique. Cette procédure est désormais également automatisée. La réaction en chaîne de la ligase est une variante moins sensible du système PCR/OLA. L'échantillon d'ADN est mélangé avec une quantité en excès d'une paire de sondes indicatrices OLA en présence d'ADN ligase thermorésistante. Après une réaction de ligature initiale à 65°C, la température est augmentée à 94°C pour dénaturer l'hybride sonde-ADN cible, puis abaissée à 65°C pour permettre l'hybridation des sondes indicatrices OLA non ligaturées libres à l'ADN cible.

Le cycle est répété 20 fois. Si les sondes indicatrices OLA correspondent parfaitement à l'ADN cible, la ligature se produira à 65 °C pendant chaque cycle et après 20 cycles, suffisamment de produits de ligature (c'est-à-dire la sonde X jointe à Y) s'accumuleront pour être observés par électrophorèse sur gel ou par ELISA. système de détection. Si aucune ligature ne se produit en raison d'un mésappariement, alors aucun produit de sonde joint ne sera produit ou détecté.

Génotypage avec des amorces PCR marquées par fluorescence:

Les amorces PCR marquées avec différents colorants fluorescents peuvent être utilisées dans le développement de systèmes de détection basés sur la couleur non radioactifs. Pour distinguer l'ADN mutant de l'ADN sauvage, la PCR est réalisée avec deux amorces différentes. L'un est exactement complémentaire de l'ADN de type sauvage et est marqué à son extrémité 5 avec de la rhodamine (rouge). L'autre est complémentaire de l'ADN mutant et est marqué à son extrémité 5 à la fluorescéine (vert).

Dans les deux cas, l'amplification est programmée avec une troisième amorce non marquée complémentaire du brin opposé. Étant donné que l'amplification par PCR ne peut avoir lieu que lorsque l'amorce est exactement complémentaire de l'ADN cible, la présence de ces trois amorces dans le même mélange réactionnel entraînera l'amplification soit de l'ADN de type sauvage, soit de l'ADN mutant, soit des deux, selon la cible. Les ADN sont initialement présents pour agir comme matrice PCR.

Si un individu est homozygote pour l'ADN de type sauvage, après PCR et élimination de l'amorce non incorporée, le mélange réactionnel deviendra rouge fluorescent si une personne est homozygote pour l'ADN mutant, le mélange réactionnel deviendra vert fluorescent et s'il a à la fois un mutant et un type sauvage ADN (hétérozygote). Le mélange réactionnel deviendra jaune fluorescent. Ce test peut être automatisé et peut être adapté pour n'importe quel site cible nucléotidique unique de n'importe quel gène qui a été séquencé.

Mutation à différents sites au sein d'un même gène:

Toutes les maladies génétiques ne sont pas dues à un seul changement de nucléotide spécifique dans un gène. Dans la plupart des cas, une variété de sites intragéniques différents peuvent muter, et chaque mutation peut provoquer la même forme de maladie génétique. Par exemple, la -thalassémie est une maladie génétique due à une perte d'activité de la -globine. Les hétérozygotes (porteurs) ont tendance à n'avoir qu'une forme légère d'anémie.

En revanche, les personnes homozygotes pour l'une des huit mutations possibles ou plus doivent recevoir des transfusions sanguines régulières et d'autres traitements pour survivre. Étant donné qu'une mutation sur l'un des huit sites différents ou plus au sein du gène de la -globine peut provoquer une -thalassémie, le test d'un changement sur un seul site nucléotidique particulier est insuffisant, au moins huit tests distincts sont nécessaires. Bien que cela soit faisable, cela coûte cher.

Par conséquent, une stratégie de PCR/hybridation qui utilise un système de test de réaction a été conçue pour cribler des sites de nucléotides mutants à différents emplacements dans un même gène. Un ensemble de sondes oligonucléotidiques spécifiques de séquence (chacune de 20 nucléotides de longueur) est synthétisé. Chaque oligonucléotide peut former une correspondance parfaite avec un segment du gène cible qui correspond au site d'une mutation connue.

Une queue d'homopolymère de thymidine [poly (dT)] d'environ 400 mucléotides de long est ajoutée à l'extrémité 3 & 8242 de chacune des sondes. La queue permet à l'ADN de la sonde d'être physiquement lié au reste du point discret allumé sur un filtre en nylon tout en garantissant que le reste de la sonde est accessible pour l'hybridation. Les segments de l'ADN de l'échantillon (test) qui s'étendent sur chacun des sites mutants possibles au sein du gène sont amplifiés simultanément par PCR.

Dans chaque cas, une de chacune des paires d'amorces est marquée à l'extrémité 5 & 8242 avec de la biotine. L'ADN cible amplifié est ensuite hybridé aux sondes liées au filtre dans des conditions qui ne permettent que des correspondances parfaites de s'hybrider.

La streptavidine avec la phosphatase alcaline attachée est ajoutée pendant la réaction d'hybridation. Après hybridation, le filtre est lavé et un substrat incolore est ajouté. Une tache colorée sur le filtre apparaît partout où il y a un nucléotide parfaitement apparié entre un segment d'ADN cible amplifié et l'une des sondes oligonucléotidiques spécifiques. Un filtre peut être repéré avec un certain nombre de sondes oligonucléotidiques spécifiques de séquence. Ainsi, avec un seul essai sur filtre, l'un d'un certain nombre de sites mutants différents peut être identifié.

Application # 2. Typage ADN (empreintes digitales ADN) :

1. Le typage ADN est une technique dans laquelle les échantillons biologiques aident à résoudre des problèmes médico-légaux. Cette technique est utilisée pour établir si la personne suspectée a commis un crime ou non.

2. Pour le typage ADN, des échantillons biologiques tels que le sang, la peau, le sperme ou les cheveux sont prélevés sur le lieu du crime. Une partie d'un échantillon est analysée pour confirmer qu'il y a une quantité suffisante d'ADN intact (non dégradé) pour la suite de l'analyse.

3. S'il y a une quantité suffisante d'ADN intact, il est digéré avec une enzyme de restriction, et les fragments sont séparés sur un gel d'agarose et transférés par transfert sur une membrane en nylon.

4. Cette membrane en nylon est ensuite hybridée séquentiellement avec quatre ou cinq sondes radiomarquées distinctes qui reconnaissent chacune une séquence d'ADN distincte. Après chaque réaction d'hybridation, les bandes où la sonde s'est liée au digéré. Les échantillons d'ADN sont visualisés par autoradiographie et le motif de bandes pour chaque échantillon est noté.

5. Avant l'utilisation de la sonde suivante, la première sonde est complètement retirée de la membrane. Étant donné que chaque étape d'hybridation et d'autoradiographie peut prendre jusqu'à 10 à 14 jours, l'ensemble du processus peut prendre plusieurs semaines et même plusieurs mois.

6. Un ensemble de sondes couramment utilisé pour ce type d'analyse est constitué d'ADN de mini-satellites humains. Ces séquences se produisent dans tout le génome humain et consistent en des séquences répétées en tandem. La longueur des répétitions va de 9 à 40 pb, et le nombre de répétitions dans les mini-satellites va d'environ 10 à 30. Les individus non apparentés ont généralement des longueurs de mini-satellites différentes.

