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Le pH affecte-t-il la constante de Michaelis ?

Le pH affecte-t-il la constante de Michaelis ?


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J'ai essayé de confirmer le Km d'un substrat (qui est de 34 +/- 4 mM). Cette valeur a été obtenue dans 50 mM de MOPS, pH 6,3. J'ai effectué mon dosage de cinétique dans un tampon de pH 7 et obtenu une valeur Km dans le 21,5. Selon cet article, Fig. 2C, l'activité spécifique normalisée de l'enzyme est d'environ 70 % à pH 6,3 et d'environ 47 % à pH 7. Si je divise 34 mM à pH 6,3 par 0,7 (ce qui devrait me donner le Km optimal à le pH optimal de 5,5) puis multiplier par 0,48, j'obtiens alors 23 mM. Cependant, l'article dit que Km est compris entre 30 et 38 mM, donc si je divise 30 et 38 séparément par 0,7 et multiplie par 0,47, j'obtiens respectivement 20 et 25,6 mM. Parce que ma valeur se situe dans cette plage, cela doit alors signifier que j'ai la bonne enzyme et le même résultat que le papier.

Alors mes questions sont :

  1. Lorsque le papier dit que Km est "34 +/- 4 mM", puis-je supposer que cela signifie que le Km peut être n'importe où entre 30 et 38 mM ? Je suis surpris de voir à quel point la gamme est large. J'ai supposé que Km n'était généralement qu'une valeur avec un écart d'au plus 0,1.

  2. Le pH change-t-il les valeurs Km ? Je comprends que le pH modifie la ou les formes de l'enzyme et/ou du substrat. Par conséquent, cela doit affecter à quel point il veut se lier au substrat. Si le désir de l'enzyme de se lier à un substrat diminue en raison de l'augmentation du pH, par exemple, cela signifierait que plus de substrats sont nécessaires pour entourer l'enzyme, augmentant ainsi Km.

  3. Si le pH change Km, est-ce ainsi que je détermine la valeur Km d'une valeur pH différente si la valeur Km à un autre pH est déjà connue ? Je sais que l'activité spécifique et la constante de Michaelis sont différentes, mais la quantité de produit pouvant être convertie par minute dépend de la façon dont l'enzyme aime se lier à un substrat, ce qui est représenté par la constante de Michaelis. Mon raisonnement et mes calculs sont-ils arrivés à la bonne conclusion ? Si non, comment se fait le calcul ?


D'après la dérivation de la cinétique de Michaelis-Menten, vous pouvez voir que :

$$K_m=frac{k_f + k_{cat}}{k_r}$$

Où $k_f$ et $k_r$ sont des constantes de taux de liaison et de déliaison (pour la liaison Enzyme-Substrat), respectivement, et $k_{cat}$ est le chiffre d'affaires. C'est pour l'approximation quasi-stationnaire (QSSA). Pour l'approximation d'équilibre :

$$K_m=frac{k_f}{k_r}$$ qui est identique à la constante d'association.

Dans les deux cas, le pH peut affecter le taux de liaison et de déliaison en affectant l'affinité entre l'enzyme et le substrat. Par exemple, supposons que le site de liaison au substrat est chargé négativement. Un pH bas augmenterait le potentiel électrostatique du site de liaison au substrat vers zéro en affectant l'ionisation des groupes fonctionnels.

Le pH peut également avoir des effets indirects sur le site de liaison au substrat car il peut modifier la structure globale de la protéine.

De nombreuses réactions catalysées par des enzymes impliquent une catalyse acide-base, c'est-à-dire qu'il y a un transfert de proton. Dans de telles réactions, le pH peut affecter $k_{cat}$.

Si le pH change Km, est-ce ainsi que je détermine la valeur Km d'une valeur pH différente si la valeur Km à un autre pH est déjà connue ?

Vous pouvez le faire en créant un graphique Lineweaver-Burk pour le pH modifié.


Voir la vidéo: Michaelis-Menten Kinetics: Considerations u0026 Time Relation Biochemistry. Lecturio (Novembre 2022).