Cependant, un enfant héritera d'une séquence d'ADN mini-satellite de sa mère et une de son père. Même les mêmes séquences d'ADN de mini-satellites peuvent avoir une longueur différente chez différents individus. Cette variabilité est due soit à un gain, soit à une perte de répétitions en tandem, probablement lors de la réplication de l'ADN. Ces changements n'ont aucun effet biologique car l'ADN du mini-satellite ne code pour aucune protéine.

7. Les séquences d'ADN des mini-satellites humains sont très variables, et la chance de trouver deux individus dans la population avec la même empreinte ADN est d'environ une sur 10 5 à 10 8 . Le motif de bandes d'ADN d'un individu basé sur des séquences d'ADN de mini-satellites est presque aussi unique que ses empreintes digitales.

8. En plus des applications médico-légales du typage ADN, cette technique peut être utilisée pour déterminer la paternité d'un enfant. Le motif de bandes d'empreintes génétiques de l'enfant doit être un composite des motifs de sa mère et de son père.

9. Dans le cas où la quantité d'échantillons médico-légaux collectés est bien moindre mais que l'ADN n'est pas dégradé, alors dans ce cas, il est possible d'amplifier de petites portions d'ADN de l'ADN du mini-satellite par PCR (Fig. 19.4).

Application # 3. Thérapie génique :

Une grande attention a été portée sur les maladies métaboliques dites génétiques dans lesquelles un gène défectueux provoque l'absence ou l'inefficacité d'une enzyme à catalyser efficacement une réaction métabolique particulière. Une approche potentielle pour le traitement des troubles génétiques chez l'homme est la thérapie génique. Il s'agit d'une technique par laquelle un gène fonctionnel remplace le gène absent ou défectueux, de sorte que le corps puisse fabriquer la bonne enzyme ou protéine et éliminer ainsi la cause première de la maladie.

Les candidats les plus probables pour les futurs essais de thérapie génique seront des maladies rares telles que le syndrome de Lesch-Nyhan, une maladie pénible dans laquelle les patients sont incapables de fabriquer une enzyme particulière. Cela conduit à une étrange impulsion à l'automutilation, y compris des morsures très sévères des lèvres et des doigts. La version normale du gène défectueux dans cette maladie a maintenant été clonée.

Si la thérapie génique devenait possible, le plus grand impact serait sur le traitement des maladies où le gène normal doit être introduit dans un seul organe. Une de ces maladies est la phénylcétonurie (PCU). La PCU affecte environ un enfant de race blanche sur 12 000 et, si elle n'est pas traitée tôt, elle peut entraîner un retard mental sévère. La maladie est causée par un défaut d'un gène produisant une enzyme hépatique. S'il est détecté assez tôt, l'enfant peut être soumis à un régime spécial pendant ses premières années, mais cela est très désagréable et peut entraîner de nombreux problèmes au sein de la famille.

Avant de pouvoir commencer le traitement d'une maladie génétique, un diagnostic précis de l'anomalie génétique doit être posé. C'est ici que la biotechnologie est également susceptible d'avoir un grand impact dans un proche avenir. La recherche en génie génétique a produit un outil puissant pour identifier des maladies spécifiques rapidement et avec précision. De courts morceaux d'ADN appelés sondes d'ADN peuvent être conçus pour coller très spécifiquement à certains autres morceaux d'ADN. La technique repose sur le fait que des morceaux d'ADN complémentaires se collent les uns aux autres.

Les sondes d'ADN sont plus spécifiques et ont le potentiel d'être plus sensibles que les méthodes de diagnostic conventionnelles, et il devrait être possible dans un proche avenir de faire la distinction entre les gènes défectueux et leurs homologues normaux, un développement important.

Le transfert d'ADN est généralement réalisé soit en mélangeant l'ADN avec une substance qui améliore son absorption, soit en l'encapsidant dans un virus désactivé (un virus qui peut transporter l'ADN dans une cellule mais ne peut pas provoquer de maladie). Retirer d'abord les cellules du patient, puis réintroduire celles qui ont été modifiées de manière appropriée, peut mener à la thérapie génique. Alternativement, l'introduction directe d'ADN dans le corps du patient peut être la seule stratégie efficace.

Il existe plusieurs types de thérapie génique :

1. Thérapie d'augmentation génique :

Ceci est approprié pour le traitement des troubles héréditaires causés par la perte d'un produit génique fonctionnel. L'objectif est d'ajouter une copie fonctionnelle du gène perdu dans le génome et de l'exprimer à des niveaux suffisants pour remplacer la protéine manquante. Il ne convient que si les effets pathogènes de la maladie sont réversibles.

2. Thérapie par inhibition génique :

Cela convient au traitement des maladies infectieuses, du cancer et des troubles héréditaires causés par une activité génétique inappropriée. Le but est d'introduire un gène dont le produit inhibe l'expression du gène pathogène ou interfère avec l'activité de son produit.

3. Mise à mort de cellules spécifiques :

Cela convient aux maladies telles que le cancer qui peuvent être guéries en éliminant certaines populations de cellules. Le but est d'exprimer au sein de telles cellules un gène suicide, dont le produit est toxique. Une approche est l'expression d'une enzyme qui convertit un promédicament inoffensif en une molécule hautement toxique. Un autre est l'expression d'une protéine qui rend les cellules vulnérables aux attaques du système immunitaire. Il est très important de s'assurer que les gènes suicides sont correctement ciblés, sinon la thérapie entraînerait une mort cellulaire généralisée.

4. Thérapie génique somatique et germinale :

Il existe une distinction importante entre la thérapie génique somatique (transfert d'ADN vers nos tissus corporels normaux) et la thérapie génique germinale (transfert d'ADN vers des cellules qui produisent des ovules ou du sperme). La distinction est que les résultats de toute thérapie génique somatique sont limités au patient réel et ne sont pas transmis à ses enfants.

Dans la plupart des études de thérapie génique, un gène « normal » est inséré dans le génome pour remplacer un gène pathogène « anormal ». Une molécule porteuse appelée vecteur doit être utilisée pour délivrer le gène thérapeutique aux cellules cibles du patient. Actuellement, le vecteur le plus courant est un virus qui a été génétiquement modifié pour porter de l'ADN humain normal.

Les virus ont développé un moyen d'encapsuler et de transmettre leurs gènes aux cellules humaines d'une manière pathogène. Les scientifiques ont essayé de tirer parti de cette capacité et de manipuler le génome du virus pour éliminer les gènes pathogènes et insérer des gènes thérapeutiques.

Les cellules cibles telles que les cellules hépatiques ou pulmonaires du patient sont infectées par le vecteur viral. Le vecteur décharge ensuite son matériel génétique contenant le gène humain thérapeutique dans la cellule cible. La génération d'un produit protéique fonctionnel à partir du gène thérapeutique restaure la cellule cible à un état normal.

Système de vecteur d'adénovirus :

Les adénovirus infectent une large gamme de cellules humaines ne se divisant pas et ont été largement utilisés comme vaccins vivants contre les infections respiratoires et la gastro-entérite sans effets secondaires. Ces caractéristiques font de l'adénovirus une perspective probable pour délivrer des gènes aux cellules cibles. Pour une utilisation en tant que vecteur pour la thérapie génique, une lignée cellulaire qui produit les produits du gène adénoviral E1, qui sont essentiels pour la réplication adénovirale, est co-transfectée avec deux parties du génome de l'adénovirus.

L'un de ces segments, maintenu dans Escherichia coli sous forme de plasmide, porte un gène thérapeutique à la place de la région E1 et est flanqué de séquences d'ADN d'adénovirus. La région E1 est située près de l'extrémité 5 & 8242 du génome de l'adénovirus. Le deuxième segment d'ADN transfecté est une molécule d'ADN d'adénovirus qui manque d'une partie de son extrémité 5 & 8242, y compris la région E1, mais partage une région d'ADN adénoviral avec le plasmide qui porte le gène thérapeutique.

Un événement de recombinaison dans la région de chevauchement entre les deux morceaux d'ADN transfectés reconstitue un génome d'adénovirus complet qui contient le gène thérapeutique et manque de la région E1. Les produits du gène E1 qui sont fournis par la cellule hôte initiant la production de virus, les particules virales sont assemblées puis libérées après la lyse cellulaire. La capacité de clonage d'ADN de ce système de vecteur adénoviral est d'environ 7,5 kb.

Si la recombinaison ne se produit pas, les deux molécules d'ADN transfectées sont trop petites pour être emballées correctement. De plus, une recombinaison entre la région d'ADN El dans le génome de la cellule hôte et l'ADN d'adénovirus recombinant pour former un virus compétent pour la réplication est extrêmement improbable.

Après infection d'une cellule cible avec un adénovirus recombinant, l'ADN est passé dans le noyau cellulaire, où le gène thérapeutique est exprimé. La construction d'ADN recombinant ne s'intègre pas dans un chromosome et, par conséquent, elle ne persiste pas pendant de longues périodes. Par conséquent, la thérapie génique à base d'adénovirus nécessite une administration périodique avec des virus recombinants supplémentaires. Des systèmes de délivrance de gènes d'adénovirus ont été utilisés dans des essais de thérapie génique pour le traitement de la mucoviscidose.

Système de vecteur de virus adéno-associé :

Le virus adéno-associé est un petit virus à ADN humain simple brin, non pathogène (4,7 kb) qui peut s'intégrer dans un site spécifique sur le chromosome 19. L'infection productive par un virus adéno-associé dépend des protéines d'un autre virus (virus auxiliaire) tel comme adénovirus, d'où le nom de virus adéno-associé. Une fois que le virus adéno-associé est entré dans le noyau, la polymérase d'une cellule hôte convertit le génome du virus adéno-associé en un ADN double brin qui est ensuite transcrit.

Son absence de pathogénicité fait du virus adéno-associé un bon candidat comme vecteur pour la délivrance de gènes thérapeutiques. Un virus adéno-associé recombinant est généré par cotransfection de deux plasmides dans une cellule hôte qui a été infectée par un adénovirus (virus auxiliaire). L'un des plasmides porte un gène thérapeutique flanqué des séquences répétées terminales inverses (

125 pb chacun) du virus adéno-associé. Le deuxième plasmide contient les deux gènes (rep et cap) du génome du virus adéno-associé qui sont respectivement responsables de la réplication du virus adéno-associé et de sa capside.

Après lyse des cellules hôtes infectées, des particules virales recombinantes adéno-associées sont purifiées à partir d'adénovirus par centrifugation et dialyse. Tout adénovirus résiduel (virus auxiliaire) dans l'échantillon est tué par traitement thermique. En l'absence du gène rep, il est peu probable que l'ADN du virus adéno-associé recombinant s'intègre dans le chromosome 19. D'autre part, sans aucun gène viral adéno-associé, le vecteur recombinant n'évoquera pas de réponse immunitaire.

Outre les systèmes de délivrance de gènes à médiation virale, il existe plusieurs options non virales pour la délivrance de gènes. La méthode la plus simple est l'introduction directe d'ADN thérapeutique dans des cellules cibles. Cette approche est limitée dans son application car elle ne peut être utilisée qu'avec certains tissus et nécessite de grandes quantités d'ADN. Une autre approche non virale implique la création d'une sphère lipidique artificielle avec un noyau aqueux. Ce liposome, qui porte l'ADN thérapeutique, est capable de faire passer l'ADN à travers la membrane de la cellule cible.

L'ADN thérapeutique peut également pénétrer à l'intérieur des cellules cibles en liant chimiquement l'ADN à une molécule qui se liera à des récepteurs cellulaires spéciaux. Une fois liés à ces récepteurs, les constructions d'ADN thérapeutiques sont englouties par la membrane cellulaire et passées à l'intérieur de la cellule cible. Ce système de livraison a tendance à être moins efficace que les autres options.

Les chercheurs expérimentent également l'introduction d'un 47e chromosome (humain artificiel) dans des cellules cibles. Ce chromosome existerait de manière autonome aux côtés du standard 46 sans affecter leur fonctionnement ni provoquer de mutations.

Ce serait un grand vecteur capable de transporter des quantités substantielles de code génétique, et les scientifiques prévoient qu'en raison de sa construction et de son autonomie, le système immunitaire du corps ne l'attaquerait pas. Un problème avec cette méthode potentielle est la difficulté de délivrer une si grosse molécule au noyau d'une cellule cible.

État actuel de la recherche en thérapie génique :

La thérapie génique est « l'utilisation des gènes comme médicament ». Elle implique le transfert d'un gène thérapeutique ou correct dans des cellules spécifiques d'un individu afin de réparer un gène défectueux. Ainsi, il peut être utilisé pour remplacer un gène défectueux, ou pour introduire un nouveau gène dont la fonction est de guérir ou de modifier favorablement l'évolution clinique d'une maladie.

La portée de cette nouvelle approche du traitement de la maladie est large, avec un potentiel dans le traitement de nombreuses affections génétiques, de certaines formes de cancer et de certaines infections virales telles que le syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA). À l'heure actuelle cependant, la thérapie génique reste une discipline expérimentale et de nombreuses recherches restent à faire avant que cette approche du traitement de la maladie n'atteigne son plein potentiel.

Il existe plus de 600 essais cliniques de thérapie génique initiés ou approuvés dans le monde. Parmi ceux-ci, les majorités sont menées aux États-Unis et en Europe, avec seulement un nombre modeste initié dans d'autres pays, dont l'Australie. De manière peut-être surprenante, la majorité des essais se concentre sur le traitement de maladies acquises, telles que le cancer et le sida, bien qu'un nombre croissant de maladies héréditaires soient ciblés.

Une forme de déficit immunitaire appelé déficit en adénosine désaminase (ADA) a été la première maladie à être traitée avec une approche de thérapie génique chez l'homme au début des années 1990, et a également été la première condition pour laquelle le transfert de gène thérapeutique dans les cellules souches a été tenté. dans le domaine clinique.

Une autre forme de déficit immunitaire est due à une mutation dans un gène situé sur le chromosome X et est appelée déficit immunitaire combiné sévère (SCID). Cette "affection liée à X" n'affecte que les garçons. L'utilisation de la thérapie génique dans le traitement de cette condition a été lancée par un groupe de recherche français Cavazzana-Calvo et ses collègues (2000). Il a été salué comme le premier exemple d'une maladie génétique traitée avec succès par thérapie génique et constitue une étape importante dans l'histoire médicale.

La Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis n'a encore approuvé aucun produit de thérapie génique humaine à la vente. La thérapie génique actuelle est expérimentale et ne s'est pas avérée très efficace dans les essais cliniques. Peu de progrès ont été réalisés depuis le début du premier essai clinique de thérapie génique en 1990.

En 1999, la thérapie génique a subi un revers majeur avec la mort de lesse Gelsinger lesse, 18 ans, qui participait à un essai de thérapie génique pour le déficit en ornithine trans-carboxylase (OTCD). Il est décédé de défaillances d'organes multiples 4 jours après le début du traitement. On pense que sa mort a été déclenchée par une réponse immunitaire sévère au porteur de l'adénovirus.

Les recherches les plus actives menées en thérapie génique pour les enfants ont porté sur des troubles génétiques tels que la fibrose kystique. D'autres essais de thérapie génique concernent des enfants atteints de déficits immunitaires sévères, tels que le déficit en adénosine désaminase (ADA) (une maladie génétique rare qui rend les enfants sujets à une infection grave) et ceux atteints d'hypercholestérolémie familiale (taux extrêmement élevés de cholestérol sérique).

Les progrès dans la compréhension et la manipulation des gènes ont ouvert la voie aux scientifiques pour modifier le matériel génétique d'une personne pour combattre ou prévenir la maladie. La thérapie génique est un traitement expérimental qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN ou ARN) dans les cellules d'une personne pour lutter contre la maladie. La thérapie génique est étudiée dans le cadre d'essais cliniques (études de recherche avec des personnes) pour de nombreux types de cancer et pour d'autres maladies. Il n'est actuellement pas disponible en dehors d'un essai clinique.

Les chercheurs étudient plusieurs façons de traiter le cancer à l'aide de la thérapie génique. Certaines approches ciblent les cellules saines pour améliorer leur capacité à lutter contre le cancer. D'autres approches ciblent les cellules cancéreuses, pour les détruire ou empêcher leur croissance.

Certaines techniques de thérapie génique à l'étude sont décrites ci-dessous :

1. Dans une approche, les chercheurs remplacent les gènes manquants ou modifiés par des gènes sains. Étant donné que certains gènes manquants ou modifiés (par exemple, p53) peuvent provoquer le cancer, la substitution de copies « de travail » de ces gènes peut être utilisée pour traiter le cancer.

2. Les chercheurs étudient également des moyens d'améliorer la réponse immunitaire d'un patient au cancer. Dans cette approche, la thérapie génique est utilisée pour stimuler la capacité naturelle du corps à attaquer les cellules cancéreuses. Dans une méthode à l'étude, les chercheurs prélèvent un petit échantillon de sang d'un patient et insèrent des gènes qui amèneront chaque cellule à produire une protéine appelée récepteur des cellules T (TCR).

Les gènes sont transférés dans les globules blancs du patient (appelés lymphocytes T) et sont ensuite rendus au patient. Dans le corps, les globules blancs produisent des TCR, qui se fixent à la surface externe des globules blancs.

Les TCR reconnaissent et s'attachent alors à certaines molécules présentes à la surface des cellules tumorales. Enfin, les TCR activent les globules blancs pour attaquer et tuer les cellules tumorales.

3. Les scientifiques étudient l'insertion de gènes dans les cellules cancéreuses pour les rendre plus sensibles à la chimiothérapie, à la radiothérapie ou à d'autres traitements. Dans d'autres études, les chercheurs prélèvent du corps des cellules souches hématopoïétiques saines, insèrent un gène qui rend ces cellules plus résistantes aux effets secondaires de fortes doses de médicaments anticancéreux, puis réinjectent les cellules dans le patient.

4. Dans une autre approche, les chercheurs introduisent des «gènes suicidaires» dans les cellules cancéreuses d'un patient. Un pro-médicament (une forme inactive d'un médicament toxique) est ensuite administré au patient. Le pro-médicament est activé dans les cellules cancéreuses contenant ces « gènes suicides », ce qui conduit à la destruction de ces cellules cancéreuses.

5. D'autres recherches portent sur l'utilisation de la thérapie génique pour empêcher les cellules cancéreuses de développer de nouveaux vaisseaux sanguins (angiogenèse).

Certains des développements récents dans la recherche en thérapie génique comprennent :

1. L'équipe de recherche de l'Université de Californie, Los Angeles, introduit des gènes dans le cerveau à l'aide de liposomes enrobés d'un polymère appelé polyéthylène glycol (PEG). Le transfert de gènes dans le cerveau est une réalisation importante car les vecteurs viraux sont trop gros pour franchir la « barrière hémato-encéphalique ». Cette méthode a le potentiel de traiter la maladie de Parkinson.

2. L'interférence ARN ou le silençage génique peut être une nouvelle façon de traiter les Huntington. De courts morceaux d'ARN double brin (ARN courts interférents ou ARNsi) sont utilisés par les cellules pour dégrader l'ARN d'une séquence particulière. Si un ARNsi est conçu pour correspondre à l'ARN copié à partir d'un gène défectueux, alors le produit protéique anormal de ce gène ne sera pas produit.

3. Une nouvelle approche de thérapie génique répare les erreurs dans l'ARN messager dérivé de gènes défectueux. La technique a le potentiel de traiter la thalassémie, un trouble sanguin, la mucoviscidose et certains cancers.

4. Des chercheurs de l'Université Case Western Reserve et de Copernicus Therapeutics sont capables de créer de minuscules liposomes de 25 nanomètres de diamètre qui peuvent transporter l'ADN thérapeutique à travers les pores de la membrane nucléaire.

5. La drépanocytose est traitée avec succès chez la souris.

Limites de la thérapie génique :

1. Nature éphémère de la thérapie génique :

Avant que la thérapie génique puisse devenir un remède permanent pour une maladie, l'ADN thérapeutique introduit dans les cellules cibles doit rester fonctionnel et les cellules contenant l'ADN thérapeutique doivent avoir une longue durée de vie et être stables. Les problèmes d'intégration de l'ADN thérapeutique dans le génome et la nature à division rapide de nombreuses cellules empêchent la thérapie génique d'obtenir des avantages à long terme. Les patients devront subir plusieurs cycles de thérapie génique.

Chaque fois qu'un objet étranger est introduit dans les tissus humains, le système immunitaire est conçu pour attaquer l'envahisseur. Le risque de stimuler le système immunitaire d'une manière qui réduit l'efficacité de la thérapie génique est toujours un risque potentiel. De plus, la réponse améliorée du système immunitaire aux envahisseurs rend difficile la répétition de la thérapie génique chez les patients.

3. Problèmes avec les vecteurs viraux :

Les virus, bien que porteurs de choix dans la plupart des études de thérapie génique, présentent une variété de problèmes potentiels pour la toxicité du patient, les réponses immunitaires et inflammatoires, et les problèmes de contrôle génique et de ciblage. De plus, on craint toujours que le vecteur viral, une fois à l'intérieur du patient, ne retrouve sa capacité à provoquer la maladie.

4. Troubles multigéniques :

Les affections ou troubles résultant de mutations dans un seul gène sont les meilleurs candidats à la thérapie génique. Malheureusement, certains des troubles les plus courants, tels que les maladies cardiaques, l'hypertension artérielle, la maladie d'Alzheimer, l'arthrite et le diabète, sont causés par les effets combinés de variations dans de nombreux gènes. Des troubles multigéniques ou multifactoriels tels que ceux-ci seraient particulièrement difficiles à traiter efficacement en utilisant la thérapie génique.

Considérations éthiques pour la thérapie génique :

Alors que le corps compte plusieurs milliards de cellules, seule une très faible proportion de ces cellules est impliquée dans la reproduction, le processus par lequel nos gènes sont transmis aux générations futures. Chez les mâles, ces cellules sont situées dans les testicules et chez les femelles, dans les ovaires. Ces cellules reproductrices spéciales sont appelées « cellules germinales ». Toutes les autres cellules du corps, qu'il s'agisse de cellules cérébrales, pulmonaires, cutanées ou osseuses, sont appelées « cellules somatiques ».

En thérapie génique, seules les cellules somatiques sont ciblées pour le traitement. Ainsi, toute modification des gènes d'une personne par thérapie génique n'aura d'impact que sur les cellules de son corps et ne pourra pas être transmise à ses enfants. Les modifications des cellules somatiques ne peuvent pas être transmises aux générations futures (hérité). La thérapie génique traite l'individu et n'a aucun impact sur les générations futures.

L'éventuelle manipulation génétique de l'ovule ou des spermatozoïdes (cellules germinales) reste l'objet d'intenses discussions éthiques et philosophiques. Le consensus actuel est que les risques de manipulation de la lignée germinale dépassent de loin tout avantage potentiel et ne devraient pas être tentés.

La thérapie génique comporte des risques et des limites. Les virus et autres agents utilisés pour délivrer les gènes « bons » peuvent affecter plus que les cellules auxquelles ils sont destinés. Si un gène est ajouté à l'ADN, il pourrait être placé au mauvais endroit, ce qui pourrait potentiellement causer le cancer ou d'autres dommages.

Les gènes peuvent également être surexprimés, ce qui signifie qu'ils peuvent entraîner la production d'une telle quantité de protéines qu'ils peuvent être nocifs. Un autre risque est qu'un virus introduit chez une personne puisse être transmis à d'autres personnes ou dans l'environnement.

Les essais de thérapie génique avec certains enfants posent une question éthique. Nous ne testons pas les enfants pour voir s'ils sont porteurs de maladies génétiques, car à ce stade, nous ne pouvons rien y faire. Si un enfant sait qu'il a un gène problématique, rien ne garantit qu'il en sera affecté, mais il doit vivre avec ce savoir pour le reste de sa vie. Par exemple, le gène de certains types de cancer du sein a été identifié. Mais si nous testons une jeune fille pour voir si elle est porteuse, que fera-t-elle de cette information ?

Les principales objections se résument ainsi :

(i) La technologie est imparfaite :

Les effets du transfert de gènes sont imprévisibles et, même si la maladie cible était guérie, d'autres défauts pourraient être introduits dans l'embryon.

(ii) Déni des droits de l'homme :

Les individus issus de la thérapie génique germinale n'auraient pas leur mot à dire sur la question de savoir si leur matériel génétique aurait dû être modifié.

La thérapie génique des lignées germinales pourrait être utilisée non seulement pour éliminer la maladie, mais également pour améliorer les caractéristiques favorables et supprimer les caractéristiques défavorables. À petite échelle, cela se traduirait par une génération d'enfants « designer » avec des traits choisis par leurs parents. À grande échelle, la thérapie génique pourrait entraîner une manipulation eugénique des propriétés génétiques d'une population.

Quelques questions à considérer par la société :

(i) Qu'est-ce qui est normal et qu'est-ce qu'un handicap ou un trouble, et qui décide ?

(ii) Le handicap est-il une maladie ? Faut-il les soigner ou les prévenir ?

(iii) La recherche d'un remède dégrade-t-elle la vie des personnes actuellement affectées par un handicap ?

(iv) La thérapie génique somatique (qui est effectuée dans les cellules adultes de personnes connues pour avoir la maladie) est-elle plus ou moins éthique que la thérapie génique germinale (qui est effectuée dans les ovules et les spermatozoïdes et empêche la transmission du trait? aux générations futures) ? En cas de thérapie génique somatique, la procédure peut devoir être répétée dans les générations futures.

(v) Les tentatives préliminaires de thérapie génique sont exorbitantes. Qui aura accès à ces thérapies ? Qui paiera pour leur utilisation ?

Application # 4. Technologie de l'ADN recombinant dans la synthèse de l'insuline humaine :

Depuis que Banting et Best ont découvert l'hormone, l'insuline en 1921, les patients diabétiques, dont les taux élevés de sucre sont dus à une altération de la production d'insuline, ont été traités avec de l'insuline dérivée des glandes pancréatiques d'animaux tués. L'hormone, produite et sécrétée par les cellules bêta des îlots pancréatiques de Langerhans, régule l'utilisation et le stockage des aliments, en particulier des glucides.

Bien que l'insuline bovine et porcine soient similaires à l'insuline humaine, leur composition est légèrement différente. Par conséquent, le système immunitaire d'un certain nombre de patients produit des anticorps contre lui, neutralisant ses actions et entraînant des réponses inflammatoires aux sites d'injection.

Ces facteurs ont conduit les chercheurs à envisager de synthétiser Humulin (forme courte de l'insuline humaine) en insérant le gène de l'insuline dans un vecteur approprié, la cellule bactérienne Escherichia coli (E. coli), pour produire une insuline chimiquement identique à son insuline produite naturellement (Fig. 19.5, 6). Ceci a été réalisé en utilisant la technologie de l'ADN recombinant. Cette méthode est une méthode plus fiable et durable que l'extraction et la purification du sous-produit des animaux abattus.

Chimiquement, l'insuline est une petite protéine simple. Il se compose de 51 acides aminés, dont 30 constituent une chaîne polypeptidique et dont 21 comprennent une deuxième chaîne. Les deux chaînes sont liées par une liaison disulfure. Le code génétique de l'insuline se trouve dans l'ADN au sommet du bras court du onzième chromosome.

Il contient 153 bases azotées (63 dans la chaîne A et 90 dans la chaîne B). Une souche affaiblie de la bactérie commune, E. coli, un habitant du tube digestif humain, est l'"usine" utilisée dans le génie génétique de l'insuline. Chez E. coli, la B-galactosidase est l'enzyme qui contrôle la transcription des gènes. Pour que les bactéries produisent de l'insuline, le gène de l'insuline doit être lié à cette enzyme.

Certains agriculteurs du centre-nord de Washington ont cultivé une plante de carthame génétiquement modifiée au cours des deux dernières années pour une société pharmaceutique biotechnique canadienne à la recherche d'un moyen moins cher de produire de l'insuline. Finalement, SemBioSys Genetics Inc. de Calgary, en Alberta, espère cultiver plusieurs milliers d'acres de carthame d'organisme génétiquement modifié. La société avait développé la capacité de produire de l'insuline à partir de graines de carthame OGM pour beaucoup moins d'argent que la méthode traditionnelle de production d'insuline synthétique par génie génétique de bactéries cultivées dans de grands bioréacteurs en acier.

L'entreprise pourrait réduire les coûts de production traditionnels jusqu'à 90 % et répondre à la demande mondiale d'insuline sur 10 000 à 20 000 acres de carthame OGM. SemBioSys espère avec ambition mettre l'insuline produite par le carthame sur le marché d'ici 2010.

Application # 5. Vaccin contre l'hépatite B :

L'hépatite B (HepB) est un problème majeur de santé publique dans le monde. Environ 30 % de la population mondiale, soit environ 2 milliards de personnes, présentent des signes sérologiques d'infection par le virus de l'hépatite B (HB V). Parmi ceux-ci, on estime que 350 millions sont atteints d'une infection chronique par le VHB et qu'au moins un million de personnes chroniquement infectées meurent chaque année d'un cancer du foie et d'une cirrhose.

Le VHB n'est surpassé que par le tabac en tant que cancérogène connu pour l'homme. Le vaccin HepB est efficace pour prévenir les infections par le VHB lorsqu'il est administré soit avant l'exposition, soit peu de temps après l'exposition. Au moins 85 à 90 % des décès associés au VHB sont évitables par la vaccination.

L'hépatite B est mortelle, tuant 900 000 personnes chaque année. Cette maladie est particulièrement dangereuse pour les nourrissons, car ceux qui sont infectés lorsqu'ils sont jeunes peuvent être porteurs de l'infection pour le reste de leur vie, souvent sans le savoir. Heureusement, le vaccin contre l'hépatite B, s'il est administré aux nourrissons, aide à les protéger contre ces problèmes. En effet, il s'agit du premier vaccin anticancéreux au monde.

En raison de la gravité de l'hépatite B et de la grande efficacité et innocuité du vaccin, l'Organisation mondiale de la santé (OMS) recommande qu'il soit administré à tous les enfants du monde entier. Le vaccin contre l'hépatite B est disponible depuis des décennies, mais son introduction dans les pays en développement n'a commencé qu'à la fin des années 1980. Actuellement, plus de 100 pays fournissent systématiquement le vaccin, mais beaucoup n'ont toujours pas les moyens de le faire.

Définition:

Le vaccin contre l'hépatite B (ADNr) est une préparation d'antigène de surface de l'hépatite B (AgHBs), un composant protéique du virus de l'hépatite B. L'antigène peut être adsorbé sur un support minéral tel que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium hydraté. L'antigène est obtenu par la technologie de l'ADN recombinant.

Le vaccin contre l'hépatite B (ADNr) est produit par l'expression du gène viral codant pour l'HBsAg dans des cellules de levure (Saccharomyces cerevisiae) ou de mammifères (cellules d'ovaire de hamster chinois (CHO) ou d'autres lignées cellulaires appropriées), la purification de l'HBsAg résultant et le rendu de cet antigène dans une préparation immunogène. L'adéquation et la sécurité des alvéoles sont approuvées par l'autorité compétente.

Le vaccin peut contenir le produit du gène S (protéine principale), une combinaison des produits du gène S et du gène pré-S2 (protéine du milieu) ou une combinaison du gène S, du gène pré-S2 et des produits du gène pré-S1. (grosse protéine).

L'antigène doit être conforme aux critères de qualité standard suivants : Valeur protéique totale, Teneur en antigène et identification par électrophorèse sur page ELISA et SDS, Pureté antigénique par réaction, Composition en termes de teneur en protéines, lipides, acides nucléiques et glucides, Cellule hôte et présence d'ADN dérivé du vecteur, teneur en césium (utilisé pour la pureté de l'antigène) et enfin stérilité.

Récemment, le transfert du gène de l'antigène de surface de l'hépatite B dans le tabac et l'expression de ce gène recombinant dans le tabac suivi d'une purification partielle de l'antigène protéique de la plante ont montré la possibilité de produire cet antigène à travers des plantes supérieures (Molecular Farming). Lorsque cette protéine a été injectée à des souris, elle a provoqué une réponse en anticorps similaire à celle obtenue avec un vaccin dérivé de levure disponible dans le commerce.

Il est clair que le produit génique obtenu à partir de deux organismes différents a la même propriété et que des plantes transgéniques peuvent être utilisées comme source d'anticorps. Des tentatives sont faites pour produire beaucoup plus de molécules par la culture de plantes supérieures transgéniques.


Informations sur l'auteur

Affiliations

Département de médecine, Division d'hématologie-oncologie et de l'Institut de recherche sur le cancer, Beth Israel Deaconess Medical Center et Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Ralph Scully, Arvind Panday, Rajula Elango et Nicholas A. Willis

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Contributions

R.S., A.P., R.E. et N.A.W. contribué à la recherche de l'article tous les auteurs ont contribué à la discussion du contenu R.S. et N.A.W. a écrit l'article tous les auteurs ont contribué à la révision et à l'édition de l'article avant sa soumission.

Auteurs correspondants


Chiffre d'affaires de l'ARN chez les eucaryotes : analyse des voies de désintégration de l'ARN spécialisées et de contrôle de la qualité

Ligang Wu , Joel G. Belasco , dans Methods in Enzymology , 2008

Méthode 1 : Transfection de cellules avec des plasmides codant pour un rapporteur et un miARN

Les méthodes optimales pour la culture cellulaire et la transfection peuvent être fortement dépendantes de la lignée cellulaire et doivent être déterminées empiriquement par l'investigateur. Pour obtenir des résultats cohérents, il est préférable de préparer l'ADN plasmidique pour la transfection en utilisant un kit plasmidique midi-prep ou maxi-prep (tel que le kit Qiagen HiSpeed ​​Plasmid Midi) plutôt qu'un kit mini-prep plasmide. Cotransfectez toujours le gène rapporteur de la luciférase avec un gène qui code pour un standard interne (tel que ??-galactosidase) et manque de miRE afin de permettre la normalisation des données.

Lors de l'utilisation de la transfection d'ADN pour examiner la régulation négative par les miARN, le niveau de production d'ARNm rapporteur et de miARN à partir des gènes transfectés est crucial, car ces ARN ne doivent pas être autorisés à saturer la machinerie cellulaire nécessaire au fonctionnement des miARN. De plus, la mesure dans laquelle l'expression du gène rapporteur est inhibée doit être limitée par la concentration cellulaire du miARN. Les conditions permettant de répondre à ces critères peuvent être identifiées empiriquement en titrant les quantités de plasmides codant pour le rapporteur et le miARN utilisés pour la transfection afin de déterminer la plage dans laquelle le degré de régulation négative du rapporteur (le rapport de répression) dépend de la concentration du miARN mais pas la concentration du journaliste.

Cultiver des cellules 293T dans un milieu de croissance complet contenant de la pénicilline/streptomycine. Un jour avant la transfection, trypsiniser les cellules 293T et les diluer à 1 × 10 5 cellules/ml dans un milieu de croissance complet dépourvu d'antibiotiques. Plaque 1 ml de cellules dans chaque puits d'une plaque de 12 puits (puits de 22 mm de diamètre) de sorte que les cellules seront 30-40% confluentes au moment de la transfection.

Pour chaque puits d'une plaque à 12 puits, diluer 1 g d'ADN plasmidique (20 ng d'un plasmide rapporteur luciférase contenant des miRE ou d'un plasmide témoin négatif dépourvu de miRE + 950 ng d'un plasmide qui code pour un miARN ou sa variante de délétion qui ne contient pas + 30 ng d'un plasmide codant ??-galactosidase) dans 100 µl de milieu à sérum réduit Opti-MEM I (Invitrogen). Diluer 2 l de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) dans 100 l de milieu Opti-MEM I et incuber 5 min à température ambiante. Combiner l'ADN dilué avec la Lipofectamine diluée 2000, mélanger doucement et incuber pendant 20 min. Ajouter goutte à goutte la totalité du volume du mélange ADN-Lipofectamine 2000 aux cellules dans un puits d'une plaque à 12 puits contenant un milieu de croissance complet. Secouez doucement le plat pour assurer une répartition uniforme.

Incuber pendant 36 à 48 h à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 incubateur avant de récolter les cellules et d'effectuer des tests de rapporteur. Changer le milieu de croissance si un temps de culture plus long est nécessaire.


Qu'est-ce qu'un croisement de toute façon, et pourquoi, en tant que généalogiste génétique, m'en soucie-t-il ?

Un croisement sur un chromosome est l'endroit où le chromosome est coupé et l'ADN de deux ancêtres différents est épissé pendant la méiose, car l'ADN de la progéniture est créé lorsque la moitié de l'ADN des deux parents se combine.

L'identification des emplacements de croisement et de l'origine de l'ADN que nous avons reçu est la première étape pour identifier l'ancêtre plus loin dans notre arbre qui nous a fourni ce segment d'ADN.

Les croisements sont plus faciles à voir qu'à conceptualiser.

Affichage des croisements

Le croisement est l'emplacement sur chaque chromosome où l'ADN orange et noir se butent l'un contre l'autre, comme une épissure ou une couture.

Dans cet exemple, en utilisant le navigateur de chromosomes Family Tree DNA, l'ADN d'un petit-enfant est comparé à l'ADN d'un grand-parent. La petite-fille a reçu exactement 50 % de l'ADN de son père, mais seulement la moyenne de 25 % de l'ADN de chacun de ses 4 grands-parents. La comparaison de l'ADN de cet enfant avec celui d'une grand-mère montre qu'elle a hérité d'environ la moitié de l'ADN de cette grand-mère, l'autre moitié appartenant au grand-père conjoint.

  • Les segments orange ci-dessus indiquent les emplacements où le petit-enfant correspond à la grand-mère.
  • Les sections noires (à l'exception des extrémités mêmes des chromosomes) montrent des emplacements où le petit-enfant ne correspond pas à la grand-mère, donc par définition, le petit-enfant doit correspondre au grand-père dans ces emplacements noirs (à l'exception des extrémités des chromosomes).
  • L'emplacement du croisement est la ligne de démarcation entre l'orange et le noir. Veuillez noter que les extrémités des chromosomes sont notoirement difficiles et incohérentes, j'ai donc tendance à ignorer ce qui semble être des croisements aux extrémités des chromosomes, à moins que je ne puisse prouver d'une manière ou d'une autre. Sur les 22 chromosomes, 16 ont au moins une pointe noire. Dans certains cas, comme le chromosome 16, vous ne pouvez pas le dire car tout le chromosome est noir.
  • Ignorez les zones grises - ces régions ne sont pas testées car elles sont pauvres en SNP.

Nous savons que le petit-enfant a tout le chromosome X de sa grand-mère, car le parent est un homme qui n'a hérité qu'un chromosome X de sa mère, c'est donc tout ce qu'il avait à donner à sa fille. Les extrémités du chromosome X sont noires, ce qui montre que la zone ne correspond pas à la mère, de sorte que cette région est instable et non signalée.

Il est également intéressant de noter que dans 6 cas, autres que le chromosome X, le chromosome entier est passé intact des chromosomes des grands-parents aux petits-enfants 4, 11, 16, 20, 21 et 22.

Vingt-six croisements se sont produits entre la mère et le fils, à 5 cM. Cela a été déterminé en comparant l'ADN de la mère au fils afin de déterminer le début et la fin réels de la région d'appariement chromosomique, ce qui me dit si les pointes noires sont ou non des croisements en comparant l'ADN du petit-enfant à celui de la grand-mère.

Avant de continuer, voyons à quoi ressemble une correspondance entre un parent et un enfant, et pourquoi.

Correspondance parent/enfant

Si vous vous demandez pourquoi j'ai montré une correspondance entre un petit-enfant et un grand-parent, ci-dessus, au lieu d'afficher une correspondance entre un enfant et un parent, le navigateur de chromosomes ci-dessous fournit la réponse.

C'est une masse orange solide pour chaque chromosome indiquant que l'enfant correspond au parent à chaque endroit.

Comment cela peut-il être si l'enfant n'hérite que de la moitié de l'ADN de ses parents ?

N'oubliez pas que le parent a deux chromosomes qui se mélangent pour donner un chromosome à l'enfant. Lorsque l'on compare l'enfant au parent, le chromosome unique de l'enfant hérité du parent correspond à l'un des deux chromosomes du parent à chaque emplacement d'adresse, de sorte qu'il s'affiche comme une correspondance complète avec le parent même si l'enfant n'est que correspondant à l'un des deux parents des emplacements chromosomiques. Ce n'est pas un bogue et c'est exactement comme cela que fonctionnent les navigateurs de chromosomes. En d'autres termes, l'"autre" chromosome que portent vos parents est celui que vous ne correspondez pas.

Le diagramme ci-dessous montre que la mère a deux copies du chromosome 1 qu'elle a héritées de son père et de sa mère et quelle section elle a donnée à son enfant.

Vous pouvez voir que le chromosome du père de la mère est bleu dans cette illustration, et le chromosome de la mère de la mère est rose. Les points de croisement chez l'enfant se situent entre les parties B et C, et entre les parties C et D. Vous pouvez clairement voir que l'enfant, comparé à la mère, correspond en fait à la mère dans tous les endroits, ou parties, 3 bleu et 1 rose, même si la source de l'ADN correspondant provient de deux parents différents.

Cet exemple montre l'enfant comparé aux deux parents, vous pouvez donc voir que l'enfant correspond en fait aux deux parents à chaque endroit.

C'est exactement pourquoi deux correspondances différentes peuvent nous correspondre au même endroit, mais peuvent ne pas se correspondre car elles proviennent de différents côtés de notre famille - l'un du côté de maman et l'autre de papa.

La seule façon de savoir de quels «côtés» ou de quels morceaux de l'ADN des parents l'enfant a hérité est de comparer avec d'autres personnes qui descendent de la même lignée que l'un des parents. Essentiellement, vous pouvez comparer l'enfant aux grands-parents pour identifier les emplacements que l'enfant a reçus de chacun des 4 grands-parents – et par soustraction génétique, quels segments n'ont PAS été hérités de chaque grand-parent également, si un grand-parent se trouve être disparu.

Dans notre illustration du diagramme rose et bleu du chromosome parental ci-dessus, l'enfant n'a PAS hérité des parties roses A, B et D, et n'a pas hérité de la partie bleue C –, mais a hérité de quelque chose du parent à chaque endroit. Ils n'ont pas non plus hérité d'une quantité égale de l'ADN rose et bleu de leurs grands-parents. S'ils ont hérité de la partie rose, alors ils n'ont pas hérité de la partie bleue, et vice versa pour cet emplacement particulier.

La vue du navigateur de chromosomes parent à enfant nous montre également que les extrémités des chromosomes ne sont pas incluses dans les rapports de correspondance, car nous savons que l'enfant DOIT correspondre au parent sur l'un de ses deux chromosomes, de bout en bout. Le téléchargement ou la vue graphique nous fournit les emplacements exacts.

Cela nous amène à la question de savoir si les croisements se produisent également entre les garçons et les filles. Nous savons déjà que le chromosome X a un modèle d'héritage distinctif, ce qui signifie que les hommes n'héritent que d'un X de leur mère. Un père et son fils ne correspondront JAMAIS sur le chromosome X. Vous pouvez en savoir plus sur les modèles d'héritage du chromosome X dans l'article, X Marks the Spot.

Les croisements diffèrent entre les hommes et les femmes

Dans l'article Analyse génétique de la variation de la recombinaison méiotique humaine de Chowdhury et al, nous apprenons que les hommes et les femmes subissent un nombre moyen différent de croisements.

Les auteurs disent ce qui suit :

Le nombre d'événements de recombinaison par méiose varie considérablement d'un individu à l'autre. Ce phénotype de recombinaison diffère entre les femmes et les hommes, ainsi qu'entre les individus de chaque sexe.

Notamment, nous avons trouvé différentes variantes de séquence associées aux phénotypes de recombinaison femelle et mâle, suggérant qu'elles sont régulées par différents gènes.

La recombinaison méiotique est essentielle à la formation des gamètes humains et est un processus clé qui génère la diversité génétique. Compte tenu de son importance, nous nous attendrions à ce que le nombre et l'emplacement des échanges soient strictement réglementés. Cependant, des études montrent une variation significative entre les sexes et entre les individus dans les taux de recombinaison à l'échelle du génome. La base génétique de cette variation est mal comprise.

L'article de Chowdhury fournit les graphiques suivants. Ces graphiques montrent le nombre moyen de recombinaisons, ou croisements, par méiose pour chacune des deux études différentes, l'AGRE et l'étude FHS, discutées dans le document.

L'essentiel de cet article, pour les généalogistes génétiques, est que les hommes en moyenne environ 27 croisements par enfant et les femmes en moyenne environ 42, les familles de l'étude AGRE rapportant 41,1 et les familles de l'étude FHS rapportant 42,8.

J'ai collaboré avec le statisticien Philip Gammon, et il souligne ce qui suit :

Homme, 22 chromosomes plus la moyenne de 27 croisements = une moyenne de 49 segments de l'ADN de ses parents qu'il transmettra à ses enfants. Environ la moitié proviendra de chacun de ses parents. Pas exactement la moitié. S'il y a un nombre impair de croisements sur un chromosome, il contiendra un nombre pair de segments et la moitié proviendra de chaque parent. Mais s'il y a un nombre pair de croisements (0, 2, 4, 6 etc.) il y aura un nombre impair de segments sur le chromosome, un plus d'un parent que l'autre.

La taille moyenne des segments sera d'environ :

  • Mâles, 22 + 27 = 49 segments à une taille moyenne de 3400 / 49 = 69 cM
  • Femelles, 22 + 42 = 64 segments à une taille moyenne de 3400 / 64 = 53 cM

Cela signifie que cumulativement, au fil du temps, dans une lignée entièrement féminine par rapport à une lignée entièrement masculine, vous verrez de plus gros morceaux d'ADN préservés (et perdus) chez les hommes par rapport aux femmes, car l'ADN se divise moins de fois. De plus gros morceaux d'ADN signifient une meilleure correspondance avec plus de générations dans le temps. Lorsque les hommes ont un match, il est probable qu'il s'agisse d'un segment plus large.

L'article, First Cousin Match Simulations, en parle également.

Pratiquement parlant

Qu'est-ce que cela signifie concrètement pour les généalogistes génétiques ?

Peu de lignées descendent en fait de tous les mâles ou de toutes les femelles. La plupart de nos liens avec des ancêtres lointains se font par des mélanges d'ancêtres masculins et féminins, donc cette variation des taux de croisement ne nous affecte vraiment pas beaucoup - du moins pas en moyenne.

Il est difficile de discerner pourquoi nous correspondons à certains cousins ​​et nous ne correspondons pas à d'autres. Dans certains cas, plutôt que la recombinaison aléatoire étant un facteur, le taux de croisement réel peut être en jeu. Cependant, puisque nous savons seulement qui nous correspondons, et non qui a testé et nous ne correspondons pas, il est même difficile de spéculer sur la façon dont la recombinaison a affecté ou affecte nos correspondances. Et honnêtement, pour l'application de la généalogie génétique, nous ne nous soucions vraiment pas - nous nous soucions (généralement) seulement de qui nous correspondons - à moins que nous ne correspondions à personne (ou à un cousin germain ou plus proche) dans une lignée particulière, en particulier un ligne relativement proche - et c'est un cheval d'une couleur entièrement différente.

Pour moi, la question brûlante à laquelle il faut répondre, qui n'a toujours pas été élucidée, est de savoir pourquoi une différence de taux de recombinaison existe entre les hommes et les femmes. Quels processus sont en jeu ici que nous ne comprenons pas ? Qu'est-ce que ce phénomène encore incompris pourrait affecter d'autre ?

Jusqu'à ce que nous trouvions ces choses, je note si mon jumelage s'est produit principalement avec des hommes ou des femmes, et j'ajoute simplement ces informations aux autres données que j'utilise pour déterminer la qualité du jumelage et la distance possible. En d'autres termes, les informations qui m'informent sur la probabilité qu'une correspondance soit proche et raisonnable comprennent les informations suivantes :

  • Quantité totale d'ADN partagé
  • La plus grande taille de segment
  • Nombre de segments correspondants
  • Nombre de SNP dans le segment correspondant
  • Matchs partagés
  • Chromosome X
  • Correspondance ADNmt ou ADN Y
  • Arbres – présence, absence, précision, profondeur et exhaustivité
  • Individus principalement masculins ou féminins en voie d'ancêtre commun
  • Qui d'autre ils correspondent, en particulier des parents proches connus
  • La triangulation se produit-elle

Il serait très intéressant de voir comment les instances de correspondances à un certain niveau de cousin spécifique - disons les cousins ​​​​3rds (par exemple), se comportent différemment en termes de quantité moyenne d'ADN partagé, de la plus grande taille de segment et du nombre de segments chez les personnes descendantes de lignées entièrement féminines et entièrement masculines. Blaine Bettinger, tu écoutes ? Ce serait une merveilleuse étude pour le projet Shared cM qui mesure les données réelles.

La science de la génétique n'est-elle pas absolument fascinante ?

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Voir la vidéo: Comment ça marche? LADN et la génomique (Novembre 2022).